本發(fā)明涉及蛋白提取領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種鹿茸活性蛋白提取物、制備方法及用途以及中藥制劑。

背景技術(shù)：

鹿茸為我國傳統(tǒng)名貴中藥，已有2000多年的入藥歷史。鹿茸性溫而不燥，具有壯腎陽、益精血等功效，并能夠有效治療陽痿滑精、宮冷不孕、陰疽不斂等疾??；同時，鹿茸還能夠用于振奮和提高機體功能，對全身虛弱、久病之后患者，有較好的強身作用。

鹿茸作為鹿體最活躍的生長點，每年周期性地生長、骨化與脫落，在骨化之前貯存了大量調(diào)節(jié)生長的生長因子及相關(guān)蛋白。研究表明鹿茸中含有脂類、多糖、多胺、蛋白質(zhì)及多肽、激素樣物質(zhì)、生物堿等多種化學(xué)成分。鹿茸中蛋白質(zhì)、多肽類物質(zhì)占其總重量的50％以上，而這也是鹿茸具有廣泛生物活性的基礎(chǔ)。

如何將鹿茸中的活性成分進行有效提取，一直也就成為了人們研發(fā)的熱點。例如，霍玉書等(鹿茸生長因子制劑及工藝，CN1104095A)就開發(fā)了一種鹿茸中生長因子制劑的生產(chǎn)工藝，該工藝方法是將鹿茸粉碎浸提，浸提液經(jīng)過濾除菌，再經(jīng)層析分離出含有神經(jīng)生長因子、上皮細(xì)胞生長因子等多肽的制劑，該制劑具有安全性，無副作用，無異種蛋白抗原反應(yīng)。

然而，在現(xiàn)有技術(shù)中，對于如何提取鹿茸中的大分子蛋白、以及對鹿茸中大分子蛋白質(zhì)的功效研究卻鮮有報道。

鹿茸的提取工藝對鹿茸中生理活性成分的保留有很大的影響。雖然對鹿茸的研究歷史悠久，但傳統(tǒng)的加工技術(shù)是以反復(fù)水煮、烘烤和風(fēng)干為主，這種方法對活性物質(zhì)的提取率低，并且在提取過程中也會破壞鹿茸中蛋白質(zhì)等活性成分，而這也大大影響了鹿茸的功效。因此，如何更好地將鹿茸中活性蛋白成分保留并提取，也就成為了現(xiàn)階段人們研發(fā)重點所在。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種鹿茸活性蛋白提取物的制備方法，本發(fā)明方法中，通過在提取過程中采用接近生理pH和生理滲透壓的緩沖溶液作為提取劑，并在提取過程中保持低溫環(huán)境，同時使用真空冷凍干燥制備鹿茸蛋白提取物，從而在整個制備工藝最大限度地保持了鹿茸蛋白的生物活性，并實現(xiàn)了鹿茸蛋白的有效提取，進而解決了現(xiàn)有技術(shù)中無法實現(xiàn)活性鹿茸蛋白提取的技術(shù)問題。本發(fā)明方法具有操作簡便，提取效率高等優(yōu)點。

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種鹿茸活性蛋白提取物，本發(fā)明中，通過使用本發(fā)明方法提取鹿茸活性蛋白，因而所得到的鹿茸活性蛋白的生物活性高，保健效果好。

本發(fā)明的第三個目的在于提供一種所述鹿茸活性蛋白提取物的用途，本發(fā)明鹿茸蛋白提取物由本發(fā)明方法提取得到，并具有很高的生物活性，并對子宮重量和內(nèi)膜具有明顯的增重和保護作用。

本發(fā)明的第四個目的在于提供一種中藥制劑，所述制劑包含本發(fā)明所述鹿茸活性蛋白提取物。本發(fā)明中藥制劑中，通過使用采用本發(fā)明提取的高活性鹿茸蛋白作為原料，從而可以使得本發(fā)明中藥制劑具有良好的保健作用，并能夠?qū)ψ訉m重量和內(nèi)膜具有明顯的增重和保護作用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種鹿茸活性蛋白提取物的制備方法，所述方法包括如下步驟：將新鮮鹿茸抽除血液后，凍干、粉碎，并得到鹿茸粉；將所得到的鹿茸粉與緩沖溶液混合后，進行超聲處理，并離心，然后收集離心后所得上清液，并對所得上清液進行真空冷凍干燥，即得到產(chǎn)物鹿茸蛋白提取物；其中，所述緩沖溶液的pH值為7.0～8.0，緩沖溶液的濃度為10～50mM。

本發(fā)明中，通過在提取過程中采用接近生理pH和生理滲透壓的緩沖溶液作為提取劑，并在提取過程中保持低溫環(huán)境，同時使用真空冷凍干燥制備鹿茸蛋白提取物，從而在整個制備工藝最大限度地保持了鹿茸蛋白的生物活性，并能夠?qū)崿F(xiàn)高效提取。本發(fā)明具有提取工藝簡單，提取效率高，并能夠?qū)β谷字谢钚猿煞殖浞直４娌⑻崛±玫葍?yōu)點。

可選的，本發(fā)明中，所述鹿茸為梅花鹿鹿茸。

可選的，本發(fā)明中，所述鹿茸為毛桃、鞍子、二杠、掛角、三岔、花砍茸或蓮花中的一種鹿茸或多種鹿茸的混合物；優(yōu)選地，本發(fā)明中，所述鹿茸為毛桃、二杠或三岔中的一種鹿茸或多種鹿茸的混合物；更優(yōu)選地，本發(fā)明中，所述鹿茸為毛桃鹿茸。

本發(fā)明中，通過對所用原料鹿茸的選擇和調(diào)整，從而進一步提高了鹿茸中大分子蛋白的提取比例，并能夠提高提取的效率。

本發(fā)明中，所述毛桃鹿茸為梅花鹿初生茸，頂端圓鈍，表面稀疏或密生多數(shù)長茸毛，其形似“毛桃”。

可選的，本發(fā)明中，所述緩沖溶液為Tris－base緩沖溶液、PBS緩沖溶液或Tris－HCl緩沖溶液，所述緩沖溶液的pH值為7.4；優(yōu)選的，本發(fā)明中，所述緩沖溶液為優(yōu)選地，緩沖溶液為Tris－base溶液或PBS緩沖溶液。

本發(fā)明中，通過對具體所用緩沖溶液及所用緩沖溶液pH的調(diào)整和優(yōu)化，從而進一步優(yōu)化了鹿茸活性蛋白的提取環(huán)境，并提高了提取效率。

本發(fā)明中，所述Tris－HCl緩沖溶液為三(羥甲基)氨基甲烷－HCl緩沖溶液；所述Tris－base緩沖溶液為三(羥甲基)氨基甲烷緩沖溶液；所述PBS緩沖溶液為磷酸緩沖鹽溶液。

可選的，本發(fā)明中，所述鹿茸粉的質(zhì)量克數(shù)與緩沖溶液的體積毫升數(shù)之比為1：(5～100)；優(yōu)選的，本發(fā)明中，鹿茸粉的質(zhì)量克數(shù)與緩沖溶液的體積毫升數(shù)之比為1：(10～20)。

本發(fā)明中，通過對所用原料鹿茸粉與緩沖溶液比例的調(diào)整和優(yōu)化，從而可以在對鹿茸中活性大分子蛋白充分提取的同時，還不會浪費過多的緩沖溶液，從而進一步降低提取成本。

可選的，本發(fā)明中，所述超聲處理的溫度為－5℃～10℃，超聲處理的時間為10～60min；優(yōu)選的，本發(fā)明中，所述超聲處理的溫度為0℃～4℃，超聲處理的時間為30－45min。

本發(fā)明中，通過對超聲處理時間以及溫度的進一步調(diào)整和優(yōu)化，從而在保證對原料鹿茸粉充分超聲處理的同時，還不會由于處理時間過長所導(dǎo)致的處理效率降低。

可選的，本發(fā)明中，所述超聲處理的程序為：超聲5～10s后，間隔15～40s，并交替進行；優(yōu)選的，本發(fā)明中，所述超聲處理的程序為超聲5～8s，間隔15－20s，并交替進行。

本發(fā)明中，通過對超聲具體步驟條件的選擇調(diào)整和優(yōu)化，從而進一步提高了提取的效率。

同時，本發(fā)明還提供了一種鹿茸活性蛋白提取物，所述提取物是由本發(fā)明所述方法提取得到的。

本發(fā)明中，通過使用本發(fā)明方法提取鹿茸活性蛋白，因而所得到的鹿茸活性蛋白的生物活性高，保健效果好。

同樣的，本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述鹿茸蛋白提取物在制備促進子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長或保護子宮藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的鹿茸蛋白提取物的生物活性高，對子宮重量和內(nèi)膜具有明顯的增重和保護作用。

進一步的，本發(fā)明還提供了一種中藥制劑，所述中藥制劑包括本發(fā)明所述鹿茸蛋白提取物。

本發(fā)明中藥制劑中，通過使用采用本發(fā)明提取的高活性鹿茸蛋白作為原料，從而可以使得本發(fā)明中藥制劑具有良好的保健作用，并能夠?qū)ψ訉m重量和內(nèi)膜具有明顯的增重和保護作用。同時，本發(fā)明中藥制劑還能夠提高機體免疫功能、防治骨質(zhì)疏松、降低心腦血管的突發(fā)性死亡率，是一種對女性生殖和保健安全而有效的中藥制劑。

可選的，本發(fā)明中，所述中藥制劑的劑型為粉劑、片劑、貼劑、乳膏劑或注射劑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明提取方法中，通過對提取步驟的選擇和調(diào)整，從而能夠最大限度地保持了鹿茸蛋白的生物活性，從而提取得到具有高生物活性的鹿茸蛋白；

(2)本發(fā)明方法中，通過對具體操作步驟以及操作條件的進一步優(yōu)化，從而進一步提高了提取效率；

(3)本發(fā)明中，通過使用采用本發(fā)明提取的高活性鹿茸蛋白作為原料，從而可以使得本發(fā)明中藥制劑具有良好的保健作用，并能夠?qū)ψ訉m重量和內(nèi)膜具有明顯的增重和保護作用。

附圖說明

圖1為鹿茸蛋白提取物的SDS－PAGE分析結(jié)果圖；

圖2為小鼠卵巢切除后子宮/體重(mg/g)圖表；

圖3為小鼠卵巢切除后子宮HE染色圖；

圖4為LIF對照結(jié)果圖；

圖5為灰度值對比圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1

1)取適量毛桃鹿茸，抽血6小時后，去除表面毛發(fā)，切成薄片，放入冷凍干燥機中冷凍，至兩次稱量質(zhì)量變化小于0.1g后取出。將凍干后的鹿茸放入適量液氮中，研缽研碎，過200目篩，得到鹿茸粉；

2)稱取1g步驟1)所制得的鹿茸粉，并加入10mL濃度為50mM的Tris－base溶液，pH值為7.4。震蕩30分鐘后，在冰浴下用勻漿機勻漿1min；

3)在冰浴(0～4℃)條件下，使用超聲細(xì)胞粉碎儀對步驟2)中勻漿后的混合溶液進行超聲提取，具體超聲處理條件為：超聲5秒，間隔15秒，并交替進行。然后，在超聲處理30min后，在4℃，并且離心機的轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下，對超聲后的混合溶液進行離心處理，并離心15分鐘，所得上清液即為鹿茸蛋白提取液，將鹿茸蛋白提取液在溫度設(shè)置為－50℃的真空冷凍干燥機冷凍干燥30小時，即得到實施例1的鹿茸蛋白提取物。

進一步的，將實施例1的鹿茸蛋白提取物與輔料混合、制粒后，即得到實施例1的中藥片劑。

實施例2

1)取適量二杠鹿茸，抽血6小時后，去除表面毛發(fā)，切成薄片，放入冷凍干燥機中冷凍，至兩次稱量質(zhì)量變化小于0.1g后取出。將凍干后的鹿茸放入適量液氮中，研缽研碎，過200目篩，得到鹿茸粉末。

2)稱取1g步驟1)所制得的鹿茸粉，并加入10mL濃度為50mM的Tris－base溶液，pH值為7.4。震蕩30分鐘后，在冰浴下用勻漿機勻漿1min；

3)在冰浴(0～4℃)條件下，使用超聲細(xì)胞粉碎儀對步驟2)中勻漿后的混合溶液進行超聲提取，具體超聲處理條件為：超聲5秒，間隔15秒，并交替進行。然后，在超聲處理30min后，在4℃，并且離心機的轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下，對超聲后的混合溶液進行離心處理，并離心15分鐘，所得上清液即為鹿茸蛋白提取液，將鹿茸蛋白提取液在溫度設(shè)置為－50℃的真空冷凍干燥機冷凍干燥30小時，即得到實施例2的鹿茸蛋白提取物。

實施例3

1)取適量三岔鹿茸，抽血6小時后，去除表面毛發(fā)，切成薄片，放入冷凍干燥機中冷凍，至兩次稱量質(zhì)量變化小于0.1g后取出。將凍干后的鹿茸放入適量液氮中，研缽研碎，過200目篩，得到鹿茸粉末。

2)稱取1g步驟1)所制得的鹿茸粉，并加入10mL濃度為50mM的Tris－base溶液，pH值為7.4。震蕩30分鐘后，在冰浴下用勻漿機勻漿1min；

3)在冰浴(0～4℃)條件下，使用超聲細(xì)胞粉碎儀對步驟2)中勻漿后的混合溶液進行超聲提取，具體超聲處理條件為：超聲5秒，間隔15秒，并交替進行。然后，在超聲處理30min后，在4℃，并且離心機的轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下，對超聲后的混合溶液進行離心處理，并離心15分鐘，所得上清液即為鹿茸蛋白提取液，將鹿茸蛋白提取液在溫度設(shè)置為－50℃的真空冷凍干燥機冷凍干燥30小時，即得到實施例3的鹿茸蛋白提取物。

實施例4

1)取適量毛桃鹿茸，抽血6小時后，去除表面毛發(fā)，切成薄片，放入冷凍干燥機中冷凍，至兩次稱量質(zhì)量變化小于0.1g后取出。將凍干后的鹿茸放入適量液氮中，研缽研碎，過200目篩，得到鹿茸粉末。

2)稱取1g步驟1)所制得的鹿茸粉，并加入10mL濃度為10mM的PBS緩沖溶液，pH值為7.4。震蕩30分鐘后，在冰浴下用勻漿機勻漿1min；

3)在冰浴(0～4℃)條件下，使用超聲細(xì)胞粉碎儀對步驟2)中勻漿后的混合溶液進行超聲提取，具體超聲處理條件為：超聲5秒，間隔15秒，并交替進行。然后，在超聲處理30min后，在4℃，并且離心機的轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下，對超聲后的混合溶液進行離心處理，并離心15分鐘，所得上清液即為鹿茸蛋白提取液，將鹿茸蛋白提取液在溫度設(shè)置為－50℃的真空冷凍干燥機冷凍干燥30小時，即得到實施例4的鹿茸蛋白提取物。

實施例5

1)取適量二杠鹿茸，抽血6小時后，去除表面毛發(fā)，切成薄片，放入冷凍干燥機中冷凍，至兩次稱量質(zhì)量變化小于0.1g后取出。將凍干后的鹿茸放入適量液氮中，研缽研碎，過200目篩，得到鹿茸粉末。

2)稱取1g步驟1)所制得的鹿茸粉，并加入10mL濃度為10mM的PBS緩沖溶液，pH值為7.4。震蕩30分鐘后，在冰浴下用勻漿機勻漿1min；

3)在冰浴(0～4℃)條件下，使用超聲細(xì)胞粉碎儀對步驟2)中勻漿后的混合溶液進行超聲提取，具體超聲處理條件為：超聲5秒，間隔15秒，并交替進行。然后，在超聲處理30min后，在4℃，并且離心機的轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下，對超聲后的混合溶液進行離心處理，并離心15分鐘，所得上清液即為鹿茸蛋白提取液，將鹿茸蛋白提取液在溫度設(shè)置為－50℃的真空冷凍干燥機冷凍干燥30小時，即得到實施例5的鹿茸蛋白提取物。

實施例6

1)取適量三岔鹿茸，抽血6小時后，去除表面毛發(fā)，切成薄片，放入冷凍干燥機中冷凍，至兩次稱量質(zhì)量變化小于0.1g后取出。將凍干后的鹿茸放入適量液氮中，研缽研碎，過200目篩，得到鹿茸粉末。

2)稱取1g步驟1)所制得的鹿茸粉，并加入10mL濃度為10mM的PBS緩沖溶液，pH值為7.4。震蕩30分鐘后，在冰浴下用勻漿機勻漿1min；

3)在冰浴(0～4℃)條件下，使用超聲細(xì)胞粉碎儀對步驟2)中勻漿后的混合溶液進行超聲提取，具體超聲處理條件為：超聲5秒，間隔15秒，并交替進行。然后，在超聲處理30min后，在4℃，并且離心機的轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下，對超聲后的混合溶液進行離心處理，并離心15分鐘，所得上清液即為鹿茸蛋白提取液，將鹿茸蛋白提取液在溫度設(shè)置為－50℃的真空冷凍干燥機冷凍干燥30小時，即得到實施例5的鹿茸蛋白提取物。

測試?yán)? 鹿茸蛋白提取物的蛋白定量

采用BCA法對實施例1至6制得的鹿茸蛋白提取物進行蛋白定量，具體步驟如下：

配制標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液、BCA工作液；取96孔板，向測樣品孔和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入樣品或者標(biāo)準(zhǔn)品溶液24μL，再加入200μLBCA工作液，混勻；37℃恒溫30min后，取出冷卻至室溫；酶標(biāo)儀562nm波長下測定吸光度；制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出樣品濃度。試驗結(jié)果顯示，實施例1至6制得的鹿茸蛋白提取物中蛋白的濃度分別為16.2mg/mL、14.8mg/mL、15.6mg/mL、15.4mg/mL、13.2mg/mL、15.1mg/mL。

測試?yán)? 鹿茸蛋白提取物SDS－PAGE分析

對實施例1－3制得的鹿茸蛋白提取物進行SDS－PAGE分析，具體操作步驟如下：

配制SDS－PAGE膠(分離膠T＝12％，濃縮膠T＝5％)。上樣之前，樣品加入同體積SDS上樣緩沖液，并在100℃條件下煮沸10min，然后低速離心30s，集中樣品。上樣(總蛋白量為50μg)選用微量移液槍準(zhǔn)確量取，并加上合適的預(yù)染蛋白marker；同時，對于未上樣品的孔，需要加入同體積的稀釋后的樣品緩沖液，降低邊緣效應(yīng)。恒壓電泳80V，1h后調(diào)至120V，溴酚蘭跑至離下端0.5cm左右，停止電泳。

測試結(jié)果如圖1鹿茸蛋白提取物的SDS－PAGE分析結(jié)果圖所示，其中圖1中孔道從左至右依次為毛桃鹿茸(1－2、1－3、1－4)、二杠鹿茸(2－1、2－2、2－3、2－4)、三岔鹿茸(3－1、3－2)和標(biāo)準(zhǔn)marker。

效果例1

清潔50只周齡為10～12周，體重為25～28g的雌性昆明種小鼠(大連醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供)。將小鼠飼養(yǎng)于22℃室溫的室內(nèi)條件下，并控制室內(nèi)光照周期為14h光照(06:00-20:00)以及10h黑暗，在飼養(yǎng)過程中，可以自由取食飲水。

在飼養(yǎng)環(huán)境中通入乙醚，并使得小鼠吸入乙醚進行麻醉，然后，對麻醉后的小鼠進行快速結(jié)扎并切除雙側(cè)卵巢，并在切除卵巢后，讓小鼠恢復(fù)10天，以消除雌孕激素在體內(nèi)的存留。

然后，將恢復(fù)后的小鼠隨機分為6組，每組10只。其中，第1組小鼠灌胃生理鹽水，記為OVX組；第2組小鼠灌胃等量的溶解于生理鹽水的2mg實施例1的鹿茸蛋白質(zhì)提取物，記為2mg組；第3組小鼠灌胃等量的溶解于生理鹽水的6mg實施例1的鹿茸蛋白質(zhì)提取物，記為6mg組；第4組小鼠灌胃等量的且溶解于生理鹽水的2mg實施例1的鹿茸蛋白質(zhì)提取物，記為18mg組；第5組小鼠灌胃等量的溶于蓖麻油的20μg劑量的雌二醇，記為E2組；第6組小鼠灌胃等量的溶于蓖麻油的20μg劑量的雌二醇與溶解于生理鹽水的2mg實施例1的鹿茸蛋白質(zhì)提取物的混合物，連續(xù)灌胃14天，每天灌胃1次，每次每只小鼠灌胃0.1ml。在最后1次灌胃10h后，對各組小鼠的體重分別進行稱量；然后，對各組小鼠分別進行頭頸部位脫臼處理以處死小鼠，并分別取出各組小鼠的子宮，在剔除子宮表面脂肪等雜物后，用分析天平(精確到0.01mg)進行稱重，每個子宮稱量3次，計算平均值，并統(tǒng)計記錄，結(jié)果如圖2所示。然后將稱量統(tǒng)計后的小鼠子宮放入福爾馬林溶液中固定，并用于HE染色。

由如圖2小鼠卵巢切除后子宮/體重(mg/g)圖表中的統(tǒng)計數(shù)據(jù)可知，OVX組、2mg組、6mg組和18mg組的子宮/體重的比值分別是0.82±0.05、0.95±0.06、1.12±0.10、1.37±0.04mg/g。

其中，2mg組和OVX組相比，雖然比值略有增加，但是無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；6mg組和18mg組與OVX組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，尤其是18mg組可以看出比值明顯增加；E2組與E2+2mg組分別是2.12±0.08和3.06±0.13mg/g，與OVX組比較兩者比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，可以看出兩組比值均顯著增加，并且E2+2mg組合組具有更加顯著的效果。

由此可見，本發(fā)明鹿茸蛋白質(zhì)提取物對子宮的增重有很好的促進作用。

效果例2

將效果例1中固定于福爾馬林的小鼠子宮用常規(guī)梯度乙醇脫水，再經(jīng)二甲苯透明后，用切片厚度為4～5μm的55℃低熔點石蠟包埋，并在60℃恒溫箱中烤60min后，二甲苯脫蠟，并用梯度酒精水化，然后進行HE染色，并使用中性樹膠進行封片，并鏡下觀察并拍照，結(jié)果如圖3所示。

其中，A區(qū)域為OVX組染色圖；B區(qū)域為2mg組染色圖；C區(qū)域為6mg組染色圖；D區(qū)域為18mg組染色圖；E區(qū)域為E2組染色圖；F區(qū)域為E2+2mg組染色圖。

由圖3小鼠卵巢切除后子宮HE染色圖中不同區(qū)域中組織器官結(jié)構(gòu)相對大小比較可知，隨著鹿茸蛋白提取物用量的提高，子宮的量也隨之逐漸增大；同時，子宮內(nèi)膜逐漸增生，腺體也逐漸增大。特別是當(dāng)劑量增加到18mg鹿茸蛋白提取物后，子宮內(nèi)膜細(xì)胞具有明顯增生。而雌二醇(E)以及雌二醇與2mg鹿茸蛋白提取物混合組(F)增生更加顯著。此結(jié)果與小鼠子宮/體重結(jié)果相吻合，進一步說明鹿茸蛋白提取物對子宮具有促進增生和保護作用。

效果例3

分別快速刮取效果例1中各組小鼠子宮內(nèi)膜，并移入1ml勻漿器，然后采用Trizol法提取RNA，并用751分光光度計法檢測OD260/OD280，然后計算RNA含量及純度，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取效果，檢測結(jié)果如圖4、圖5所示。

具體檢測步驟如下：將RNA提取物置于－70℃保存，并進一步按照如下配方配置cDNA合成的逆轉(zhuǎn)錄體系：1μlRNA，4μlMg²⁺(25mmol/L)，2μl10×Buffer，2μldNTP(10mmol/L)，0.5μlRNAase抑制劑，1μlAMV逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/μl)，1μlOligo－dt、6μlRNA提取物，以及2.5μlDEPC水。

然后在50℃條件下保持50min，然后在99℃條件下保持5min，最后在5℃下保持5min的步驟條件下進行逆轉(zhuǎn)錄。然后，取2μl逆轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物進行PCR，并在94℃變性30s，然后退火至54℃，并保持30s，然后延伸至72℃，并保持40s，共進行45個循環(huán)。然后，將PCR后RNA以LIF為載體進行基因表達(dá)，并與GAPDH進行平行參照。其中，所述LIF上游引物序列為5′－GGCAACCTCATGAACCAGATCA－3′，下游序列為5′－GCAAAGCACATTGCTGAGGAGG－3′，反應(yīng)條件為94℃下保持30s，然后退火至58℃保持30s，接著延伸72℃保持30，共進行35個循環(huán)。

由圖4 LIF對照結(jié)果圖可知，OVX組LIF的mRNA有較弱的表達(dá)；而食用過本發(fā)明鹿茸蛋白提取物的2mg組、6mg組、18mg，E2組以及E2+2mg組表達(dá)成濃度依賴性逐漸增強。

進一步以GAPDH為對照進行灰度值比較，如圖5灰度值對比圖(即LIF/GAPDH灰度值對比圖)所示，可以明顯看出食用過本發(fā)明鹿茸蛋白提取物的2mg組、6mg組、18mg，E2組以及E2+2mg組比值成濃度依賴性逐漸增強，并具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

效果例3的對照數(shù)據(jù)結(jié)果進一步說明鹿茸蛋白提取物對子宮具有促進增生和保護的作用，同時對LIF基因表達(dá)具有顯著的上調(diào)作用。

本發(fā)明方法能夠有效的將鹿茸中的活性蛋白進行提取，并且所提取的蛋白仍然保持很高的生物活性，能夠有效促進子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長，并起到保護子宮的作用。

本說明書中所描述的具體實施例僅僅是對本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。

盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。