本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種分子靶向氮雜芳香環(huán)軸向取代酞菁配合物及其制備方法。

背景技術(shù)：

目前癌癥的治療方法眾多，而光動(dòng)力治療因其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)逐漸成為了一個(gè)熱門研究領(lǐng)域。光動(dòng)力治療是指利用光敏劑在一定波長(zhǎng)光的激發(fā)下產(chǎn)生光動(dòng)力效應(yīng)從而進(jìn)行疾病的診斷和治療。

其作用過程是將一定劑量的光敏劑注入人體，經(jīng)過一定時(shí)間后光敏劑在一定程度上選擇性富集于病變組織，然后用一定波長(zhǎng)的光照射病變組織，光敏劑會(huì)在光的激發(fā)下進(jìn)行一系列的光物理、光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧，進(jìn)而殺死病變細(xì)胞，達(dá)到治療疾病的目的。光敏劑是光動(dòng)力治療中的核心物質(zhì)，而酞菁類化合物被認(rèn)為是最具潛力的第二代光敏劑。分子靶向治療是近年來腫瘤學(xué)科研究的熱點(diǎn)，其中分子靶點(diǎn)藥物備受關(guān)注，它是指利用腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間分子生物學(xué)上的差異，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖，最后導(dǎo)致其死亡的一類藥物，長(zhǎng)期以來，為了克服細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物選擇性差，毒性大的弊端，科研人員一直在努力尋找能特異識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞的藥物。隨著腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，針對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的分子靶點(diǎn)藥物逐漸成為研究的焦點(diǎn)。

近年來，光動(dòng)力治療開始嘗試將光敏劑與其他抗癌藥物偶聯(lián)來提高治療的效果，目前與普通化療抗癌藥物的聯(lián)合的有順鉑，他莫昔芬等。N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉丙氧基)喹唑啉-4-胺是一種4-苯胺基喹唑啉類抗癌新藥，它是一種選擇性表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑，通過抑制EGFR酪氨酸激酶活性而妨礙腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管的生成，并增加腫瘤細(xì)胞的凋亡，此藥目前正在臨床上推廣應(yīng)用。

基于分子靶點(diǎn)藥物治療和光動(dòng)力治療機(jī)制，本發(fā)明提出了構(gòu)建光敏劑與分子靶點(diǎn)藥物活性結(jié)構(gòu)域軛合得到配合物的構(gòu)想，即利用靶點(diǎn)藥物的靶向性、光動(dòng)力治療的高殺傷力及酞菁化合物低消除速率的特點(diǎn)，探索N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉-4-丙氧基)喹唑啉-4-胺—酞菁配合物的構(gòu)效關(guān)系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種分子靶向氮雜芳香環(huán)軸向取代酞菁配合物，該配合物結(jié)構(gòu)單一，組成確定，不存在異構(gòu)體，產(chǎn)品容易提純；同時(shí)該配合物不容易聚集，有利于提高細(xì)胞攝取率。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種分子靶向氮雜芳香環(huán)軸向取代酞菁配合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

，其中M為Si、Al、Ti或Sn，

R_1，R₂取如下任意結(jié)構(gòu)之一：

， 或Cl，

其中 n=2-8。

該分子靶向氮雜芳香環(huán)軸向取代酞菁配合物的制備方法包括如下具體步驟：

（1）將化合物1 ；n=2-8和對(duì)甲苯磺酰氯按摩爾比4:1加入到250mL的圓底燒瓶中，然后加入溶劑CH₂Cl₂，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，再加入三乙胺，室溫反?yīng)8-12h；反應(yīng)結(jié)束后，分別用1mol/L鹽酸溶液、飽和氯化鈉溶液萃取三次，將CH₂Cl₂旋蒸干，隨后以二氯甲烷和甲醇為洗脫劑，硅膠柱層析分離得到化合物2 ；n=2-8；

（2）將N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉-4-丙氧基)喹唑啉-4-胺和化合物2按摩爾比為1:1~3加入100mL的圓底燒瓶中，然后依次加入無水碳酸鉀和DMF溶劑，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，溫度為70℃~90℃反應(yīng)3-10h，反應(yīng)結(jié)束后旋蒸除去溶劑，再用二氯甲烷和飽和氯化鈉混合溶液萃取三次，旋干除去二氯甲烷，再以二氯甲烷、甲醇為洗脫劑，硅膠柱層析分離得到化合物3；

（3）將1,3-二亞氨基異吲哚啉和四氯化硅按摩爾比4：1加入100mL三口圓底燒瓶中，再向其中加入喹啉溶劑，在220℃下回流1.5-2h，反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸除去溶劑，過濾；將濾餅用喹啉、甲苯、甲醇和丙酮的混合溶液洗滌，抽濾，干燥后得到化合物4；

（4）將化合物4和化合物3按摩爾比為1:2~6加入 100mL的圓底燒瓶中，然后加入氫化鈉，再向其中加入甲苯溶劑，溫度為120℃回流1-2d，反應(yīng)結(jié)束后旋蒸除去溶劑，再以用乙酸乙酯和甲醇為洗脫劑，中性氧化鋁分離得到分子靶向抗癌氮雜芳香環(huán)軸向取代酞菁配合物。

所得分子靶向氮雜芳香環(huán)軸向取代酞菁配合物用于制備抗腫瘤藥物。

酞菁類化合物被認(rèn)為是最具潛力的第二代光敏劑。但是由于其在靶細(xì)胞及靶組織中的缺乏靶向性，在實(shí)際應(yīng)用中仍存在缺陷。本發(fā)明中設(shè)計(jì)的分子靶向氮雜芳香環(huán)軸向取代酞菁配合物是利用第二代光敏劑可化學(xué)剪裁和嫁接的特征，在其分子上鍵聯(lián)某些生物特性的活性結(jié)構(gòu)單元，期望利用分子靶向藥物提高酞菁光敏劑對(duì)腫瘤組織的靶向性。該方案既解決N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉-4-丙氧基)喹唑啉-4-胺的耐藥性問題，也提高酞菁配合物靶向性不強(qiáng)問題，使N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉-4-丙氧基)喹唑啉-4-胺可以對(duì)殘留或零星分布在腫瘤組織周圍的病變細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期抑制、滅活，大大降低治療后腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于：

（1）目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)單一，不存在異構(gòu)體，產(chǎn)物容易純化；

（2）所合成的化合物中引入聚乙二醇鏈，提高了光敏劑的生物相溶性，有利于作為光動(dòng)力臨床用藥的使用；

（3）合成方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)容易實(shí)現(xiàn)，副反應(yīng)少，原料低廉，成本低，有利于工業(yè)化生產(chǎn)；

（4）明顯增強(qiáng)了光敏劑的靶向性，光動(dòng)力活性較高。

附圖說明：

圖1：無光照條件下對(duì)HepG2細(xì)胞的劑量依賴曲線。

圖2：在光照條件下對(duì)HepG2細(xì)胞的劑量依賴曲線。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1（M=Si，n=4）

（1）在裝有磁力攪拌裝置、導(dǎo)氣管裝置和回流冷凝裝置的250mL圓底燒瓶中依次加入稱好的23.29 g（0.12 mol）三縮四乙二醇、15.18 g（0.15 mol）三乙胺和50 mL二氯甲烷，然后將5.72 g（0.03 mol）對(duì)甲苯磺酰氯溶解100 mL的二氯甲烷中，并裝在恒壓滴液漏斗中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將對(duì)甲苯磺酰氯溶液緩慢滴加至反應(yīng)瓶中，然后在室溫下，攪拌反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后，先用1 mol/L的鹽酸溶液和飽和的氯化鈉溶液分別萃取三次，收集有機(jī)層，再減壓蒸餾除去二氯甲烷；所得粗產(chǎn)物用干法上樣過硅膠柱，所用展開劑為石油醚：乙酸乙酯=1：1的混合溶液，得到淡黃色粘稠狀的液體（即化合物2a）約8.35 g，產(chǎn)率為80％；

（2）在裝有磁力攪拌裝置、導(dǎo)氣管裝置和回流冷凝裝置的100mL圓底燒瓶中依次加入2.01 g（4.50 mmol) N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉-4-丙氧基)喹唑啉-4-胺、2.35 g（6.75 mmol）化合物2，及2.48 g（18.00 mmol）無水碳酸鉀，再向其中加入15 mL DMF溶劑，90 ℃下反應(yīng)6 h，反應(yīng)結(jié)束后，旋干；向粗產(chǎn)物中加入二氯甲烷和飽和食鹽水萃取，再用二氯甲烷萃取三次后，收集有機(jī)層減壓旋干，得到化合物3a的粗產(chǎn)品，然后再以CH₂Cl₂:CH₃OH=30:1的混合溶液為展開劑過硅膠柱，收集得到淡黃色粘稠狀的液體（即化合物3a）0.98 g，產(chǎn)率為35％。¹H NMR (400 MHz，CDCl₃):δ 7.79 (s，1H，Ar-H)，7.75 (s，1H，Ar-H)，7.17-7.15 (m，1 H，Ar-H)，，7.05-7.00 (m，1 H，Ar-H)，6.95-6.93 (m，1 H，Ar-H)，6.61 (s，1 H，Ar-H)，4.18(t，J=12.0 Hz，2 H，CH₂)，4.09(t，J=8.0 Hz，2 H，CH₂)，3.92(s，3 H，CH₃)，3.75(t，J=8.0 Hz，2 H，CH₂)，3.67(t，J=8.0 Hz，4 H，CH₂)，3.59-3.57 (m，2 H，CH₂)，3.53-3.50(m，8H，CH₂)，3.49-3.46(m，2 H，CH₂)，3.21(s，1H，OH)，2.50-2.43 (m，2H，CH₂)，2.43(s，4H，CH₂)，2.04-2.00 (m，2 H，CH₂)；HRMS (ESI)：C₃₀H₄₀ClFN₄O₇ 理論計(jì)算值(m/z [M]²⁺)為623.2632，實(shí)際測(cè)得值為623.2634；

（3）在裝有磁力攪拌裝置、導(dǎo)氣管裝置和回流冷凝裝置的100mL三口圓底燒瓶中依次加入稱好的3.7g 1,3-二亞氨基異吲哚啉，4.2mL四氯化硅及42mL喹啉；在220℃下回流1.5h，過濾，將濾餅用喹啉、甲苯、甲醇和丙酮的混合溶液洗滌，干燥后得到紫紅色的二氯硅酞菁（即化合物4）3.5g，產(chǎn)率為65%；

（4）在裝有磁力攪拌裝置、導(dǎo)氣管裝置和回流冷凝裝置的100mL圓底燒瓶中依次將0.21g化合物3a和0.052g化合物4， 20mL甲苯和0.032g氫化鈉，升溫至120℃反應(yīng)1.5d；反應(yīng)結(jié)束后用二氯甲烷：甲醇=100:1為洗脫過劑中性氧化鋁柱，然后過四氫呋喃的凝膠柱，再用乙酸乙酯為洗脫劑過中性氧化鋁柱，收集得到藍(lán)紫色的固體（即化合物5a）5.69mg，產(chǎn)率為15%；¹H NMR (400 MHz，CDCl₃): δ 9.59-9.37(m，8H; Pc-1,4-Har)，8.31-8.22 (m，8H; Pc-2,3-Har)，7.89 (s，2 H，Ar-H)，7.40(s，1 H，Ar-H)，7.28(s，1 H，Ar-H)，7.21(s，2H，Ar-H)，7.04-7.02(m，4 H，Ar-H)，6.37-6.23(m，2 H，Ar-H)，4.26(s，4H，CH₂)，3.74-3.58 (m，16H，CH₂)，3.38(s，4H，CH₂)，3.10(s，3H，CH₃)，2.84(s，3H，CH₃)，2.57-2.50(m，10H，CH₂)，2.41-2.36(m，4H，CH₂)，2.09-2.03(m，6H，CH₂)，1.70-1.64(m，4H，CH₂)，1.28(s，2H，CH₂)，0.92-0.90(m，2H，CH₂)， 0.46-0.31(m，4H，CH₂)，?1.90-?2.05ppm (m，4H; Si-OCH₂CH₂O)；HRMS (ESI)：C₈₆H₈₀N₁₄O₁₄Si 理論計(jì)算值(m/z [M]²⁺)為1783.6281，實(shí)際測(cè)得值為1783.6284。

實(shí)施例2（M=Si，n=5）

（1）在裝有磁力攪拌裝置、導(dǎo)氣管裝置和回流冷凝裝置的250mL圓底燒瓶中依次加入稱好的10.76 g（0.12 mol）五甘醇、4.57 g（0.15 mol）三乙胺和50 mL二氯甲烷，然后將2.15 g（0.03 mol）對(duì)甲苯磺酰氯溶解100 mL的二氯甲烷中，并裝在恒壓滴液漏斗中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將對(duì)甲苯磺酰氯溶液緩慢滴加至反應(yīng)瓶中，然后在室溫下，攪拌反應(yīng)10 h。反應(yīng)結(jié)束后，先用1 mol/L的鹽酸溶液和飽和的氯化鈉溶液分別萃取三次，收集有機(jī)層，再減壓蒸餾除去二氯甲烷；所得粗產(chǎn)物用干法上樣過硅膠柱，所用展開劑為石油醚：乙酸乙酯=1：1的混合溶液，得到淡黃色粘稠狀的液體（即化合物2b）約6.15 g，產(chǎn)率為83％；

（2）在裝有磁力攪拌裝置、導(dǎo)氣管裝置和回流冷凝裝置的100mL圓底燒瓶中依次加入1.01 g（4.50 mmol) N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉丙氧基)喹唑啉-4-胺、1.14 g（6.75 mmol）化合物2，及1.24 g（18.00 mmol）無水碳酸鉀，再向其中加入15 mL DMF溶劑，80 ℃下反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后，旋干；向粗產(chǎn)物中加入二氯甲烷和飽和食鹽水萃取，再用二氯甲烷萃取三次后，收集有機(jī)層減壓旋干，得到粗產(chǎn)品，然后再以CH₂Cl₂:CH₃OH=30:1的混合溶液為展開劑過硅膠柱，收集得到淡黃色粘稠狀的液體（即化合物3b）0.53 g，產(chǎn)率為32％；¹H NMR (400 MHz，CDCl₃):δ 7.84(s，1H，Ar-H)，7.77(s，1H，Ar-H)，7.18-7.20 (m，1 H，Ar-H)，7.05-7.09(t，J=16 Hz，1 H，Ar-H)，6.97(m，1 H，Ar-H)，6.65(s，1 H，Ar-H)，4.23(t，J=8.0 Hz，2 H，CH₂)，4.13(t，J=8.0 Hz，2 H，CH₂)，3.96(s，3 H，CH₃)，3.80 (t，J=8.0 Hz，2 H，CH₂)，3.68(t，J=8.0 Hz，4 H，CH₂)，3.57-3.62(m，15H，CH₂+OH)，2.54(t，J=12.0Hz，2 H，CH₂)，2.48 (s，4H，CH₂)，2.05-2.09 (m，2 H，CH₂)；HRMS (ESI)：C₃₀H₄₀ClFN₄O₇ 理論計(jì)算值(m/z [M]²⁺)為623.2632，實(shí)際測(cè)得值為623.2634。

（3）在裝有磁力攪拌裝置、導(dǎo)氣管裝置和回流冷凝裝置的100mL三口圓底燒瓶中依次加入稱好的3.7g 1,3-二亞氨基異吲哚啉，4.2mL四氯化硅及42mL喹啉；在220℃下回流2h，過濾，將濾餅用喹啉、甲苯、甲醇和丙酮的混合溶液洗滌，干燥后得到紫紅色的二氯硅酞菁（即化合物4）3.5g，產(chǎn)率為65%.

（4）在裝有磁力攪拌裝置、導(dǎo)氣管裝置和回流冷凝裝置的100mL圓底燒瓶中依次將0.23g化合物3b和0.052g化合物4，20mL甲苯和0.032g氫化鈉，升溫至120℃反應(yīng)1.8d；反應(yīng)結(jié)束后用二氯甲烷：甲醇=100:1為洗脫過劑中性氧化鋁柱，然后過四氫呋喃的凝膠柱，再用乙酸乙酯為洗脫劑過中性氧化鋁柱，收集得到藍(lán)紫色的固體（即化合物5b）4.83mg，產(chǎn)率為12%；¹H NMR (400 MHz，CDCl₃): δ 9.65-9.47(m，8H; Pc-1,4-Har)，8.35-8.32(m，8H; Pc-2,3-Har)，7.80-7.74(m，2 H，Ar-H)，7.54(s，2H，Ar-H)，7.19(s，2H，Ar-H)，7.07(t，J=16.0 Hz，2H，Ar-H)，6.95 (s，2H，Ar-H)，6.35(s，2H，Ar-H)，4.24-4.21(m，4H，CH₂)，3.74-3.72(m，12H，CH₂)，3.53-3.49(m，2H，CH₂)，3.38-3.32(m，4H，CH₂)，3,24(s，3H，CH₃)，3,12(s，3H，CH₃)，2.97-2.86(m，4H，CH₂)，2.55(t，J=16.0 Hz，4H，CH₂)，2.48-2.43(m，8H，CH₂)，2.11-2.06(m，4H，CH₂)，1.70-1.63(m，10H，CH₂)，1.28(s，6H，CH₂)，0.41-0.37(m，4H，CH₂)，?1.88- ?1.97ppm (m, 4H; Si-OCH₂CH₂O)；HRMS (ESI)：C₈₆H₈₀N₁₄O₁₄Si 理論計(jì)算值(m/z [M]²⁺)為1783.6281，實(shí)際測(cè)得值為1783.6284。

應(yīng)用實(shí)例1

對(duì)（化合物5a，其中n=4）和（化合物5b，其中n=5）兩種酞菁硅配合物的離體光動(dòng)力抗癌活性進(jìn)行了初步探索，為今后在體（小鼠）實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛱峁┮欢ǖ膮⒖純r(jià)值，主要內(nèi)容包括酞菁硅配合物作為光敏劑進(jìn)行細(xì)胞毒性和靶向性的研究。

光敏劑的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)通常包括光毒性和暗毒性實(shí)驗(yàn)兩部分，采用MTT法 (四氮唑鹽還原法)測(cè)定。MTT（ 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）檢測(cè)原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞中并無琥珀酸脫氫酶，因此不會(huì)產(chǎn)生甲瓚。用DMSO（二甲基亞砜）溶解活細(xì)胞產(chǎn)生的甲瓚，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT甲瓚形成的量與活細(xì)胞數(shù)成正比。

細(xì)胞處理過程：用0.25%胰酶將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的貼壁細(xì)胞消化后，再用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%小牛血清）配制成2×10⁴cells/ mL細(xì)胞懸液，將每孔100μL（約含4000個(gè)腫瘤細(xì)胞）接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，貼壁后加藥；

受試樣品組：酞菁預(yù)先配制為DMSO（含5%蓖麻油）儲(chǔ)備液，所有藥液配制后均經(jīng)有機(jī)膜過濾（0.22μm），使用時(shí)酞菁用DMSO稀釋為不同濃度，最終濃度中 DMSO的含量為1%；每濃度設(shè)定6個(gè)平行孔，每孔加入20μL不同濃度的藥后置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。

溶劑對(duì)照是指對(duì)照組不加細(xì)胞，其他條件與受試樣品組一致。

空白對(duì)照是指除了不加酞菁外，其他條件與受試樣品組一致。

暗毒實(shí)驗(yàn)：24小時(shí)后，去除含藥液的培養(yǎng)基，在換上新鮮培養(yǎng)基后直接放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，操作過程盡量避免光照，24h后，每孔加入10μL，4 mg·ml^-1MTT的PBS溶液，37℃下孵育4h，然后小心棄去上清，每孔加入100μLDMSO溶解甲瓚顆粒，輕度震蕩使甲瓚完全溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm波長(zhǎng)下OD值。

光毒實(shí)驗(yàn)：24小時(shí)后，去除含藥液的培養(yǎng)基，換上100μL新鮮培養(yǎng)基，然后用激光器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行照射，670nm波長(zhǎng)激光，照射能量密度為 1.5 J·cm^-2；光照完畢，將96孔板重置于37℃，5% CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)。

采用MTT法測(cè)定了兩種酞菁對(duì)HepG2人體肝癌細(xì)胞的殺傷曲線；即在光照和無光照條件下對(duì)HepG2細(xì)胞的劑量依賴曲線，如圖1和圖2。光照波長(zhǎng)為670 nm，光照能量密度為1.5 J·cm^-2，數(shù)據(jù)由三次獨(dú)立的平行實(shí)驗(yàn)得到，以Mean±SEM方式處理。

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，兩種酞菁在無光照條件下對(duì)HepG2人體肝癌細(xì)胞沒有任何殺傷作用（這說明沒有光的時(shí)候，沒有效果），而在一定的光照條件下，殺傷HepG2細(xì)胞的IC₅₀值（半數(shù)抑制率）分別為0.071 μM、0.035 μM。而且只需要0.1 μM的酞菁就幾乎可以殺死全部癌細(xì)胞，因此它們都表現(xiàn)出非常高的光動(dòng)力抗癌活性。極低的暗毒性和較高的光毒性說明這兩種酞菁都達(dá)到了理想光敏劑的要求，有望開發(fā)為高效的光敏藥物。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。