本發(fā)明涉及一種醫(yī)學(xué)檢測方法，特別涉及一種DCP磁微粒免疫熒光檢測方法、以及DCP磁微粒免疫熒光檢測試劑和檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
肝細胞癌是一種常見的惡性腫瘤，其死亡率為我國惡性腫瘤的第2位，占全球肝癌死亡人數(shù)的53％(Bruix J,Llovet JM.Major achievements in hepatocellular carcinoma.Lancet.2009,373(9664):614-616)。HCC的發(fā)生主要與乙型肝炎病毒感染有關(guān)，其發(fā)展進程復(fù)雜，涉及多階段、多因素，由腫瘤細胞及其周圍的局部微環(huán)境共同作用(Altekruse SF,McGlynn KAJDickie LA,et al.Hepatocellular carcinoma confirmation,treatment,and survival in surveillance 5 epidemiology 9 and end results registries,1992-2008.Hepatology.2012,55(2):476-482)。臨床結(jié)果顯示，已檢測出具有典型臨床癥狀的患者往往已是肝癌晚期，因此早期診斷是治療HCC的關(guān)鍵。臨床診斷HCC最常用的血清腫瘤標志物為甲胎蛋白AFP，其檢測敏感性僅為60％～70％，但約18％的肝癌AFP不升高。早期肝癌AFP的假陰性率更可高達40％，其原因可能是某些類型肝癌早期并不表達AFP或AFP含量與腫瘤體積大小有關(guān)。此外，在篩選有慢性病毒性肝炎背景下的肝癌時，AFP的特異性和敏感性相對較低，其假陰性和假陽性均可影響肝癌的正確診斷，而且AFP在一些良性肝病、部分生殖系統(tǒng)和胃腸道的惡性腫瘤患者的血清中也會升高，從而導(dǎo)致產(chǎn)生假陽性，影響臨床診斷結(jié)果，存在一定的缺陷(Gupta S,Bent S,Kohlwes J.Test characteristics of alpha-fetoprotein for detecting hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis C.A systematic review and critical analysis.Ann Intern Med,2003；139(1):46-50)(Spangenberg HC,Thimme R,Blum HE.Serum markers of hepatocellular carcinoma.Setnin Liver Dis.2006；26(4):385-390)。因此，尋找新的HCC早期診斷血清標志物一直是研究關(guān)注的熱點。
DCP(Des-γ-carboxy prothrombin)即脫-γ-羧基凝血酶原，又可稱為維生素K缺乏或拮抗劑II誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)PIVKA-II(Protein induced by vita min K absence-II)，也被稱為人異常凝血酶原APT(Human abnormal prothrombin)，是肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的產(chǎn)物。與正常凝血酶原相比，DCP的分子結(jié)構(gòu)域中有一個或多個Glu殘基沒有被完全羧化成為Gla，從而失去凝血功能。正常凝血酶原(Prothrombin)是在肝細胞微粒體內(nèi)主要依賴維生素K的γ-谷氨酰羧化酶(γ-glutamyl-carboxylase)及輔酶vitamin K-epoxide-reductase和vitamin K-reductase參與下，將結(jié)構(gòu)Gla domam中的第6，7，14，16，19，20，25，26，29和32位的10個Glu殘基(Glu residus)羧化為Gla，使之成為有活性的prothrombin。上述任何位點的一個或多個Glu殘基羧化不全，都將可能形成DCP，失去prothrombin的凝血功能。作為HCC的腫瘤標記物，DCP已成為協(xié)助臨床診斷和預(yù)后的重要輔助指標。其與多種肝細胞癌惡性增殖途徑相關(guān)，尤其可能在HCC的發(fā)展、浸潤與轉(zhuǎn)移等方面促進肝癌細胞的惡性增殖。1984年Liebman等首次報道(Liebman HA,Furie BC,Tong MJ,et al.Des-gamma-carboxy(abnormal)prothrombin as a serum marker of primary hepatocellular carcinoma.N Engl J Med.1984；310:1427-1431)稱DCP在91％的肝癌患者血清中水平升高。Sakon報道60例HCC中DCP的陽性率為58.4％，而AFP陰性HCC其陽性率仍為61.9％，提示其有助于AFP陰性HCC的診斷。DCP的陽性率還與腫瘤的生長有關(guān)，其陽性率在直徑<3cm的HCC為19.1％，直徑3～5cm的HCC為55.6％，直徑>5cm的HCC為66.2％，慢性肝病或肝硬化為14.8％，因此可作為AFP陰性或低濃度AFP肝細胞癌的輔助診斷。DCP與腫瘤大小、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、門靜脈侵犯(portal venous invasion，PVI)以及腫瘤組織增殖有關(guān)。Khan在對65例首次治療采用無水酒精經(jīng)皮注射單個HCC癌瘤結(jié)節(jié)直徑≤6cm的患者作了分析后表明，DCP陽性(>20μg/L)患者1年和2年肝內(nèi)復(fù)發(fā)率分別為22.5％、31.4％，而陰性者(<20μg/L)則分別為8％和17.8％。因此認為治療前DCP的血漿水平可以作為早期HCC復(fù)發(fā)的預(yù)測指標，并有助于為患者選擇適宜的治療方法。Sakon和Naka認為DCP陽性者與DCP陰性者比較生存率降低，轉(zhuǎn)移率及復(fù)發(fā)率增加，癌灶直徑更大(Khan KN,Yatsuhashi H,Yamasaki K,et al.Prospective analysis of risk factor for early intrahepatic recurrence of hepatocellular carcinoma following ethanol injection.J Hepatol,2000,32(2):269-278)。Koike在對227例首次住院無PVI且接受經(jīng)皮乙醇注射或微波治療的HCC患者，做了平均19個月的隨訪分析，發(fā)現(xiàn)11％的患者出現(xiàn)PVI，單因素分析表明：腫瘤數(shù)目、組織學(xué)類型、AFP及DCP水平與出現(xiàn)PVI時相比有顯著相關(guān)性；進一部分析表明，血漿DCP水平對于HCC后期是否伴發(fā)PVI是最常用的預(yù)后指標，監(jiān)測其水平有助于PVI的早期診斷和治療(Koike Y,Shiratori Y,Sato S,et al.Des-γ-carboxy prothrombin as a useful predisposing factor for development of portal venous in-vasion of hepatocellular carcinoma.Cancer,2001,91(3):561-569)。Utsunomiya對23例原手術(shù)時為進展期HCC后伴肝外復(fù)發(fā)者與186例肝內(nèi)復(fù)發(fā)者作了比較。在對腫瘤大小限定后，兩組患者預(yù)后無差異，而當(dāng)腫瘤直徑>5cm時，血漿DCP含量高于2000μg/L者發(fā)生肝外復(fù)發(fā)(62.5％)的顯著多于肝內(nèi)復(fù)發(fā)(P<0.05)。因此認為，一旦腫瘤直徑超過5cm且其血漿DCP水平高于2000μg/L，就有必要采取比平常更為仔細的隨訪檢查以盡可能早期發(fā)現(xiàn)肝外復(fù)發(fā)的可能(Utsunomiya T,Shimada M,Shirabe K,et al.Clinicopathological characteristics of patients with extrahepatic recurrence following a hepatectomy for hepatocellular carcinoma.Hepatogastroenterology,2001,48(40):1088-1093)。DCP的氨基酸特定位置上存在未經(jīng)羧基化的谷氨酸殘基，當(dāng)肝細胞發(fā)生癌變時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不能將DCP羧化成有活性的凝血酶原，從而使DCP含量升高。有報告顯示，血清DCP有助于提高肝癌診斷的敏感性和特異性，并可以發(fā)現(xiàn)部分AFP陰性的小肝癌。因此DCP是臨床上一個具有很好應(yīng)用前景的HCC血清標志物，有望提高HCC診斷的敏感性和特異性，實現(xiàn)HCC的早期診斷(Lok AS,Sterling RK,EverhartJE,et al.Des-γ-carboxy prothrombin andα-fetoprotein as biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma.Gastroenterology,2010,138(2):493-502)。
DCP對疾病的診斷價值是肯定的，但是一些常規(guī)的檢測方法缺乏足夠的敏感性，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準確。臨床常用免疫分析法檢測DCP的含量，利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)進行檢測，免疫標記技術(shù)進行結(jié)果判定，將熒光素、同位素或酶等示蹤物質(zhì)標記抗體(或抗原)進行抗原-抗體反應(yīng)，通過對免疫復(fù)合物中的標記物的檢測，達到對免疫反應(yīng)進行監(jiān)測的目的。常用的免疫分析標記技術(shù)包括酶免疫分析、放射免疫分析、熒光酶免疫分析、膠體金免疫技術(shù)、發(fā)光免疫技術(shù)等。其中酶免疫分析靈敏度較低且操作復(fù)雜；放射免疫分析靈敏精確、樣本用量少，但檢測有效期較短且具有放射性污染；膠體金免疫技術(shù)標記物的制備簡便，靈敏直觀，但同時受影響因素較多；發(fā)光免疫技術(shù)檢測步驟較復(fù)雜，本底較高且結(jié)果不穩(wěn)定。
現(xiàn)有技術(shù)中，磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)綜合了磁微粒載體技術(shù)和化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)，使測量結(jié)果更準確，更穩(wěn)定。該技術(shù)包括：
●磁微粒化學(xué)發(fā)光--雙抗體夾心法：待測抗原同熒光素標記的抗體及酶標抗體結(jié)合形成“三明治”結(jié)構(gòu)的復(fù)合物。隨后加入連有抗熒光素抗體的磁微粒，通過抗熒光素抗體與熒光素的特異性結(jié)合使抗原抗體復(fù)合物連接在磁微粒上，在外加磁場中直接沉淀，將免疫反應(yīng)形成的復(fù)合物與未結(jié)合的其它物質(zhì)分離。去上清后清洗沉淀的復(fù)合物，加入酶促化學(xué)發(fā)光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)激發(fā)態(tài)中間體回到基態(tài)時便發(fā)出光子，形成發(fā)光反應(yīng)，通過光量子閱讀系統(tǒng)記錄光子能量，并通過計算機處理系統(tǒng)將光能量強度在標準曲線上轉(zhuǎn)換為待測抗原的濃度，并報告結(jié)果。
磁微?；瘜W(xué)發(fā)光--競爭法：將待測抗原、用過量包被磁微粒的抗體和定量的標記抗原同時加入反應(yīng)杯溫育，其免疫反應(yīng)的結(jié)合形式有兩種，一是標記抗原與抗體結(jié)合形成復(fù)合物；二是待測抗原與抗體結(jié)合形成復(fù)合物。如待測標本中含有待測抗原，則與標記抗原以同樣的機會與磁微粒包被的抗體結(jié)合，競爭性地占去了標記抗原與磁微粒包被的抗體結(jié)合的機會，使標記抗原與磁微粒包被的抗體的結(jié)合量減少。由于磁微粒包被的抗體是過量的，足以與待測抗原結(jié)合。磁微粒在外加磁場中直接沉淀，將免疫反應(yīng)形成的復(fù)合物與未結(jié)合的其它物質(zhì)分離。去上清后清洗沉淀的復(fù)合物，加入酶促化學(xué)發(fā)光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)激發(fā)態(tài)中間體回到基態(tài)時便發(fā)出光子，形成發(fā)光反應(yīng)，通過光量子閱讀系統(tǒng)記錄光子能量，并通過計算機處理系統(tǒng)將光能量強度在標準曲線上轉(zhuǎn)換為待測抗原的濃度，并報告結(jié)果。
磁微?；瘜W(xué)發(fā)光—間接法：待測抗體與熒光素標記的抗原結(jié)合，隨后加入包被著抗熒光素抗體的磁微粒，通過抗熒光素抗體與熒光素的特異性結(jié)合使抗原抗體復(fù)合物連接在磁微粒上，在外加磁場中直接沉淀，去上清后清洗沉淀的復(fù)合物，加入酶標抗體，形成磁微粒－抗原－抗體－酶標二抗夾心免疫復(fù)合物。再次清洗后，加入酶促化學(xué)發(fā)光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)激發(fā)態(tài)中間體回到基態(tài)時便發(fā)出光子，形成發(fā)光反應(yīng)，通過光量子閱讀系統(tǒng)記錄光子能量，并通過計算機處理系統(tǒng)將光能量強度在標準曲線上轉(zhuǎn)換為待測抗體的濃度，并報告結(jié)果。
但上述技術(shù)存在一些缺陷：如：
間斷的、閃爍性發(fā)光不穩(wěn)定，
反應(yīng)過程中易發(fā)生裂變，結(jié)果不穩(wěn)定，
以微孔板為載體，測試成本高、時間長，
需對結(jié)合相、游離相進行分離，操作步驟多，
瞬間產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光峰值很快衰減，
本底較高，干擾妨礙應(yīng)用，
不易自動化等。
基于以上不足，本發(fā)明建立了一種DCP磁微粒免疫熒光檢測方法，使用磁微粒A與DCP特異性結(jié)合的抗體偶聯(lián)，使用熒光素標記該抗體作為檢測抗體，再使用偶聯(lián)DCP的磁微粒B清除過量的檢測抗體，通過檢測熒光強度計算目標檢測物DCP的含量，實現(xiàn)對DCP含量的簡便快速、靈敏準確的檢測。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種檢測血漿或血清中DCP含量的方法：所述方法包括以下步驟：
步驟1，表面偶聯(lián)抗DCP抗體的磁微粒A的制備，和表面偶聯(lián)DCP抗原的磁微粒B的制備；
步驟2，熒光標記的抗DCP抗體的制備；
步驟3，DCP含量的檢測：血漿或血清樣品和磁微粒A反應(yīng)，反應(yīng)完畢將DCP洗脫，加入熒光標記的抗DCP抗體孵育，再加入磁微粒B繼續(xù)孵育，然后磁性分離，用熒光分光光度計檢測樣品熒光值，計算樣品中DCP含量；
其中所述DCP為脫-γ-羧基凝血酶原(Des-γ-carboxy prothrombin)，又可稱為PIVKA-II(Protein induced by vita min K absence-II)，維生素K缺乏或拮抗劑II誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)，也被稱為APT(Human abnormal prothrombin)，人異常凝血酶原。
本發(fā)明所述的方法，其中所述磁微粒A和磁微粒B的制備，方法如下：將磁微粒制備成磁微粒懸浮液，磁微粒懸浮液與抗DCP抗體或DCP抗原偶聯(lián)：將抗DCP抗體或DCP抗原與磁微粒懸浮液混合孵育偶聯(lián)，偶聯(lián)后用封閉液封閉，得到偶聯(lián)DCP抗體的磁微粒A和偶聯(lián)DCP抗原的磁微粒B。
本發(fā)明所述的方法，其中，所述與DCP特異性結(jié)合的抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
本發(fā)明所述的方法，其中，磁微粒與DCP抗原的偶聯(lián)條件選自如下條件：
磁微粒粒徑120nm、抗原濃度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝11；
磁微粒粒徑180nm、抗原濃度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝10；
磁微粒粒徑200nm、抗原濃度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝11；
磁微粒粒徑300nm、抗原濃度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝10；
磁微粒粒徑500nm、抗原濃度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝11；
或者磁微粒粒徑800nm、抗原濃度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝10；
本發(fā)明所述的方法，其中，磁微粒與抗DCP抗體的偶聯(lián)條件選自如下條件：
磁微粒粒徑120nm、抗體濃度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝11；
磁微粒粒徑180nm、抗體濃度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝10；
磁微粒粒徑200nm、抗體濃度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝11；
磁微粒粒徑300nm、抗體濃度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝10；
磁微粒粒徑500nm、抗體濃度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝11；
或者磁微粒粒徑800nm、抗體濃度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝10。
本發(fā)明所述的方法，步驟如下：
步驟(1)取磁微粒，加入磁微粒體積2～50倍的洗滌緩沖液，混勻，然后在磁力架上磁性分離，棄上清液；重復(fù)上一步驟，然后將磁微粒在與其等量的偶聯(lián)緩沖液中懸浮，得到磁微粒懸浮液；
步驟(2)向抗DCP抗體或DCP抗原中加入體積0.01～1倍的步驟(1)處理的磁微粒懸浮液，加入偶聯(lián)緩沖液，孵育，直至磁微粒偶聯(lián)完全；磁性分離，保留磁微粒；磁微粒偶聯(lián)結(jié)束后，加入封閉液，混勻，孵育磁性分離，得到偶聯(lián)DCP抗體的磁微粒A和偶聯(lián)DCP抗原的磁微粒B；
步驟(3)熒光標記的抗DCP抗體的制備：抗DCP抗體溶解于碳酸鹽緩沖液中，熒光素溶解于DMSO中，將熒光素逐滴緩慢加入抗DCP抗體溶液中，4℃避光攪拌12～20h，用G-25葡聚糖凝膠去除游離的熒光素；
步驟(4)取待測樣品，加入樣品體積1～100倍的磁微粒A，于室溫旋轉(zhuǎn)孵育2～6h或者4℃孵育12～20h，使DCP抗原抗體充分反應(yīng)；置于磁力架上磁性分離，棄上清液，用洗滌緩沖液清洗磁微粒復(fù)合物，置于磁力架上磁性分離，棄上清液；加入與抗體等量的洗脫液，混勻，重懸磁微粒，室溫孵育5min，置于磁力架上磁性分離，保留上清液；加入樣品體積1～100倍的熒光標記DCP抗體，于室溫旋轉(zhuǎn)孵育2～6h或者4℃孵育12～20h；加入磁微粒A體積1～100倍的磁微粒B，于室溫旋轉(zhuǎn)孵育2～6h或者4℃孵育12～20h；置于磁力架上磁性分離，保留上清液，采用熒光分光光度計檢測樣品熒光值，并對照標準曲線計算樣品中DCP含量。
本發(fā)明所述的方法，優(yōu)選的步驟如下：
(5)取磁微粒置于EP管中，加入磁微粒體積10～20倍的洗滌緩沖液，混勻，然后在磁力架上磁性分離，棄上清液；重復(fù)上一步驟，然后將磁微粒在與其等量的偶聯(lián)緩沖液中懸浮，得到磁微粒懸浮液；
(6)加入磁微粒懸浮液體積0.2～0.3倍的需偶聯(lián)的抗DCP抗體或DCP抗原于盛有磁微粒磁微粒懸浮液的EP管中，并加入磁微粒懸浮液體積10倍的偶聯(lián)緩沖液，混勻；將EP管置于旋轉(zhuǎn)混合儀上室溫孵育2～6h或者4℃孵育12～20h，直至磁微粒偶聯(lián)完全；將EP管置于磁力架上磁性分離，保留磁微粒；表面偶聯(lián)抗DCP抗體的為磁微粒A，表面偶聯(lián)DCP抗原的為磁微粒B，上清液用于檢測偶聯(lián)效率；
(7)磁微粒偶聯(lián)結(jié)束后，加入磁微粒懸浮液體積10倍的封閉液，混勻，將EP管置于旋轉(zhuǎn)混合儀上室溫孵育2～6h或者4℃孵育12～20h，將EP管置于磁力架上磁性分離，棄上清液；重復(fù)上一步驟一次；
(8)取待測血漿或血清樣品，加入樣品體積1～100倍的磁微粒A，于室溫旋轉(zhuǎn)孵育2～6h或者4℃孵育12～20h，使DCP抗原抗體充分反應(yīng)；置于磁力架上磁性分離，棄上清液，用洗滌緩沖液清洗磁微粒復(fù)合物，置于磁力架上磁性分離，棄上清液；加入與抗體等量的洗脫液，混勻，重懸磁微粒，室溫孵育5min，置于磁力架上磁性分離，保留上清液；加入樣品體積1～100倍的熒光標記DCP抗體，于室溫旋轉(zhuǎn)孵育2～6h或者4℃孵育12～20h；加入磁微粒A體積1～100倍的磁微粒B，于室溫旋轉(zhuǎn)孵育2～6h或者4℃孵育12～20h；置于磁力架上磁性分離，保留上清液，采用熒光分光光度計檢測樣品熒光值，并對照標準曲線計算樣品中DCP含量。
本發(fā)明所述的方法，其中，
偶聯(lián)緩沖液選自：碳酸氫鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、硫酸鹽緩沖液的一種或多種的組合，濃度為1～100mM，pH為8.0～10.0；
洗滌緩沖液選自：甘氨酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、氯化鹽緩沖液的一種或多種的組合，濃度為2～200mM，pH為7.0～8.0；
洗脫液選自：甘氨酸、Tris Buffer、EDTA溶液、IPTG溶液、L-谷氨酸溶液、MES Buffer的一種或多種的組合，濃度為0.01～10M，pH為2.0～3.0；
封閉液選自：BSA、酪蛋白、甘氨酸的一種或多種的組合，濃度為0.05％～5％，pH為8.0～9.0；
保存液選自：BST緩沖液、Tween-20、NaN3、BSA的一種或多種的組合，濃度為1～50mM，pH為8～10。
本發(fā)明還提供一種采用本發(fā)明方法檢測DCP的試劑盒，包括：
磁微粒，以及任選的以下組分：偶聯(lián)DCP抗體的磁微粒A，偶聯(lián)DCP抗原的磁微粒B，DCP抗原，抗DCP抗體，熒光素，偶聯(lián)緩沖液，洗滌緩沖液，洗脫液，封閉液，保存液，磁力架。
優(yōu)選的采用本發(fā)明方法檢測DCP的試劑盒，包括：
偶聯(lián)DCP抗體的磁微粒A，
偶聯(lián)DCP抗原的磁微粒B，
以及任選的以下組分：DCP抗原，抗DCP抗體，熒光素，偶聯(lián)緩沖液，洗滌緩沖液，洗脫液，封閉液，保存液，磁力架。
本發(fā)明所述的試劑盒，包括：盒體、盒體內(nèi)的試劑，試劑槽，說明書，所述試劑放置在試劑槽中。
本發(fā)明的目的在于提供：與以往的方法相比，簡便快速，高靈敏度，高準確性，安全無毒，可回收DCP磁微粒免疫熒光檢測方法，以及其檢測試劑和檢測試劑盒。
本發(fā)明人對于DCP的檢測方法進行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過磁微粒分離熒光免疫分析技術(shù)，與以往的方法相比，具有簡便快速，靈敏度高，準確性高，安全無毒，可回收等優(yōu)點，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供DCP的磁微粒分離免疫熒光分析檢測方法，該檢測方法包括：使用磁微粒作為固相載體，偶聯(lián)與DCP特異性結(jié)合的抗體作為包被抗體，使用熒光素標記與DCP特異性結(jié)合的抗體作為檢測抗體，最后使用偶聯(lián)DCP的磁微粒清除過量的檢測抗體，通過熒光強度定量檢測樣品中的DCP。本發(fā)明還提供DCP磁微粒免疫熒光檢測試劑，該免疫熒光檢測試劑包含：磁微粒，DCP抗原，抗DCP抗體，熒光素，偶聯(lián)緩沖液，洗滌緩沖液，洗脫液，封閉液，保存液。本發(fā)明進一步提供DCP磁微粒免疫熒光檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括本發(fā)明所述的DCP磁微粒免疫熒光檢測試劑。
根據(jù)本發(fā)明可提供簡便快速，高靈敏度，高準確性，安全無毒，可回收的的DCP的磁微粒分離免疫熒光分析檢測方法、以及用于該檢測的試劑和檢測試劑盒。本發(fā)明的方法與以往的方法相比，檢測效率得到大幅提高，作為DCP檢測方法，其具有簡便快速，靈敏度高，準確性高，安全無毒，可回收等優(yōu)點。
本發(fā)明的檢測方法中，使用磁性微粒分別偶聯(lián)DCP、與DCP特異性結(jié)合的抗DCP抗體、和熒光標記的抗DCP抗體進行磁微粒分離免疫熒光分析檢測。通過此方法，可以合乎需要地簡化操作步驟，降低檢測成本，提高檢測值的準確性。
DCP抗原，即DCP抗原蛋白標準品，為市售商品，可按照常規(guī)方法購買獲得，其特性如下：產(chǎn)品濃度1mg/ml，純化方法為HPLC，純度≥98％。
抗DCP抗體是與DCP特異性結(jié)合的抗體，可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。從免疫檢測的再現(xiàn)性等角度考慮，可優(yōu)選使用單克隆抗體。另外，這些抗體也可以保持與對應(yīng)抗原的結(jié)合性的抗體片段(抗原結(jié)合性片段)的形式使用。
多克隆抗體、單克隆抗體和抗原結(jié)合性片段的制備方法本身是周知的常規(guī)方法，抗DCP抗體或及抗原結(jié)合性片段可按照常規(guī)方法制備。另外，這些抗體也存在市售商品，因此也可以使用市售的抗體。
抗DCP單克隆抗體例如可通過周知的雜交瘤法獲得：將DCP或其部分片段作為免疫原與適當(dāng)?shù)淖魟┗旌嫌糜诿庖邉游?人除外)，從該動物采集脾細胞或淋巴細胞等抗體生成細胞，將其與骨髓瘤細胞融合，制備雜交瘤，然后選擇生產(chǎn)與DCP特異性結(jié)合的抗體的雜交瘤，使其增殖，從培養(yǎng)上清中獲得抗DCP單克隆抗體。為了使被免疫動物中抗體效價升高，免疫通常需要花費數(shù)周進行多次。本發(fā)明中，為了提高DCP結(jié)合的特異性，優(yōu)選單克隆抗體。
作為免疫原使用的多肽或其部分片段可通過化學(xué)合成、遺傳工程學(xué)方法等常規(guī)方法制備，或從新鮮人血漿等中提取DCP并純化獲得。化學(xué)合成法的具體例子例如可舉出：Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧基羰基法)等。還可以利用各種市售的肽合成儀，通過常規(guī)方法參照GenBank等數(shù)據(jù)庫中的DCP序列信息合成所需的多肽。通過遺傳工程學(xué)方法制備多肽的方法也是周知的。具體來說，例如可通過以下所述的方法制備：首先，由來自人的培養(yǎng)細胞等中提取RNA，通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)由mRNA合成cDNA。以該cDNA為模板，根據(jù)GenBank等數(shù)據(jù)庫中的DCP序列信息等設(shè)計引物并進行PCR，制備編碼DCP的多核苷酸?；蛘?，編碼DCP的多核苷酸可通過使用市售的核酸合成儀的常規(guī)方法制備。編碼各氨基酸的密碼子是公知的，因此只要特定氨基酸序列，編碼該氨基酸序列的多核苷酸的堿基序列也可確定。接著，將制備的多核苷酸導(dǎo)入適當(dāng)?shù)妮d體，通過適當(dāng)?shù)谋磉_系統(tǒng)使多肽表達，回收該多肽，由此可獲得所需的免疫原多肽。所使用的載體或各種表達系統(tǒng)(細菌表達系統(tǒng)、酵母細胞表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)、無細胞表達系統(tǒng)等)也是周知的，各種載體或宿主細胞、試劑類、檢測試劑盒均有市售。
免疫分析法是周知的常規(guī)方法。作為具體例子，可舉出競爭蛋白結(jié)合分析、受體結(jié)合分析，以及放射免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫分析、膠體金免疫分析、化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光免疫分析方法等，本發(fā)明中可以采用任意方法。從免疫檢測的準確性及安全性等角度考慮，可優(yōu)選使用熒光免疫分析法。
磁微粒即超順磁性納米顆粒，磁微粒分離免疫熒光分析技術(shù)是將目標分子的親和基團如抗體、蛋白等偶聯(lián)于磁性納米顆粒表面，形成可均勻分散的具有高度穩(wěn)定性的膠態(tài)復(fù)合磁微粒。當(dāng)免疫磁微粒與含有檢測目標分子的溶液混合后，由于目標分子與其基團的親和結(jié)合而形成磁微粒-基團-目標分子復(fù)合物，然后利用外加磁場(磁力架或磁棒)與磁微粒之間的磁性將磁微粒-基團-目標分子復(fù)合物分離，經(jīng)過洗滌緩沖液去除非特異性結(jié)合雜質(zhì)，然后用洗脫液將目標分子與磁微粒分離，進而實現(xiàn)目標分子的分離檢測，具有成本低、能耗少、安全無毒、可回收等優(yōu)點，若與全自動分離檢測儀器配套使用，可進一步提高反應(yīng)通量和工作效率。本發(fā)明在粒徑分布于100～1000nm之間的磁微粒表面或通過磁微粒表面的功能基團(氨基、羧基、巰基、環(huán)氧基、NHS基團等)偶聯(lián)DCP和與DCP特異性結(jié)合的抗DCP抗體，作為固相載體用于免疫檢測。本發(fā)明中的磁微粒表面可以使用任意一種功能基團與DCP或者抗DCP抗體偶聯(lián)。懸浮性磁微粒作為固相載體，取代傳統(tǒng)的免疫學(xué)固相載體用于檢測，具有較大的比表面積，能夠充分的與樣品反應(yīng)，加之外加磁場的靈活運用，具有快速高效、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點。另外，這些磁微粒也存在市售商品，因此也可以使用市售的磁微?；蛘叽胖?。
以使用抗DCP抗體作為包被抗體的情形為例，具體說明本發(fā)明的DCP檢測方法。首先，將抗DCP抗體(包被抗體)偶聯(lián)于固相載體磁微粒上，將多余的基團封閉后使足量磁微粒與待測樣品充分接觸，由此磁微粒上的抗DCP抗體與樣品中所含的DCP特異性結(jié)合，接著磁性分離，用適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌磁微粒復(fù)合物，除去未結(jié)合的樣品中其他成分，例如多余的載體等。然后洗脫DCP，使用過量的熒光素標記的抗DCP抗體與DCP結(jié)合，孵育使充分反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用適當(dāng)?shù)姆椒z測來自熒光素標記物的熒光信號，由此可檢測樣品中的DCP含量。
固相載體沒有特別限定，可以與在公知的免疫檢測系統(tǒng)中使用的固相載體相同。固相載體的材質(zhì)的具體例子可舉出：聚苯乙烯、聚氯乙烯、瓊脂糖、脂質(zhì)體、膜載體、高分子磁微粒等，但并不限于這些。所使用的固相載體優(yōu)選為抗體與其表面結(jié)合牢固，且可容易地將檢測中形成的免疫復(fù)合物與未反應(yīng)的成分分離的材料。從操作性、經(jīng)濟性、安全性與結(jié)合效率等方面考慮，優(yōu)選使用如上所述材質(zhì)中的磁微粒。
DCP、與DCP特異性結(jié)合的抗DCP抗體或其抗原結(jié)合性片段與固相載體的結(jié)合可通過本領(lǐng)域周知的常規(guī)方法進行，作為具體例子，可舉出共價鍵化學(xué)偶聯(lián)、非共價鍵吸附或物理吸附等，本發(fā)明可以采用任意一種方式結(jié)合到固相載體表面，但并不限于這些。
一種磁微粒，其特征在于：所述磁微粒表面覆蓋有一層具有抗原識別活性的抗體，或覆蓋有一層具有抗體識別活性的抗原。
標記物沒有特別限定，可以使用與在公知的免疫檢測系統(tǒng)中使用的標記物同樣的物質(zhì)。具體例子可舉出：酶、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、染色物質(zhì)、放射性物質(zhì)等。為了提高檢測靈敏度，簡化操作步驟，降低放射污染，優(yōu)選使用熒光素標記。用于標記的熒光染料也沒有特別限定，可以使用與在公知的免疫熒光檢測系統(tǒng)中使用的標記物同樣的物質(zhì)，具體例子可舉出：異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)，四乙基羅丹明(rhoda mine,RIB200)，四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhoda mineisothiocyanate,TRITC)，鑭系元素(銪Eu3、鋱Tb3、鈰Ce3等)螯合物，藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)及其他熒光物質(zhì)(β-半乳糖苷酶、堿性酸酶、辣根過氧化物酶)等。本發(fā)明中可以使用任意一種作為熒光染料，但并不限于這些。
使用生物素作為標記物時，可以使用結(jié)合了酶、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、染色物質(zhì)或放射性物質(zhì)等的鏈霉抗生物素或半抗原抗體等檢測。
信號的檢測可根據(jù)標記物的種類適當(dāng)選擇。例如信號如果是顯色，則可使用比色計或吸光光度計，如果是熒光則可以使用熒光分光光度計，如果是發(fā)光則可以使用光子計數(shù)儀，如果是放射線則可以使用放射線檢測裝置。對于以各種濃度含有DCP的濃度已知的標準樣品，按照本發(fā)明的方法檢測DCP，由來自標記的信號量和標準樣品中DCP的濃度的相關(guān)關(guān)系制圖，繪制標準曲線，對DCP濃度未知的樣品同樣進行檢測操作，檢測來自標記的信號量，將檢測值代入該標準曲線，由此可對樣品中DCP進行定量。
本發(fā)明的方法所適用的樣品是從受試者體內(nèi)分離的樣品，優(yōu)選血液樣品，特別優(yōu)選血漿或血清。根據(jù)本發(fā)明的檢測方法，不管是血漿還是血清，均可穩(wěn)定地檢測DCP含量。根據(jù)需要可適當(dāng)稀釋樣品，以確保在工作濃度范圍內(nèi)進行檢測。
本DCP磁微粒免疫熒光檢測方法所述抗體不是包被在板上，而是用抗體來包被磁微粒，將包被的磁微粒作為試劑使用，更利于定量操作，方便穩(wěn)定且靈敏度更高，在抗體抗原反應(yīng)中能將檢測干擾因素降到最低。
本發(fā)明還提供DCP磁微粒免疫熒光檢測試劑，該試劑包含：磁微粒，DCP抗原，抗DCP抗體，熒光素，偶聯(lián)緩沖液，洗滌緩沖液，洗脫液，封閉液，保存液。
上述DCP磁微粒免疫熒光檢測試劑可以適當(dāng)組合，作為DCP磁微粒免疫熒光檢測試劑盒提供。DCP磁微粒免疫熒光檢測試劑還可以與其它試劑類等適當(dāng)組合，例如，除上述檢測試劑之外，本發(fā)明的檢測試劑盒中還可以進一步含有EP管、樣本稀釋液等。其中，EP管即Eppendorf離心管，為市售商品，可按照常規(guī)方法購買獲得。免疫檢測所必需的其它試劑類是周知的。
本發(fā)明所提供的靈敏快速的DCP磁微粒免疫熒光檢測試劑盒，為DCP的檢測和疾病的早期診斷提供了一種簡便快速，高靈敏度，高準確性，安全無毒，可回收的途徑。檢測試劑盒中包括所述DCP磁微粒免疫熒光檢測試劑，固定在盒內(nèi)的凹槽中。
附圖說明
圖1是表示實施例1中DCP標準品濃度與吸光度的線性關(guān)系的圖表。
具體實施方式
以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，以使用DCP作為目標檢測物的情形為例，具體說明本發(fā)明的DCP磁微粒免疫熒光檢測方法。本發(fā)明并不受這些實施例等的限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。
在本發(fā)明中，當(dāng)給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。
實施例1.DCP磁微粒分離免疫熒光分析檢測試劑的制備
1、DCP抗原的制備
(1)pColdⅡ-DCP表達載體的構(gòu)建
參照GenBank中人DCP的基因序列設(shè)計引物并合成DCP基因，PCR擴增后，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測DCP擴增產(chǎn)物，切下目的條帶，使用膠回收試劑盒回收目的片段。對其用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和HindⅢ雙酶切的原核表達載體pColdⅡ連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli.DH5α中擴增，再轉(zhuǎn)入E.coli.BL21(DE3)感受態(tài)細胞，接種于LB固體培養(yǎng)基中，含氨芐青霉素(Amp)100mg/L，抽取質(zhì)粒，進行NdeⅠ和HindⅢ酶切鑒定和測序。重組質(zhì)粒pColdⅡ-DCP經(jīng)5'NdeⅠ和3'HindⅢ進行雙酶切，出現(xiàn)兩條特異性條帶，位置與pColdⅡ和目的片段的大小一致。測序結(jié)果顯示目標序列與NCBI相應(yīng)序列相符，證實表達載體pCold II-DCP構(gòu)建成功。
(2)DCP融合蛋白的表達及純化
挑取含重組質(zhì)粒pColdⅡ-DCP-BL21的菌落接種于10mL LB培養(yǎng)基(Amp，100mg/L)中，220r/min 37℃搖菌12h，按1:100的比例接種于1000mL的LB培養(yǎng)基(Amp，100mg/L)中，相同條件下培養(yǎng)3h，待菌液達到A600時加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，15℃振搖培養(yǎng)16h，誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌體至50mL無菌離心管，5000r/min 4℃離心10min，棄上清，重懸于20mL lysis buffer(20mmol/L Tris-HCl包含1mmol/L蛋白酶抑制劑混合物，pH 8.0)中，經(jīng)細胞超聲破碎儀破碎(超聲2s、冷卻4s、功率100W)，12000r/min、4℃離心15min。沉淀重懸于lysis buffer(含8mol/L尿素)，并經(jīng)0.22μm濾膜過濾，過Ni-NTA層析柱進行純化；10倍的柱體積lysis buffer(含8mol/L尿素+20mmol/L咪唑)洗滌；用buffer C(20mmol/L Tris-HCl buffer，pH 8.0，含150mmol/L NaCl，8mol/L尿素，250mmol/L咪唑)洗脫目的蛋白。將洗脫的蛋白用含有一定濃度梯度的尿素(6、5、4、2、1mol/L)進行復(fù)性，最終用PBS透析，透析完成后檢測凍干濃縮蛋白濃度為1.5mg/mL。
2、DCP抗體的制備
(1)雜交瘤細胞株的制備
將生長狀態(tài)良好的S p2/0骨髓瘤細胞與免疫小鼠脾細胞以1:10的比例混合，加入50％聚乙二醇進行融合，融合過程按常規(guī)方法進行。用DCP表達蛋白作為檢測抗原，對有融合細胞孔的上清液進行間接ELISA檢測，一抗為細胞培養(yǎng)上清，二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(1:2000稀釋)，TMB顯色檢測篩選陽性細胞克隆株。將篩選的陽性細胞克隆株用有限稀釋法進行單克隆篩選，間接ELISA法檢測，直至陽性率達100％，篩選出穩(wěn)定分泌抗DCP抗體的雜交瘤細胞株進行擴大培養(yǎng)，并凍存于液氮中。
(2)單克隆抗體的制備
選擇BALb/c小鼠，每只腹腔注射滅菌液體石蠟0.5mL，1周后經(jīng)腹腔接種雜交瘤細胞0.5mL(1×106細胞/只)。10～14d后小鼠腹部明顯腫脹收集腹水，12000r/min離心10min，去除上層的脂肪、液體石蠟和沉淀，吸取淡黃色腹水，將腹水經(jīng)Protein A瓊脂糖親和層析柱獲得純化抗體，之后在PBS中進行4℃透析12h，隔日采用BCA法檢測抗體濃度，ELISA法檢測抗體效價，然后加入50％甘油混合，小量分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
DCP磁微粒免疫熒光分析檢測方法及操作步驟
1、磁微粒與目標生物樣品的偶聯(lián)
(1)磁微粒的預(yù)處理
將磁微粒懸浮液反復(fù)顛倒混勻，取50μL置于1.5mL EP管中，加入0.5～1.0mL洗滌緩沖液，洗滌緩沖液為：pH為7.2～7.6的20mM磷酸鈉，150mM氯化鈉，混勻，然后在磁力架上磁性分離，棄上清液。加入1mL洗滌緩沖液懸浮磁微粒，混勻，在磁力架上磁性分離，棄上清液。重復(fù)上一步驟，然后將磁微粒在50μL偶聯(lián)緩沖液中懸浮，偶聯(lián)緩沖液為：pH為8.0～8.2的25mM～50mM碳酸氫銨，待用。
(2)目標生物樣品的偶聯(lián)
將目標生物樣品與磁微粒偶聯(lián)以制備免疫磁微粒時，所用的單克隆抗體或抗原包被液的濃度是影響后期檢測的直接因素，其濃度大小直接影響檢測結(jié)果的準確性和線性范圍。若所用包被液的濃度過低，在后期的免疫反應(yīng)中磁微粒的反應(yīng)效率差，抗原抗體反應(yīng)不完全，使檢測結(jié)果偏低；若所用包被液的濃度過高，會造成昂貴試劑的浪費。因此采用以下方法進行條件優(yōu)化篩選：
取10～15μL需偶聯(lián)的DCP抗體或抗原于盛有2mL粒徑為100～1000nm磁微粒的EP管中，并加入500μL偶聯(lián)緩沖液，偶聯(lián)緩沖液為：pH為8.0～8.2的25mM～50mM碳酸氫銨，混勻。將EP管置于旋轉(zhuǎn)混合儀上孵育。然后將EP管置于磁力架上磁性分離，保留磁微粒及上清液，采用BCA法檢測偶聯(lián)前后抗DCP抗體標準溶液的蛋白含量。所述磁微粒與抗DCP抗體偶聯(lián)條件優(yōu)選為：
磁微粒粒徑120nm、抗體濃度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝11；
磁微粒粒徑180nm、抗體濃度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝10；
磁微粒粒徑200nm、抗體濃度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝11；
磁微粒粒徑300nm、抗體濃度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝10；
磁微粒粒徑500nm、抗體濃度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝11；
或者磁微粒粒徑800nm、抗體濃度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝10。
所述磁微粒與抗DCP抗原偶聯(lián)條件優(yōu)選為：
磁微粒粒徑120nm、抗原濃度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝11；
磁微粒粒徑180nm、抗原濃度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝10；
磁微粒粒徑200nm、抗原濃度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝11；
磁微粒粒徑300nm、抗原濃度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝10；
磁微粒粒徑500nm、抗原濃度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝11；
或者磁微粒粒徑800nm、抗原濃度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝10。
(3)封閉未反應(yīng)的基團
磁微粒偶聯(lián)結(jié)束后，加入500μL封閉液，封閉液為：0.1％的BSA，混勻后將EP管置于旋轉(zhuǎn)混合儀上室溫孵育2～6h或者4℃孵育12～20h，然后將EP管置于磁力架上磁性分離，棄上清液。重復(fù)上一步驟一次。
(4)磁微粒的保存
向已完成生物分子共價偶聯(lián)的磁微粒中加入1mL的保存液，保存液為：pH為9的5mM BST緩沖液，0.05％Tween-20，0.01％NaN3，0.1％BSA，混勻，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2、磁微粒與抗DCP抗體偶聯(lián)效率的檢測
將抗DCP抗體與磁微粒偶聯(lián)后，采用BCA法檢測偶聯(lián)前后抗DCP抗體標準溶液的蛋白含量，計算磁微粒偶聯(lián)效率。結(jié)果表明，加入磁微粒后，溶液蛋白濃度顯著降低，磁微粒表面的基團可與抗DCP抗體發(fā)生偶聯(lián)，以使磁微粒具有生物活性，即具有捕獲抗體或抗原的能力成為免疫磁微粒。磁微粒與抗DCP抗體偶聯(lián)效率為84.78％±7.23。
3、DCP標準曲線的繪制
取FITC標記的抗DCP抗體100μL于EP管中，分別加入DCP標準品各100μL，用0.01mol/L PBS稀釋為10個濃度梯度(0ng/mL，0.2ng/mL，0.4ng/mL，0.8ng/mL，1.6ng/mL，3.2ng/mL，6.4ng/mL，12.8ng/mL，25.6ng/mL，51.2ng/mL)，于室溫旋轉(zhuǎn)孵育2～6h或者4℃孵育12h以上，使DCP抗原抗體充分反應(yīng)。用空白孔調(diào)零，采用熒光分光光度計檢測標準品熒光值，依據(jù)DCP標準品濃度及其熒光值繪制標準曲線，見圖1。
4、DCP含量的檢測
具體操作步驟如下：
(1)取10份人血清樣品200μL，加入2mL偶聯(lián)DCP抗體的磁微粒A，于室溫旋轉(zhuǎn)孵育2～6h或者4℃孵育12～20h，使DCP抗原抗體充分反應(yīng)。
(2)置于磁力架上磁性分離，棄上清液，用洗滌緩沖液清洗磁微粒復(fù)合物，洗滌緩沖液為：pH為7.2～7.6的20mM磷酸鈉，150mM氯化鈉，置于磁力架上磁性分離，棄上清液。
(3)加入100μL洗脫液，洗脫液為：pH為2.5的0.1M甘氨酸，混勻，重懸磁微粒，室溫孵育5min，置于磁力架上磁性分離，保留上清液。
(4)加入2mL FITC標記的抗DCP抗體，于室溫旋轉(zhuǎn)孵育2～6h或者4℃孵育12～20h。加入20mL偶聯(lián)DCP抗原的磁微粒，于室溫旋轉(zhuǎn)孵育2～6h或者4℃孵育12～20h。
(5)置于磁力架上磁性分離，保留上清液，采用熒光分光光度計檢測樣品熒光值，并對照標準曲線計算樣品中DCP含量。
和現(xiàn)有的方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點表現(xiàn)在：
免疫磁微粒具有較高的表面質(zhì)量比，可以結(jié)合更多的抗體或者抗原參加免疫反應(yīng)；
采用兩套磁微粒分別偶聯(lián)抗體及抗原，與常規(guī)的雙抗體夾心法相比，本方法只需要一種對應(yīng)的抗DCP抗體即可完成反應(yīng)，成本較低；
采用熒光標記抗體技術(shù)，將抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合，特異性強、靈敏度高、準確性好。
5、DCP檢測方法的穩(wěn)定性比較
將上述檢測結(jié)果與ELISA法進行對照，結(jié)果顯示二者具有良好的相關(guān)性：采用磁微粒分離免疫熒光分析法檢測DCP的線性范圍為0.1～50.0ng/mL，檢測限為0.1ng/mL，標準曲線的線性回歸方程為y＝2.1069+0.9766x，R2＝0.9995，(其中x為DCP濃度，y為吸光度值)，其檢測下限比ELISA法低50倍。血清樣品DCP含量檢測結(jié)果如下：
注：-表示不能檢出。
6、磁微粒的回收率檢測
將已偶聯(lián)DCP抗體或抗原的磁微粒與洗脫液混合，洗脫液為：pH為2.5的0.1M甘氨酸，充分反應(yīng)后置于磁力架上磁性分離，立即用洗滌緩沖液清洗磁微粒，洗滌緩沖液為：pH為7.2～7.6的20mM磷酸鈉，150mM氯化鈉，除去殘留于磁微粒表面的抗體或抗原，然后加入1mL保存液，保存液為：pH為9的5mM BST緩沖液，0.05％Tween-20，0.01％NaN3，0.1％BSA，混勻，于4℃保存?zhèn)溆?。將抗DCP抗體與回收的磁微粒偶聯(lián)后，采用BCA法檢測偶聯(lián)前后抗DCP抗體標準溶液的蛋白含量，計算得磁微?；厥章蕿?3.99％±8.14。
7、全自動磁微粒分離免疫熒光分析檢測
磁微粒分離檢測的具體實現(xiàn)方法通常有手動和自動兩種形式。手動檢測是指操作人員使用DCP磁微粒免疫熒光檢測試劑、磁力架等耗材和工具，手工完成整個檢測流程。手動分選中用到的磁力架結(jié)構(gòu)比較簡單，主要由支架和產(chǎn)生磁場的永磁鐵組成，起到承托試管并提供外加磁場的作用。磁微粒的孵育、外部磁場的加入與移除、吸附物的清洗與洗脫等各關(guān)鍵步驟都由人工操作完成。手動分選不需要復(fù)雜的設(shè)備，形式靈活、成本較低，適合少量實驗使用。
當(dāng)需要頻繁進行操作且樣本量較大時，采用自動分離檢測法更為方便高效。自動分離法主要利用全自動磁微粒分選儀，操作人員將待分選樣本加入到分選儀中，由分選儀自動完成分離流程。全自動磁性分選儀的分選通量較大，并且一般有多個優(yōu)化的分選程序可供調(diào)用，操作簡單，分選可靠性高。當(dāng)前具有代表性的產(chǎn)品化全自動磁性分選儀有美天旎(MACS)，BD，R&D，StemCell RoboSep和Dynal Bead Retriever等品牌。
本發(fā)明磁微粒分離免疫熒光分析DCP含量的檢測方法，可用于全自動免疫磁珠分選系統(tǒng)，實現(xiàn)全自動分析檢測，具體操作步驟如下：
(1)預(yù)沖autoMACS pro分選儀，準備待測血清樣品、磁微粒A/B、DCP標準品、FITC標記的抗DCP抗體、偶聯(lián)緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫液、封閉液、保存液；
(2)細胞分選策略選擇“陽性分選策略”，標記方式選擇“直接標記”；
(3)取25μL DCP標準品到S1-7號管中，向2個空白管中加入1mL洗滌緩沖液，向離心管中分別加入25μL磁微粒A和50μL熒光標記抗DCP抗體，設(shè)置反應(yīng)程序條件，上機檢測。將檢測結(jié)果與手動檢測法進行對照，結(jié)果顯示二者具有良好的相關(guān)性。
實施例2.DCP磁微粒免疫熒光檢測試劑盒的組成
本發(fā)明根據(jù)本發(fā)明所述方法設(shè)計了一種試劑盒，該試劑盒可以用于DCP的檢測，通過使用該試劑盒，使操作簡單，省時省力，避免了現(xiàn)用現(xiàn)配的繁瑣，同時使操作標準化。
因此本發(fā)明提供一種試劑盒。
本發(fā)明的試劑盒，包括磁微粒，以及任選的以下組分：偶聯(lián)DCP抗體的磁微粒A，偶聯(lián)DCP抗原的磁微粒B，DCP抗原，抗DCP抗體，熒光素，偶聯(lián)緩沖液，洗滌緩沖液，洗脫液，封閉液，保存液，磁力架。
本發(fā)明的另一種試劑盒，包括：偶聯(lián)DCP抗體的磁微粒A，偶聯(lián)DCP抗原的磁微粒B，以及任選的以下組分：DCP抗原，抗DCP抗體，熒光素，偶聯(lián)緩沖液，洗滌緩沖液，洗脫液，封閉液，保存液，磁力架。
其中所述任選為可以不選其中任一組分，也可以選擇其中一或多種組分。
本發(fā)明的試劑盒，是將不同的組分分別盛裝，再一同包裝在同一包裝盒內(nèi)，使用時根據(jù)說明書中描述的方法進行操作。
試劑盒中，偶聯(lián)緩沖液選自：碳酸氫鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、硫酸鹽緩沖液的一種或多種的組合，濃度為1～100mM，pH為8.0～10.0；
洗滌緩沖液選自：甘氨酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、氯化鹽緩沖液的一種或多種的組合，濃度為2～200mM，pH為7.0～8.0；
洗脫液選自：甘氨酸、Tris Buffer、EDTA溶液、IPTG溶液、L-谷氨酸溶液、MES Buffer的一種或多種的組合，濃度為0.01～10M，pH為2.0～3.0；
封閉液選自：BSA、酪蛋白、甘氨酸的一種或多種的組合，濃度為0.05％～5％，pH為8.0～9.0；
保存液選自：BST緩沖液、Tween-20、NaN3、BSA的一種或多種的組合，濃度為1～50mM，pH為8～10。
本發(fā)明的檢測試劑盒，包括：盒體、盒體內(nèi)的試劑，所述試劑為DCP磁微粒免疫熒光檢測試劑，所述盒體內(nèi)部設(shè)有若干試劑槽，所述試劑槽中放置盛有磁微粒的EP管，試劑盒中試劑的量可以是一人份，也可以是多人份。
和現(xiàn)有的方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點表現(xiàn)在：
免疫磁微粒具有較高的表面質(zhì)量比，可以結(jié)合更多的抗體或者抗原參加免疫反應(yīng)；
采用兩套磁微粒分別偶聯(lián)抗體及抗原，與常規(guī)的雙抗體夾心法相比，本方法只需要一種對應(yīng)的抗免疫標志物抗體即可完成反應(yīng)，成本較低；
采用熒光標記抗體技術(shù)，將抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合，特異性強、靈敏度高、準確性好。
綜上所述，本發(fā)明所提供的DCP磁微粒免疫熒光檢測試劑盒具有良好的準確性和特異性且靈敏度高，有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點且具高度產(chǎn)業(yè)化利用價值。
上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。