本發(fā)明屬于魚類分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鑒別真鯛、黑鯛及其雜交后代的引物、試劑盒及鑒別方法。

背景技術(shù)：

真鯛Pagrosomus major屬鱸形目、鯛科、真鯛屬，黑鯛Spraus macrocephalus屬鱸形目、 鯛科、黑鯛屬，它們都是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類。真鯛具有個體大、生長快、肉質(zhì)好、色澤美、抗病能力強(qiáng)等特點，但對鹽度、溫度變化敏感，抗逆性較差；黑鯛對溫度、鹽度適應(yīng)范圍較廣，但生長慢，養(yǎng)成周期長。通過真鯛和黑鯛雜交育種，可以獲得具有雙親優(yōu)良性狀的雜交子代，從而提高鯛魚養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，推動鯛魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。但雜交種形態(tài)又與親本很相似，因此，生產(chǎn)上很容易造成鯛魚種質(zhì)混雜，導(dǎo)致種質(zhì)混雜退化。運用分子生物技術(shù)在DNA水平上尋找不同鯛魚的差異，可以快速、準(zhǔn)確鑒別不同鯛魚，為鯛魚的品種鑒定、種質(zhì)資源保護(hù)和育種等提供重要依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種鑒別真鯛、黑鯛及其雜交后代的引物、試劑盒及鑒別方法，有助于快速、準(zhǔn)確鑒別真鯛、黑鯛及其雜交后代，在鯛魚種質(zhì)鑒定、保種和選育中有極大的應(yīng)用價值。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種用于鑒別真鯛、黑鯛及其雜交后代的擴(kuò)增引物，該引物的正義引物序列為：5′GACGATTATGATGATGGCCACTGAAC 3′，反義引物為：5′ CTCCCCATCCACCTGGACGAC 3′。

一種用于鑒別真鯛、黑鯛及其雜交后代的試劑盒，該試劑盒含A試劑和B試劑，其中

A試劑的組成如下：

2×反應(yīng)緩沖液；

Mg²⁺ 4 mmol/L；

Taq酶 0.05U/μL

dNTP 400μmol/L；

正義、反義擴(kuò)增引物各0.4μmol/L；

擴(kuò)增引物：該引物的正義引物序列為：5′GACGATTATGATGATGGCCACTGAAC 3′，反義引物為：5′ CTCCCCATCCACCTGGACGAC 3′；

B試劑的組成如下：

TaaI內(nèi)切酶 1U/μL；

2×buffer Tango 。

所述的試劑盒鑒別真鯛、黑鯛及其雜交后代的方法，包括以下步驟：

步驟一，采集待鑒別的鯛魚樣品，提取基因組DNA；

步驟二，以步驟一得到的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

步驟三，對步驟二的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切與電泳檢測；

步驟四，通過步驟三的電泳結(jié)果鑒別真鯛、黑鯛及其雜交后代，其中真鯛有3條條帶，分別為147bp，133 bp和71 bp；黑鯛有2條條帶，分別為231 bp和153 bp；雜交鯛有4條條帶，分別為231 bp，153 bp，133 bp和71 bp。

所述的鑒別真鯛、黑鯛及其雜交后代的方法，其步驟二中PCR擴(kuò)增體系為：PCR體系總體積20 μL，其中含權(quán)利要求2所述的試劑盒A試劑10μL ，DNA模板 100 ng～200 ng，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積，最終PCR體系各組份的含量為：1×反應(yīng)緩沖液，Mg²⁺ 2 mmol/L，dNTP 200μmol/L，上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.025U/μL，DNA模板 5～10ng/μL。

所述的鑒別真鯛、黑鯛及其雜交后代的方法，步驟二中PCR擴(kuò)增條件為：94℃ 2min；94℃ 40s，60℃退火 40s，72℃ 40min，30個循環(huán)；72℃ 延伸5 min，4℃保存。

所述的鑒別真鯛、黑鯛及其雜交后代的方法，步驟三中酶切體系為：酶切體系總體積20 μL，其中含權(quán)利要求2所述的試劑盒B試劑10μL，步驟二中PCR反應(yīng)產(chǎn)物10μL，最終酶切體系各組份的含量為：PCR反應(yīng)產(chǎn)物0.5μL/μL ，1×buffer Tango，TaaI內(nèi)切酶0.5U/μL；65℃酶切2～16 h。

所述的鑒別真鯛、黑鯛及其雜交后代的方法，其特征在于，步驟三中電泳為瓊脂糖凝膠電泳。

本發(fā)明的有益效果：運用本發(fā)明所述的方法，可以在分子水平快速準(zhǔn)確地同時將真鯛、黑鯛及其雜交后代區(qū)別開來，可以檢測真鯛或黑鯛是否存在種質(zhì)混雜。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中真鯛、黑鯛及其雜交后代PCR產(chǎn)物酶切電泳結(jié)果，

其中M：分子量標(biāo)準(zhǔn)DL1000 DNA Marker

1-8：真鯛和黑鯛雜交后代

9-16：真鯛

16-24：黑鯛

圖2為本發(fā)明實施例2中待檢真鯛PCR產(chǎn)物酶切電泳檢測結(jié)果，

其中M：分子量標(biāo)準(zhǔn)DL1000 DNA Marker

1-12：待檢真鯛

13-18：真鯛和黑鯛雜交后代；

圖3為本發(fā)明實施例3中待檢真鯛，黑鯛PCR產(chǎn)物酶切電泳檢測結(jié)果，

其中M：分子量標(biāo)準(zhǔn)DL1000 DNA Marker

1-6：真鯛和黑鯛雜交后代

7-13：真鯛

14-21：黑鯛。

具體實施方式

下列實施例中基因組DNA參照文獻(xiàn)提?。ㄋ_姆布魯克J，拉塞爾D W著. 分子克隆試驗指南 [M]. 3版.黃培堂，王嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等，譯.北京：科學(xué)出版社，2002：463-471）。

實施例1

種類確定的真鯛、黑鯛及其雜交后代各8尾共24個樣品，從江蘇省海洋水產(chǎn)研究所呂四基地采得。每尾魚取30μL血細(xì)胞抽提基因組DNA，分別以提取得到的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正義引物為：5′GACGATTATGATGATGGCCACTGAAC 3′（SEQ ID NO.1），反義引物為：5′ CTCCCCATCCACCTGGACGAC 3′（SEQ ID NO.2），PCR體系總體積20 μL，其中含1×反應(yīng)緩沖液，Mg²⁺ 2 mmol/L，dNTP 200μmol/L，上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.5U，DNA模板 100 ng～200 ng，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 2min；94℃ 40s，60℃退火 40s，72℃ 40min，30個循環(huán)；72℃ 延伸5 min，4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，每個樣取PCR反應(yīng)產(chǎn)物7μL用1.5％的瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果都擴(kuò)出1條380bp左右的目的條帶。在剩余的PCR反應(yīng)產(chǎn)物中，每個樣品配制總體積20μL酶切體系，含PCR反應(yīng)產(chǎn)物10μL，1×buffer Tango，TaaI內(nèi)切酶10U，滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積， 65℃酶切12 h后，酶切產(chǎn)物用3%的瓊脂糖電泳拍照記錄電泳結(jié)果。如圖1所示電泳檢測發(fā)現(xiàn)，真鯛都有3條條帶，大小分別為147bp，133 bp和71 bp；黑鯛都有2條條帶，分別為231 bp和153 bp；雜交鯛都有4條條帶，分別為231 bp，153 bp，133 bp和71 bp。由電泳圖譜可將真鯛、黑鯛及其雜交后代區(qū)別開來。

實施例2

待檢真鯛12尾，以真鯛和黑鯛雜交鯛魚6尾做對照，剪取每尾魚尾鰭并抽提基因組DNA，采用如實施例1所述的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增、檢測、再酶切，酶切產(chǎn)物用3%的瓊脂糖電泳拍照記錄電泳結(jié)果。如圖2所示電泳檢測發(fā)現(xiàn)，待檢12尾真鯛都有3條條帶，大小分別為147bp，133 bp和71 bp；6尾真鯛和黑鯛雜交鯛魚都有4條條帶，分別為231 bp，153 bp，133 bp和71 bp。由電泳圖譜可判定：所檢測的12尾鯛魚均為真鯛。

實施例3

待檢真鯛7尾，黑鯛8尾，以真鯛和黑鯛雜交鯛6尾做對照。每尾魚取30μL血細(xì)胞并抽提基因組DNA。采用如實施例1所述的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增、檢測、再酶切，酶切產(chǎn)物用3%的瓊脂糖電泳拍照記錄電泳結(jié)果。如圖3所示電泳檢測發(fā)現(xiàn)，6尾真鯛和黑鯛雜交鯛魚都有4條條帶，分別為231 bp，153 bp，133 bp和71 bp；待檢7尾真鯛都有3條條帶，大小分別為147bp，133 bp和71 bp；待檢8尾黑鯛都有2條條帶，分別為231 bp和153 bp由電泳圖譜可判定：所檢測的7尾真鯛，8尾黑鯛都為純種，沒有種質(zhì)混雜。

實施例4

按照本發(fā)明的方法設(shè)計一種試劑盒，該試劑盒用來鑒別真鯛、黑鯛及其雜交后代，該試劑盒含A試劑和B試劑。

A試劑的組成如下：

2×反應(yīng)緩沖液；

Mg²⁺ 4 mmol/L；

Taq酶 0.05U/μL

dNTP 400μmol/L；

正義、反義擴(kuò)增引物各0.4μmol/L；

擴(kuò)增引物：該引物的正義引物序列為：5′GACGATTATGATGATGGCCACTGAAC 3′，反義引物為：5′ CTCCCCATCCACCTGGACGAC 3′；

B試劑的組成如下：

TaaI內(nèi)切酶 1U/μL；

2×buffer Tango 。

使用以上試劑盒鑒別真鯛、黑鯛及其雜交后代的方法如下：

步驟一，采集待鑒別的鯛魚樣品，提取基因組DNA；

步驟二，以步驟一得到的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：PCR體系總體積20 μL， PCR體系總體積20 μL，取步驟一得到的DNA為模板2μL，A試劑10μL，滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積，最終PCR體系各組份的含量為：1×反應(yīng)緩沖液，Mg²⁺ 2 mmol/L，dNTP 200μmol/L，上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.025U/μL，DNA模板 5～10ng/μL。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，每個樣取PCR反應(yīng)產(chǎn)物7μL用1.5％的瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測。

步驟三，對步驟二的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切與電泳檢測。其中酶切體系總體積20 μL，其中含B試劑10μL，步驟二中PCR反應(yīng)產(chǎn)物10μL，最終酶切體系各組份的含量為：PCR反應(yīng)產(chǎn)物0.5μL/μL ，1×buffer Tango，TaaI內(nèi)切酶0.5U/μL；65℃酶切2～16 h。

步驟四，通過步驟三的電泳結(jié)果鑒別真鯛、黑鯛及其雜交后代，其中真鯛有3條條帶，分別為147bp，133 bp和71 bp；黑鯛有2條條帶，分別為231 bp和153 bp；雜交鯛有4條條帶，分別為231 bp，153 bp，133 bp和71 bp。

序列表

<110> 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇省海洋水產(chǎn)研究所

<120> 一種鑒別真鯛、黑鯛及其雜交后代的引物、試劑盒及鑒別方法

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gacgattatg atgatggcca ctgaac 26

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctccccatcc acctggacga c 21