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一種脫?γ?羧基凝血酶原的檢測(cè)方法、檢測(cè)試劑和檢測(cè)試劑盒與流程

文檔序號(hào):11838297閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種檢測(cè)血漿或血清中DCP含量的方法:所述方法包括以下步驟:

步驟1,表面偶聯(lián)抗DCP抗體的磁微粒A的制備,和表面偶聯(lián)DCP抗原的磁微粒B的制備;

步驟2,熒光標(biāo)記的抗DCP抗體的制備;

步驟3,DCP含量的檢測(cè):血漿或血清樣品和磁微粒A反應(yīng),反應(yīng)完畢將DCP洗脫,加入熒光標(biāo)記的抗DCP抗體孵育,再加入磁微粒B繼續(xù)孵育,然后磁性分離,用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)樣品熒光值,計(jì)算樣品中DCP含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述磁微粒A和磁微粒B的制備,方法如下:將磁微粒制備成磁微粒懸浮液,磁微粒懸浮液與抗DCP抗體或DCP抗原偶聯(lián):將抗DCP抗體或DCP抗原與磁微粒懸浮液混合孵育偶聯(lián),偶聯(lián)后用封閉液封閉,得到偶聯(lián)DCP抗體的磁微粒A和偶聯(lián)DCP抗原的磁微粒B。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,其中,所述與DCP特異性結(jié)合的抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,其中,磁微粒與DCP抗原的偶聯(lián)條件選自如下條件:

磁微粒粒徑120nm、抗原濃度20μg/mL、22℃孵育2h、pH=11;

磁微粒粒徑180nm、抗原濃度20μg/mL、22℃孵育2h、pH=10;

磁微粒粒徑200nm、抗原濃度25μg/mL、25℃孵育4h、pH=11;

磁微粒粒徑300nm、抗原濃度25μg/mL、25℃孵育4h、pH=10;

磁微粒粒徑500nm、抗原濃度30μg/mL、28℃孵育6h、pH=11;

或者磁微粒粒徑800nm、抗原濃度30μg/mL、28℃孵育6h、pH=10。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,其中,磁微粒與抗DCP抗體的偶聯(lián)條件選自如下條件:

磁微粒粒徑120nm、抗體濃度20μg/mL、22℃孵育2h、pH=11;

磁微粒粒徑180nm、抗體濃度20μg/mL、22℃孵育2h、pH=10;

磁微粒粒徑200nm、抗體濃度25μg/mL、25℃孵育4h、pH=11;

磁微粒粒徑300nm、抗體濃度25μg/mL、25℃孵育4h、pH=10;

磁微粒粒徑500nm、抗體濃度30μg/mL、28℃孵育6h、pH=11;

或者磁微粒粒徑800nm、抗體濃度30μg/mL、28℃孵育6h、pH=10。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟如下:

步驟(1)取磁微粒,加入磁微粒體積2~50倍的洗滌緩沖液,混勻,然后在磁力架上磁性分離,棄上清液;重復(fù)上一步驟,然后將磁微粒在與其等量的偶聯(lián)緩沖液中懸浮,得到磁微粒懸浮液;

步驟(2)向抗DCP抗體或DCP抗原中加入體積0.01~1倍的步驟(1)處理的磁微粒懸浮液,加入偶聯(lián)緩沖液,孵育,直至磁微粒偶聯(lián)完全; 磁性分離,保留磁微粒;磁微粒偶聯(lián)結(jié)束后,加入封閉液混勻,孵育,磁性分離,得到偶聯(lián)DCP抗體的磁微粒A和偶聯(lián)DCP抗原的磁微粒B;

步驟(3)熒光標(biāo)記的抗DCP抗體的制備:抗DCP抗體溶解于碳酸鹽緩沖液中,熒光素溶解于DMSO中,將熒光素逐滴緩慢加入抗DCP抗體溶液中,4℃避光攪拌12~20h,用G-25葡聚糖凝膠去除游離的熒光素;

步驟(4)取待測(cè)樣品,加入樣品體積1~100倍的磁微粒A,于室溫旋轉(zhuǎn)孵育2~6h或者4℃孵育12~20h,使DCP抗原抗體充分反應(yīng);置于磁力架上磁性分離,棄上清液,用洗滌緩沖液清洗磁微粒復(fù)合物,置于磁力架上磁性分離,棄上清液;加入與抗體等量的洗脫液,混勻,重懸磁微粒,室溫孵育5min,置于磁力架上磁性分離,保留上清液;加入樣品體積1~100倍的熒光標(biāo)記DCP抗體,于室溫旋轉(zhuǎn)孵育2~6h或者4℃孵育12~20h;加入磁微粒A體積1~100倍的磁微粒B,于室溫旋轉(zhuǎn)孵育2~6h或者4℃孵育12~20h;置于磁力架上磁性分離,保留上清液,采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)樣品熒光值,并對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中DCP含量。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟如下:

(1)取磁微粒置于EP管中,加入磁微粒體積10~20倍的洗滌緩沖液,混勻,然后在磁力架上磁性分離,棄上清液;重復(fù)上一步驟,然后將磁微粒在與其等量的偶聯(lián)緩沖液中懸浮,得到磁微粒懸浮液;

(2)加入磁微粒懸浮液體積0.2~0.3倍的需偶聯(lián)的抗DCP抗體或DCP抗原于盛有磁微粒懸浮液的EP管中,并加入磁微粒懸浮液體積10倍的偶聯(lián)緩沖液,混勻;將EP管置于旋轉(zhuǎn)混合儀上室溫孵育2~6h或者4℃孵育12~20h,直至磁微粒偶聯(lián)完全;將EP管置于磁力架上磁性分離,保留磁微粒;表面偶聯(lián)抗DCP抗體的為磁微粒A,表面偶聯(lián)DCP抗原的為磁微粒B,上清液用于檢測(cè)偶聯(lián)效率;

(3)磁微粒偶聯(lián)結(jié)束后,加入磁微粒懸浮液體積10倍的封閉液,混勻,將EP管置于旋轉(zhuǎn)混合儀上室溫孵育2~6h或者4℃孵育12~20h,將EP管置于磁力架上磁性分離,棄上清液;重復(fù)上一步驟一次;

(4)取待測(cè)血漿或血清樣品,加入樣品體積1~100倍的磁微粒A,于室溫旋轉(zhuǎn)孵育2~6h或者4℃孵育12~20h,使DCP抗原抗體充分反應(yīng);置于磁力架上磁性分離,棄上清液,用洗滌緩沖液清洗磁微粒復(fù)合物,置于磁力架上磁性分離,棄上清液;加入與抗體等量的洗脫液,混勻,重懸磁微粒,室溫孵育5min,置于磁力架上磁性分離,保留上清液;加入樣品體積1~100倍的熒光標(biāo)記DCP抗體,于室溫旋轉(zhuǎn)孵育2~6h或者4℃孵育12~20h;加入磁微粒A體積1~100倍的磁微粒B,于室溫旋轉(zhuǎn)孵育2~6h或者4℃孵育12~20h;置于磁力架上磁性分離,保留上清液,采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)樣品熒光值,并對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中DCP含量。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,其中,

偶聯(lián)緩沖液選自:碳酸氫鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、硫酸鹽緩沖液的一種或多種的組合,濃度為1~100mM,pH為8.0~10.0;

洗滌緩沖液選自:甘氨酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、氯化鹽緩沖液的一種或多種的組合,濃度為2~200mM,pH為7.0~8.0;

洗脫液選自:甘氨酸、Tris Buffer、EDTA溶液、IPTG溶液、L-谷氨酸溶液、MES Buffer的一種或多種的組合,濃度為0.01~10M,pH為2.0~3.0;

封閉液選自:BSA、酪蛋白、甘氨酸的一種或多種的組合,濃度為0.05%~5%,pH為8.0~9.0;

保存液選自:BST緩沖液、Tween-20、NaN3、BSA的一種或多種的組合,濃度為1~50mM,pH為8~10。

9.一種采用權(quán)利要求1方法檢測(cè)DCP的試劑盒,包括:

磁微粒,以及任選的以下組分:偶聯(lián)DCP抗體的磁微粒A,偶聯(lián)DCP抗原的磁微粒B,DCP抗原,抗DCP抗體,熒光素,偶聯(lián)緩沖液,洗滌緩沖液,洗脫液,封閉液,保存液,磁力架。

10.一種采用權(quán)利要求1方法檢測(cè)DCP的試劑盒,包括:

偶聯(lián)DCP抗體的磁微粒A,

偶聯(lián)DCP抗原的磁微粒B,

以及任選的以下組分:DCP抗原,抗DCP抗體,熒光素,偶聯(lián)緩沖液,洗滌緩沖液,洗脫液,封閉液,保存液,磁力架。

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