本發(fā)明涉物種鑒定領(lǐng)域，具體地說是一種花生物種特異性的基因序列，以及基于該基因序列的特異性引物組合，用于特異地檢測花生成分。

背景技術(shù)：

花生(學(xué)名：Arachis hypogaea，英文名稱：peanut)，原名落花生，為屬薔薇目，豆科一年生草本植物。花生(Arachis hypogaea)是花生屬(Arachis)唯一的栽培種?；ㄉ鞘秤玫鞍缀透哔|(zhì)量的食用油的重要來源，也是中國最重要的油料作物之一?；ㄉ屎土扛摺I養(yǎng)豐富(含油45～55％；蛋白質(zhì)27～30％；碳水化合物6～23％；纖維素2％)，油粕蛋白質(zhì)含量達(dá)50％，還含有豐富的維生素E和B，是良好飼料?；ㄉ蔬€可進(jìn)一步制成花生奶粉、酸奶酪、糕點和膨化食品等。花生莖葉是良好飼料，含蛋白10～20％，木質(zhì)化程度低，并含豐富鈣和磷。花生果殼含纖維素70～80％，經(jīng)發(fā)酵后可作飼料，還可制成板材、膠粘劑、醬油、活性炭及化工原料。紅皮花生的種皮是一種中藥，有良好止血作用。

另一方面，花生是最容易感染黃曲霉的農(nóng)作物之一，黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉的代謝產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的毒性和致癌性，而且黃曲霉毒素耐熱，在一般烹調(diào)加工的溫度下破壞很少。因此應(yīng)避免食用霉變后的花生。此外，花生還是重要的食物過敏原，可能會引起極其嚴(yán)重的過敏癥?；ㄉ^敏的癥狀包括：血壓降低、面部和喉嚨腫脹，這些都會阻礙呼吸，從而導(dǎo)致休克。因此，含有花生成分的食品應(yīng)明確標(biāo)識。

對于多組分的農(nóng)產(chǎn)品，經(jīng)過加工后，從外觀通常難以辨別。市場上很多不法商販為了獲取高額利潤，經(jīng)常以低價值的產(chǎn)品混入或冒充高價值的產(chǎn)品，比如將大豆油摻入花生油中，將大豆粉摻入花生醬中。另一方面將花生醬摻入芝麻醬，而花生醬極易感染黃曲霉，從而對消費者的健康帶來危害。因此建立一種可以特異地檢測花生成分的方法，有助于花生成分的鑒定，防止攙假使雜，保護(hù)消費者利益和健康。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種花生DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測基因及其檢測方法，以該基因序列為檢測靶標(biāo)，篩選出可以特異地鑒定花生的引物組合，用于特異地檢測花生成分。

實現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為：

一種花生DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測基因在檢測花生物種中的用途，所述的花生DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

一種花生DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測基因所使用的PCR引物對F1/R1，所述的PCR引物對F1/R1用于擴(kuò)增權(quán)利要求1中的花生DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測基因，引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：gcgtggatga ggagatagcc；

引物R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：gtcttggtgg ttggcgttgt。

一種花生物種的分子鑒定方法，包括以下步驟：1)、從待測樣品中提取目標(biāo)DNA；

2)、以目標(biāo)DNA為模板用權(quán)利要求2中所述的引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以無菌水為PCR空白對照，以花生基因組DNA為PCR陽性對照；

3)、將步驟2)中PCR擴(kuò)增出的基因片段用瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，滿足以下條件則說明PCR擴(kuò)增結(jié)果可靠：空白對照擴(kuò)增無任何帶型，陽性對照有位于165bp的清晰、單一條帶；

4)、判斷目標(biāo)DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物中是否特異性擴(kuò)增出165bp的條帶，若能擴(kuò)增出，則說明目標(biāo)DNA中含有花生DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測基因，即可判斷所檢測樣品中含有花生成分。

不同物種由于獨立進(jìn)化的結(jié)果，它們在遺傳、生理和品質(zhì)等方面各具特色。利用不同物種特有的DNA序列可以開發(fā)成能夠識別和定量不同物種及其加工產(chǎn)品的標(biāo)記。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：在GenBank中檢索花生的基因序列，分析基因信息，優(yōu)先選擇具有完整序列和信息的基因組序列和cDNA序列。然后將選擇的序列進(jìn)行Blastn分析，選擇特異性強(qiáng)、相似序列少的花生基因序列。以特異性強(qiáng)的基因序列為檢測靶標(biāo)，設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析。最終篩選出來的引物組合具有以下特征：1、擴(kuò)增條帶清晰、單一；2、在所有的花生品種中均有相同的擴(kuò)增條帶；3、在其他花生近緣種、常見的作物中均沒有擴(kuò)增。

本發(fā)明提供了一種特異地檢測花生成分的方法，有助于花生成分的鑒定，防止攙假使雜。與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法相比，本發(fā)明獲得的基因序列有利于實現(xiàn)花生的分子鑒定，能有效縮短花生的鑒定時間。

附圖說明

圖1是實施例中分別對16種不同花生品種的基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果圖；

圖2為實施例中分別對花生和16種非花生品種的基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果圖；

圖3為實施例中花生擴(kuò)增的靈敏度檢測圖；

圖4為實施例中檢測不同樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做詳細(xì)具體的說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于以下實施例。

本實施例中所提供的花生DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

該基因能夠用于花生物種的分子鑒定中。

本實施例中同時提供了用于PCR擴(kuò)增上述花生DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測基因的引物對F1/R1，引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：gcgtggatga ggagatagcc；引物R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：gtcttggtgg ttggcgttgt。

本實施例提供的花生物種的分子鑒定方法具體包括以下步驟：1)、從待測樣品中提取目標(biāo)DNA；

2)、以目標(biāo)DNA為模板用權(quán)利要求2中所述的引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以無菌水為PCR空白對照，以花生基因組DNA為PCR陽性對照；

3)、將步驟2)中PCR擴(kuò)增出的基因片段用瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，滿足以下條件則說明PCR擴(kuò)增結(jié)果可靠：空白對照擴(kuò)增無任何帶型，陽性對照有位于165bp的清晰、單一條帶；

4)、判斷目標(biāo)DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物中是否特異性擴(kuò)增出165bp的條帶，若能擴(kuò)增出，則說明目標(biāo)DNA中含有花生DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測基因，即可判斷所檢測樣品中含有花生成分。

以下為本發(fā)明的具體檢測實施例。

實施例1

1.實驗材料

1.1植物材料

進(jìn)行試驗的16個不同花生品種(7596，7519，7602，7607，7613，21016，21399，21513，21134，21088，21282，21127，21020，21387，21065，中花5號)；

以及其他16種不同種屬的材料分別有：油菜，大豆，芝麻，向日葵，油棕，棉花，水稻，玉米，豇豆，豌豆，馬鈴薯，蘿卜，辣椒，茄子，擬南芥，煙草。

1.2酶與試劑

分子生物學(xué)試劑，TAKARA Taq DNA聚合酶，10×PCR緩沖液，dNTP Mixture(10mM)，MgCl₂購自大連寶生物公司。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3實驗儀器

PCR擴(kuò)增儀：DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler(Bio-Rad,USA)；

核酸電泳儀：DYYIII型YY0115-94(北京六一儀器廠)；

凝膠成像系統(tǒng)：Gel Doc XR System(Bio-Rad,USA)；

其它儀器包括：恒溫水浴鍋、電子天平、離心機(jī)、渦旋儀、純水儀、恒溫培養(yǎng)箱等。

2.實驗方法

2.1植物基因組DNA的提取

植物基因組DNA采用QIANGEN公司的DNA小量提取試劑盒DNeasy Plant Mini Kit(貨號69104)，具體操作如下：

2.1.1、粉碎樣品，取樣100mg。

2.1.2、加入400uL bufferAP1和4uLRNaseA。渦旋混勻。65℃水浴10分鐘。期間混勻2-3次。

2.1.3、加入130uL buffer AP2?；靹?。冰上放置5分鐘。14000rpm離心5min。

2.1.4、將裂解液轉(zhuǎn)入QIAshredder Mini spin coLumn，用自帶的2mL離心管作為收集管。14000rpm離心2min。

2.1.5、將收集液轉(zhuǎn)入一個新的自備的離心管，加1.5倍體積的BufferAP3/E。吹打混勻。

2.1.6、取650uL混合液到DNeasy Mini spin column(柱子最多承受650uL的體積，因此混合液需離心兩次)，用自帶的2mL離心管作為收集管。8000rpm離心1min，對剩余的樣品同樣操作。

2.1.7、將柱子置于新的2mL離心管，用500uL buffer AW洗脫，8000rpm離心1min，棄洗脫液。

2.1.8、再用500uL buffer AW洗脫，1400rpm離心2min，棄洗脫液。

2.1.9、將柱子置于新的1.5或2mL離心管中，加入100uL洗脫液Buffer AE。室溫放置5min。14000rpm離心1min。重復(fù)步驟9。

2.2PCR擴(kuò)增

以上述植物材料的基因組DNA為模板，以能特異性鑒定花生的引物組合F1/R1為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min；94℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。

PCR反應(yīng)體系為：20ng/μL DNA模板1μL，10×PCR緩沖液2.5μL，25mM MgCl₂2.0μL，10mM dNTP 0.5μL，10μM正、反向引物各0.25μL，DNA聚合酶0.5U，ddH₂O補(bǔ)足至25μL。

3.實驗結(jié)果

PCR擴(kuò)增均以無菌水為空白對照，以花生基因組DNA為陽性對照，只有當(dāng)空白對照擴(kuò)增無任何帶型，陽性對照有與理論相符的清晰、單一條帶(條帶大小為165bp)則說明PCR結(jié)果可靠。

如圖1所示，利用本發(fā)明的引物組合對16個花生品種基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(泳道M是NEB#M3233V DNA ladder，泳道1為水的空白對照，2-17分別為花生7596，7519，7602，7607，7613，21016，21399，21513，21134，21088，21282，21127，21020，21387，21065，中花5號)，均擴(kuò)增出清晰、單一條的165bp條帶。表明本發(fā)明公布的基因片段及檢測方法在花生品種中具有較好的物種內(nèi)穩(wěn)定性。如圖2所示，選取16個花生近緣種和常見作物，利用本發(fā)明的引物組合對這16種基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(泳道M是NEB#M3233V DNA ladder，泳道1為陽性對照，泳道2-17分別為油菜，大豆，芝麻，向日葵，油棕，棉花，水稻，玉米，豇豆，豌豆，馬鈴薯，蘿卜，辣椒，茄子，擬南芥，煙草)，結(jié)果只有以花生基因組DNA為陽性對照的泳道有清晰、單一條帶。其他泳道均無任何帶型，表明本發(fā)明公布的基因片段及檢測方法在花生品種中具有較好的物種間特異性。如圖3所示，將花生基因組DNA用水梯度稀釋至100ng/uL，10ng/uL，1ng/uL，0.1ng/uL，0.05ng/uL和0.01ng/uL，利用本發(fā)明的引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果當(dāng)DNA濃度低至0.05ng/uL時仍有清晰可見的條帶(泳道M是NEB#M3233V DNA ladder，泳道1-6分別為100ng，10ng，1ng，0.1ng，0.05ng，和0.01ng花生基因組DNA，泳道7為空白對照)，表明本發(fā)明公布檢測方法可檢測基因組DNA含量低至0.05ng/uL的樣品，靈敏度較高。

實施例2

1.實驗材料

1.1植物材料

花生醬(四季寶牌)，混合芝麻醬(六必居牌)，芝麻醬(市售)，花生糖(大白兔牌)，炒芝麻(市售)。

1.2酶與試劑

分子生物學(xué)試劑，TAKARA Taq DNA聚合酶，10×PCR緩沖液，dNTP Mixture(10mM)，MgCl₂購自大連寶生物公司。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3實驗儀器

PCR擴(kuò)增儀：DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler(Bio-Rad,USA)；

核酸電泳儀：DYYIII型YY0115-94(北京六一儀器廠)；

凝膠成像系統(tǒng)：Gel Doc XR System(Bio-Rad,USA)；

其它儀器包括：恒溫水浴鍋、電子天平、離心機(jī)、渦旋儀、純水儀、恒溫培養(yǎng)箱等。

2.實驗方法

2.1植物基因組DNA的提取

植物基因組DNA采用QIANGEN公司的DNA小量提取試劑盒DNeasy Plant Mini Kit(貨號69104)，具體操作如下：

2.1.1、粉碎樣品，取樣100mg。

2.1.2、加入400uL bufferAP1和4uLRNaseA。渦旋混勻。65℃水浴10分鐘。期間混勻2-3次。

2.1.3、加入130uL buffer AP2。混勻。冰上放置5分鐘。14000rpm離心5min

2.1.4、將裂解液轉(zhuǎn)入QIAshredder Mini spin coLumn，用自帶的2mL離心管作為收集管。14000rpm離心2min

2.1.5、將收集液轉(zhuǎn)入一個新的自備的離心管，加1.5倍體積的BufferAP3/E。吹打混勻。

2.1.6、取650uL混合液到DNeasy Mini spin column(柱子最多承受650uL的體積，因此混合液需離心兩次)，用自帶的2mL離心管作為收集管。8000rpm離心1min，對剩余的樣品同樣操作。

2.1.7、將柱子置于新的2mL離心管，用500uL buffer AW洗脫，8000rpm離心1min， 棄洗脫液。

2.1.8、再用500uL buffer AW洗脫，1400rpm離心2min，棄洗脫液。

2.1.9、將柱子置于新的1.5或2mL離心管中，加入100uL洗脫液Buffer AE。室溫放置5min。14000rpm離心1min。重復(fù)步驟9。

2.2PCR擴(kuò)增

以1.1中植物材料的基因組DNA為模板，以能特異性鑒定花生的引物組合F1/R1為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min；94℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。

PCR反應(yīng)體系為：20ng/μL DNA模板1μL，10×PCR緩沖液2.5μL，25mM MgCl₂2.0μL，10mM dNTP 0.5μL，10μM正、反向引物各0.25μL，DNA聚合酶0.5U，ddH₂O補(bǔ)足至25μL。

3.實驗結(jié)果

PCR擴(kuò)增均以無菌水為空白對照，以花生基因組DNA為陽性對照，只有當(dāng)空白對照擴(kuò)增無任何帶型，陽性對照有與理論相符的清晰、單一條帶(條帶大小為165bp)則說明PCR結(jié)果可靠。

實驗結(jié)果如圖4所示，泳道M是NEB#M3233V DNA ladder，泳道1為空白對照，泳道2為陽性對照，泳道3-7分別為花生醬(四季寶牌)、混合芝麻醬(六必居牌)、芝麻醬(市售)、花生糖(大白兔牌)、炒芝麻(市售)。含有花生成分的樣品包括：花生醬(四季寶牌)、混合芝麻醬(六必居牌)、芝麻醬(市售)、花生糖(大白兔牌)均檢測到與陽性對照相同的條帶，不含有花生成分的樣品均無擴(kuò)增。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的基于花生特異性序列的引物組合能夠準(zhǔn)確鑒定出樣品中的花生成分。

以上所述僅為本發(fā)明的具體實施方案的詳細(xì)描述，并不以此限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的設(shè)計思路上所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。