本發(fā)明屬于畜牧業(yè)動(dòng)物醫(yī)學(xué)技術(shù)研究領(lǐng)域，涉及基于TaqMan水解探針熒光RT-PCR檢測(cè)豬NLRP12的核苷酸序列和方法，適用于豬組織樣本，包括胃、小腸、大腸等消化道組織以及肝臟、脾臟、淋巴結(jié)、肺臟等組織器官中NLRP12的準(zhǔn)確檢測(cè)，更具體的說(shuō)是用于豬組織器官中NLRP12mRNA的表達(dá)分析、炎癥反應(yīng)機(jī)制研究和腸道屏障功能研究等方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

NOD-樣受體（NOD-like receptors，NLRs）是先天性免疫中的一大類病原模式識(shí)別受體。機(jī)體依靠NLRs識(shí)別病原感染的信號(hào)，啟動(dòng)免疫應(yīng)答，發(fā)揮抵抗病原微生物感染的作用。NLRP12是NLRs家族的一個(gè)成員，廣泛存在于消化道組織、免疫器官組織以及免疫細(xì)胞中，參與病原識(shí)別和炎性體組成。炎性體活化后激活胱冬肽酶（caspase-1），調(diào)控白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）家族中促炎性細(xì)胞因子IL-1b、IL-18和IL-33的生成，參與調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)和腸道黏膜屏障功能。

促炎性細(xì)胞因子的釋放，能夠促進(jìn)局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕或加重組織炎性損傷狀態(tài)。適度炎癥反應(yīng)有助于消除內(nèi)外源致病因素，使機(jī)體內(nèi)環(huán)境處于穩(wěn)態(tài)；慢性、失調(diào)的炎癥反應(yīng)則持續(xù)地?fù)p傷細(xì)胞和組織，促使組織器官異常重構(gòu)，最終導(dǎo)致器官功能衰竭甚至喪失。因此，研究不同病原體引起炎癥的機(jī)制，有利于控制炎癥的發(fā)生以及炎癥的進(jìn)程，使炎癥反應(yīng)朝向?qū)C(jī)體有益的方向發(fā)展，促進(jìn)機(jī)體順利恢復(fù)到健康的狀態(tài)和水平。

NLRP12是近兩年來(lái)研究較多的一種病原識(shí)別受體，主要集中在模型動(dòng)物小鼠的研究上，在人上的研究也僅有少量報(bào)道，但是在豬上的研究還未見(jiàn)報(bào)道。很多動(dòng)物病原體感染豬后，都會(huì)引起炎癥反應(yīng)，但不同的感染類型其引起炎癥反應(yīng)的機(jī)制也各不相同。中國(guó)是養(yǎng)豬大國(guó)，豬的健康養(yǎng)殖關(guān)系和影響著食品安全問(wèn)題。因此，研究研究豬疫病炎癥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制，控制炎癥反應(yīng)的進(jìn)程，使豬只早日恢復(fù)健康，就顯得非常重要。一方面，可以減少藥物尤其是抗生素類藥物的使用量，保證豬肉食品的安全，另一方面，還可以降低養(yǎng)殖成本，提高養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

在本研究中，我們采用TaqMan熒光RT-PCR方法建立了檢測(cè)豬NLRP12的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)反應(yīng)的各種條件進(jìn)行了優(yōu)化，其中包括引物探針的篩選、Mg2+使用濃度的優(yōu)化、引物及探針使用濃度的優(yōu)化。建立了靈敏、特異，能夠用于檢測(cè)豬NLRP12 mRNA表達(dá)的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一組特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè)豬NLRP12的核苷酸序列，包括引物序列和基于MGB修飾的短探針序列。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供快速、準(zhǔn)確、使用方便的基于MGB修飾的檢測(cè)豬NLRP12 mRNA表達(dá)的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開(kāi)了如下的技術(shù)方案：

一組檢測(cè)豬NLRP12的核苷酸序列，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.3所示，其中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2分別為檢測(cè)豬NLRP12的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO.3為檢測(cè)豬NLRP12的熒光探針。

本發(fā)明所所述探針序列SEQ ID NO.3的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)MGB。

本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了采用檢測(cè)豬NLRP12的核苷酸序列進(jìn)行檢測(cè)的方法，其特征在于，由以下組分作為檢測(cè)NLRP12所用的必備材料：

1）裂解液；

2）RT反應(yīng)液，包括：5′RT緩沖液、25 mM MgCl₂、2.5 mM dNTPs（each）、200 mM隨機(jī)引物、40 U/mL RNase抑制劑、200 U/mL反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV；

3）qPCR反應(yīng)液，包括：10′PCR緩沖液、25 mM MgCl₂、2.5 mM dNTPs（each）、2.5 U/mL Taq DNA聚合酶、20 mM正義引物、20 mM反義引物、20 mM熒光探針；

4）DEPC水：用自來(lái)水三次蒸餾獲取三蒸水，在三蒸水中加入DEPC至終濃度為0.1%，37°C攪拌處理12 h，121°C高壓蒸汽滅菌15 min；

5）豬NLRP12標(biāo)準(zhǔn)品：為體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段，豬NLRP12標(biāo)準(zhǔn)品的序列為序列表SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；

其中，正義引物為序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，其中5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)MGB。

所述RT反應(yīng)液中各成分的使用濃度為1′RT緩沖液、2.5 mM MgCl₂、0.25 mM dNTPs、20 mM隨機(jī)引物、1 U/mL的RNase抑制劑、5 U/mL的反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV；所述qPCR反應(yīng)液中各成分的使用濃度為1′PCR緩沖液、3.5 mM MgCl₂、0.2 mMdNTPs、0.05 U/mLTaq DNA聚合酶、0.2 mM正義引物、0.2 mM反義引物、0.1 mM熒光探針；

本發(fā)明更進(jìn)一步公開(kāi)了采用檢測(cè)豬NLRP12的核苷酸序列檢測(cè)豬NLRP12的方法在豬組織器官中NLRP12 mRNA表達(dá)方面的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：本發(fā)明建立的熒光qPCR檢測(cè)方法可以對(duì)病毒RNA進(jìn)行相對(duì)定量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-4.67X+38.51（X代表Ct值，Y代表NLRP12的相對(duì)含量），可知Ct值越小，NLRP12的表達(dá)量相對(duì)越高。發(fā)病豬不同組織中NLRP12的表達(dá)均高于正常豬不同組織中NLRP12的表達(dá)，并且以發(fā)病豬淋巴結(jié)中NLRP12的表達(dá)量為最高。

本發(fā)明更加詳細(xì)的描述如下：

選擇豬NLRP12基因的特定序列作為靶區(qū)域，在多重序列比對(duì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)。引物長(zhǎng)度為21個(gè)堿基左右，引物內(nèi)無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)性，引物間和引物內(nèi)無(wú)互補(bǔ)序列，引物的熔解溫度（Tm值）在60°C左右，引物間的Tm值相差小于2°C。探針的長(zhǎng)度為16個(gè)堿基。

一組檢測(cè)豬NLRP12的核苷酸序列，如下：

1）5?-CACAAGGTGATGCTGGATTGG-3?（SEQ ID NO.1）

2）5?-CCCGGCAGTTGATGTAGAAGAC-3?（SEQ ID NO.2）

3）5?-[FAM]-ACGGGAAGCTCTTCCA-[MGB]-3?（SEQ ID NO.3）

其中序列1）和2）分別為檢測(cè)豬NLRP12基因的正義引物和反義引物，序列3）為檢測(cè)豬NLRP12基因的MGB修飾的熒光短探針，探針的5?端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM（6-carboxy-熒光素），3?端標(biāo)記淬滅基團(tuán)MGB。

我們采用TaqMan熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)建立了檢測(cè)豬NLRP12的檢測(cè)方法，對(duì)反應(yīng)的各種條件進(jìn)行了優(yōu)化，其中包括引物探針的篩選、Mg2+使用濃度的優(yōu)化、引物及探針使用濃度的優(yōu)化，得到以下檢測(cè)方法。

本發(fā)明提供的一種檢測(cè)豬NLRP12的方法，由以下內(nèi)容組成：

1）RNA提取試劑盒：購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

2）RT反應(yīng)液，表1為RT反應(yīng)液配方：

表1 RT反應(yīng)液配方

反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（200 U/mL）、5′RT緩沖液、隨機(jī)引物（200 mM）、RNase抑制劑（40 U/mL）購(gòu)自大連寶生物生物工程有限公司；dNTPs（2.5 mM each）、MgCl₂（25 mM）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

3）qPCR反應(yīng)液，表2為qPCR反應(yīng)液配方：

表2 qPCR反應(yīng)液配方

Taq DNA聚合酶（2.5 U/mL）、10′PCR緩沖液、dNTPs（2.5 mM each）、MgCl₂（25 mM）自天根生化科技（北京）有限公司，引物和探針均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

4）DEPC水，用自來(lái)水三次蒸餾獲取三蒸水，在三蒸水中加入DEPC至終濃度為0.1%，37°C攪拌處理12 h，121°C高壓蒸汽滅菌15 min。

5）豬NLRP12標(biāo)準(zhǔn)品：為體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段。將RT-PCR擴(kuò)增獲得的NLRP12長(zhǎng)度為240 bp編碼序列克隆于pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR和酶切鑒定后獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為pGEM-NLRP12。以純化的質(zhì)粒為模板，酶切線性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DNase除去其中的DNA模板后經(jīng)Trizol提取后進(jìn)行測(cè)定，即得到制備豬NLRP12標(biāo)準(zhǔn)品所需的RNA標(biāo)準(zhǔn)品母液。

6）豬NLRP12標(biāo)準(zhǔn)品的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

7）對(duì)合成的引物和探針做HPLC分析，如得到單吸收峰圖譜、而且用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之間，即視為合格引物。

將篩選好的引物濃度從0.1 mM至0.8 mM以0.1 mM為間距遞增，探針濃度從0.025 mM至0.2mM以0.025 mM為間距遞增。對(duì)引物和探針不同濃度的配比進(jìn)行了比較，從多次重復(fù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：采用表2所列引物濃度和探針濃度時(shí)熒光增幅相對(duì)較高。

7）RT反應(yīng)條件：30°C 10 min，42°C 1 h，99°C 5 min，16°C 1 min。

8）qPCR反應(yīng)條件：95°C 4 min；95°C 10 sec，61°C 15 sec，72°C 15 sec，40個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)退火延伸時(shí)收集熒光。

研究表明，Mg2+濃度對(duì)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果有影響，故應(yīng)用篩選好的引物探針，將Mg2+的濃度從0.5 mM至5.0 mM以0.5 mM為間距遞增，對(duì)不同Mg2+濃度條件下的擴(kuò)增進(jìn)行了比較。優(yōu)化后的Mg2+濃度見(jiàn)表1。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明選擇豬NLRP12基因保守序列，設(shè)計(jì)引物和MGB探針，建立并優(yōu)化了檢測(cè)組NLRP12的熒光RT-PCR檢測(cè)方法，該法特異性好，靈敏度高，能夠快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)豬組織器官樣本中NLRP12，在研究NLRP12炎性體時(shí)能夠?qū)LRP12進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，及時(shí)了解和掌握炎癥的發(fā)生過(guò)程和發(fā)展進(jìn)程，以及采用抗炎藥物干預(yù)炎癥反應(yīng)的效果，具有重要的理論意義和實(shí)踐意義。

附圖說(shuō)明

圖1豬不同組織中NLRP12 mRNA相對(duì)定量試驗(yàn)和線性回歸結(jié)果；

圖2 NLRP12熒光PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書(shū)所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所用原料及試劑均有市售。

實(shí)施例1 豬不同組織中NLRP12 mRNA相對(duì)定量試驗(yàn)

（1）豬組織樣品處理：用無(wú)菌的剪刀和鑷子剪去待檢組織樣品約1.0 g于研缽中充分研磨,再加入5 mL PBS混勻，然后將組織懸液轉(zhuǎn)入無(wú)菌Eppendorf管中，編號(hào)備用。

（2）RNA的提?。河肦NA提取試劑盒提取不同組織的RNA，按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取的RNA冰上保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA：從冰箱中取出M-MLV（200 U/mL）、5′RT緩沖液、隨機(jī)引物（200 mM）、RNase抑制劑（40 U/mL）、dNTPs（2.5 mM each）、MgCl₂（25 mM），在室溫下融化后，2 000 rpm離心10 sec。設(shè)所需PCR管數(shù)為n（n=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照），每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系需要10 mL RT反應(yīng)液，其中含有4 mL 5′RT緩沖液，2mLMgCl₂（25 mM），2 mL dNTPs（2.5 mM each），1 mL隨機(jī)引物（200 mM），0.5mLRNase抑制劑（40 U/mL），0.5mL反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（200 U/mL）。計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積試管中，充分混合均勻，向每個(gè)PCR管中各分裝10 mL。在各設(shè)定的普通PCR管中分別加入制備的RNA溶液各10 mL，蓋緊管蓋，于1000 rpm離心10 sec。將PCR管排好放入普通PCR儀內(nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：30°C 10 min，42°C 1 h，99°C 5 min，16°C 1 min。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，取出cDNA冰上保存?zhèn)溆谩?/p>

（4）qPCR反應(yīng)：從冰箱中取出Taq DNA聚合酶（2.5 U/mL）、10′PCR緩沖液、正義引物（20 mM）、反義引物（20 mM）、MGB探針（20 mM）、dNTPs（2.5 mM each）、MgCl₂（25 mM），在室溫下融化后，2 000 rpm離心10 sec。設(shè)所需PCR管數(shù)為n（n=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+10管陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品），每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系需要15mL qPCR反應(yīng)液，其中含有2 mL 10′PCR緩沖液、2.8mL MgCl₂（25 mM），1.6 mL dNTPs（2.5 mM each），0.4 mLTaq DNA聚合酶（2.5 U/mL），0.2 mL正義引物（20 mM），0.2 mL反義引物（20 mM），0.1 mL MGB探針（20 mM），7.7mL DEPC水。計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積試管中，充分混合均勻，向每個(gè)qPCR管中各分裝15mL。在各設(shè)定的qPCR管中分別加入制備的cDNA各5mL，蓋緊管蓋，于1000 rpm離心10 sec。將qPCR管排好放入熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：95°C 4 min；95°C 10 sec，61°C 15 sec，72°C 15 sec，40個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)退火延伸時(shí)收集熒光。

（5）結(jié)果的判定：結(jié)果分析條件設(shè)定，讀取檢測(cè)結(jié)果。閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，陰性對(duì)照無(wú)Ct值并且無(wú)擴(kuò)增曲線。陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)￡35.0，并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線。如陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照條件不滿足以上條件，此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

（6）豬不同組織中NLRP12 mRNA相對(duì)定量統(tǒng)計(jì)分析：對(duì)3頭健康豬和3頭致病性大腸桿菌感染豬不同的組織臟器qPCR的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 NLRP12 qPCR檢測(cè)同一頭豬不同組織臟器的結(jié)果統(tǒng)計(jì)

我們建立的熒光qPCR檢測(cè)方法可以對(duì)病毒RNA進(jìn)行相對(duì)定量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-4.67X+38.51（X代表Ct值，Y代表NLRP12的相對(duì)含量），可知Ct值越小，NLRP12的表達(dá)量相對(duì)越高。從表3可以看出，發(fā)病豬不同組織中NLRP12的表達(dá)均高于正常豬不同組織中NLRP12的表達(dá)，并且以發(fā)病豬淋巴結(jié)中NLRP12的表達(dá)量為最高。

實(shí)施例2

檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)

用實(shí)施例1中所述方法對(duì)豬腸組織及環(huán)境中常見(jiàn)的幾種病原體（包括大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌和豬繁殖與呼吸綜合征病毒）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明所建立的方法與病原體均無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好（圖2）。

<110> 天津市畜牧獸醫(yī)研究所

<120> 一種檢測(cè)豬NLRP12的核苷酸序列及應(yīng)用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacaaggtga tgctggattg g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccggcagtt gatgtagaag ac 22

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acgggaagct cttccagg 18

<210> 4

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgctggccc acaaggtgat gctggattgg gccgacggga agctcttcca ggacaggttt 60

gattatgtct tctacatcaa ctgccgggag atgaaccaga gcaccgtgga gcggagcgca 120

cgagacctca tctccagttg ctggcccgag cccagcgtgc ccctccagga gctcgtccgg 180

gcccccgagc gcctcctctt tatcatcgac ggctttgacg aactcaaacc ctctttccac 240