本發(fā)明涉及中藥提取、分離領(lǐng)域，尤其涉及從馬齒莧藥材中提取、分離和鑒別出的酰胺類生物堿及其提取分離方法。

背景技術(shù)：

馬齒莧(Portulaca oleracea L.)，又名長命菜、馬莧菜，為馬齒莧科植物。馬齒莧耐旱耐澇，且耐光耐陰，分布廣泛，資源豐富，作為藥食兩用的野生植物備受關(guān)注，2015版《中華人民共和國藥典》中收載馬齒莧的干燥地上部分入藥，具有清熱解毒、涼血止血、止痢等功效，用于熱毒血痢、癰腫疔瘡、濕疹、丹毒、蛇蟲咬傷、便血、痔血、崩漏下血等。

馬齒莧現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗炎止痛、抗菌抗病毒、降血壓、降血脂、抗氧化、抗癌、松弛骨骼肌和平滑肌、調(diào)節(jié)免疫功能等作用。研究表明馬齒莧眾多化學(xué)成分為其多樣的藥理作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，馬齒莧主要化學(xué)成分包括黃酮類、香豆素、萜類、甾類、生物堿、氨基酸、各種色素類和礦物質(zhì)類等。其中生物堿是馬齒莧中一類主要的化學(xué)成分，目前已報道的生物堿類成分有去甲腎上腺素、多巴胺、少量多巴、腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤、N，N-二環(huán)己基脲、尿囊素、N-反式-阿魏?；野罚贿€有環(huán)二肽生物堿和酰胺類生物堿：馬齒莧酰胺A-I、K、L、N-S。

目前從馬齒莧中分離出的化學(xué)成分大多數(shù)是已知的，且結(jié)構(gòu)新穎性較低，因此，對馬齒莧中新化合物的開發(fā)和分離是亟待需要的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明提供從馬齒莧中提取的一種特殊酰胺類生物堿化合物，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的特殊生物堿具有抗炎、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)的作用，同時提供一種針對本發(fā)明新生物堿化合物的簡便、快速、環(huán)保、純度高的提取分離方法。

為實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供的酰胺類生物堿化合物，分子式為C₂₄H₃₉NO₇，命名為oleraciamide C?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式為：

為實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明還提供一種馬齒莧中特殊酰胺類生物堿化合物的提取分離方法，具體步驟為。

步驟1、取馬齒莧干燥藥材，采用50％乙醇回流提取，減壓回收乙醇，放涼至室溫，得藥液備用。

步驟2、將步驟1中藥液使用靜態(tài)吸附的方法通過AB-8型大孔樹脂，依次采用水，50％，70％乙醇梯度洗脫，將70％乙醇洗脫部位減壓濃縮后用乙酸乙酯反復(fù)萃取，減壓回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物。

步驟3、將步驟2中乙酸乙酯萃取物經(jīng)聚酰胺柱分離，采用乙醇-水梯度洗脫，70％乙醇部分蒸干后上硅膠柱，依次用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫得到若干洗脫部位，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢測，顯色，合并顯色的洗脫部位，將合并后的洗脫部位經(jīng)減壓濃縮至干，備用。

步驟4、將步驟3中所得物再經(jīng)Sephadex LH-20(羥丙基葡聚糖凝膠)處理，以甲醇-水等度洗脫,得到若干洗脫部位，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢測，顯色，合并顯色的洗脫部位，將合并后的洗脫部位經(jīng)減壓濃縮至干，備用。

步驟5、將步驟4中所得濃縮物經(jīng)預(yù)處理的ODS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷鍵合硅膠填料)層析分離，用甲醇-水洗脫得到來源于馬齒莧的酰胺類生物堿化合物。其純度經(jīng)高效液相色譜檢測高于98％。

所述ODS和Sephadex LH-20凝膠的預(yù)處理過程為甲醇浸泡過24小時，上柱，用甲醇洗至滴入水中無混濁，再以初始流動相平衡。

與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果。

本發(fā)明中所述馬齒莧特殊酰胺類生物堿化合物的分離和藥理活性研究未被現(xiàn)有論文期刊所報道；本發(fā)明提供來源于馬齒莧的特殊酰胺類生物堿化合物及一種針對本發(fā)明新化合物的提取分離方法，依次采用50％乙醇回流提取、大孔吸附樹脂層析、乙酸乙酯萃取、聚酰胺柱層析、硅膠柱層析、Sephadex LH-20純化、ODS中壓柱分離純化，成功提取分離出一種酰胺類生物堿化合物，該方法操作步驟僅為五步，操作方法簡便及快速，提取分離過程主要采用50％乙醇提取及乙酸乙酯萃取，工藝方法環(huán)保，且經(jīng)該方法分離得到的化合物純度較高均大于90％，此外經(jīng)研究表明該化合物具有抗炎、抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)作用，因此本發(fā)明的一種特殊酰胺類生物堿化合物及其鹽和衍生物可以作為其他化合物合成先導(dǎo)物，以及新藥開發(fā)和藥理活性研究的原料，亦可用于制備抗炎、抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)的藥物。

附圖說明

圖1為本發(fā)明酰胺類生物堿化合物oleraciamide C的紫外光譜圖。

圖2為本發(fā)明酰胺類生物堿化合物oleraciamide C的紅外光譜圖。

圖3為本發(fā)明酰胺類生物堿化合物oleraciamide C ¹H-NMR光譜圖。

圖4為本發(fā)明酰胺類生物堿化合物oleraciamide C ¹³C-NMR光譜圖。

圖5為本發(fā)明酰胺類生物堿化合物oleraciamide C的核磁共振碳譜(DEPT)光譜圖。

圖6為本發(fā)明酰胺類生物堿化合物oleraciamide C的核磁共振¹H-¹HCOSY光譜圖。

圖7為本發(fā)明酰胺類生物堿化合物oleraciamide C的核磁共振HMBC光譜圖。

圖8為本發(fā)明酰胺類生物堿化合物oleraciamide C的核磁共振HSQC光譜圖。

圖9為本發(fā)明酰胺類生物堿化合物oleraciamide C的核磁共振NOESY光譜圖。

具體實施方式

實施例1。

本發(fā)明提供一種特殊酰胺類生物堿化合物，分子式為C₂₄H₃₉NO₇，命名為oleraciamide C,化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

所述特殊酰胺類生物堿化合物根據(jù)結(jié)構(gòu)命名為oleraciamide C，表1為該生物堿化合物的核磁數(shù)據(jù)：¹H-NMR與¹³C-NMR在氘代甲醇中。

表1：本發(fā)明新生物堿化合物的核磁數(shù)據(jù)

請參閱圖1-9，本發(fā)明特殊酰胺類生物堿化合物的結(jié)構(gòu)鑒定與推導(dǎo)。

Oleraciamide C：白色油狀物，易溶于甲醇，不溶、微溶于水。點樣于硅膠薄層板后，噴稀碘化鉍鉀試液斑點顯橘色，提示該化合物為生物堿成分，Molish反應(yīng)呈陽性說明化合物中含有糖基。UV(MeOH)λ_max:205，219，269nm，IRν_N-H3409cm^-1，ν_＝CH3012cm^-1，ν_CH2928cm^-1，2856cm^-1ν_C＝O1737cm^-1，δ_CH 1384cm^-1，ν_C-N1168cm^-1，ν_C-O1075cm^-1。HRESI(+)TOFMS給出m/z:454.2876[M+H]⁺的準(zhǔn)分子離子峰，分子量為453.5801。結(jié)合¹H-NMR，¹³C-NMR以及DEPT數(shù)據(jù)，推測該化合物可能的分子式為C₂₄H₃₉NO₇，不飽和度為6。¹³C-NMR譜和DEPT譜顯示24個碳信號，分別為1個CH₃(δ：14.63)、一個羰基碳(δ：175.48)、9個CH₂(δ21.48，25.98，26.52，28.15，30.18，30.27，34.94，66.58，71.89)，7個CH，包括6個烯碳(128.25，128.86，129.21，129.22，131.09，132.74)和一個脂肪碳(δ：69.65)，以及單糖的6個碳信號(δ：104.6，72.59，74.87，70.30，76.78，62.50)。¹H-NMR譜顯示一個活潑H信號δ4.53(1H，bs)，表明可能存在一個氨基基團(tuán)。

糖端基碳的耦合常數(shù)為7.6Hz，在6到8Hz之間，δ(104.6)在103至105ppm之間，說明β-吡喃葡萄糖基團(tuán)存在。HMBC譜相關(guān)峰顯示H-3”與C-1”相關(guān)，H-6”和C-4”相關(guān)表明β-吡喃葡萄糖基團(tuán)在端基碳和6β位置上分別被C-3”，C-4”雙取代。且(δC-3”71.89，δC-4”69.65)的化學(xué)位移向低場移動。此外，H-3”與H-4”在2D NMR上的強(qiáng)相關(guān)說明C-3”，C-4”直接相連，并且形成與葡萄糖基雙取代八元環(huán)。同時，HMBC譜可觀察到相關(guān)峰：H-2/C-1，C-3，C-4，C-5；H-3/C-1，C-2，C-5；H-4/C-2，C-3，C-5；H-5/C-4，C-6；H-6/C-7，C-8；H-7/C-6；H-8/C-9；H-9/C-7，C-8，C-10，C-11，C-12；H-10，H-12/C-9；H-14/C-11，C-12，C-13，C-15；H-15/C-13，C-14以及H-H COSY中的線性自旋系統(tǒng)H-2/H-3/H-4/H-5/H-6/H-8/H-9/H-10/H-11/H-12/H-13/H-14/H-15提示一條長碳鏈的存在。6個烯碳在NOE譜和H-H COSY譜中彼此相關(guān)信號密集，表明其形成較為鄰近的雙鍵，H-9(δ_H2.81，2H，t，J＝6Hz)的去屏蔽作用也說明其位于三個雙鍵之間。C-1(δ175.48)位于低場，推測其為酰胺基。而且H-1'，H-2，H-3與C-1的HMBC相關(guān)信號說明酰胺基團(tuán)位于C-1'和C-2之間。根據(jù)以上信息，可確定此新生物堿為上述結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明還提供上述該生物堿化合物的提取分離方法，具體步驟為。

步驟1：稱取馬齒莧干燥藥材80kg，采用50％乙醇回流提取，50％乙醇用量為藥材的8～16倍，回流提取兩次，每次2h，減壓回收乙醇，放涼至室溫，得藥液備用。

步驟2：將步驟1中所得藥液，使用靜態(tài)吸附的方法通過AB-8型大孔樹脂，依次采用水，50％，70％乙醇梯度洗脫，將70％乙醇洗脫部位減壓濃縮后用乙酸乙酯反復(fù)萃取3次，乙酸乙酯與濃縮液的體積比例為1:1(v:v)，40℃以下減壓回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物。

步驟3：將步驟2中乙酸乙酯萃取物經(jīng)聚酰胺柱分離，采用乙醇-水(0/100，30/70，50/50，70/30，90/10，v/v)梯度洗脫，70％乙醇部分蒸干后經(jīng)硅膠柱層析分離，其中硅膠為200～300目，依次用乙酸乙酯-甲醇(10:1、5:1、1:1，v:v)梯度洗脫，共得到10個部位(即共得到10個瓶，每瓶400mL)，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢測，顯色，合并顯色的4～7洗脫部位(即合并顯色的4～17瓶，棄去1～3瓶與8～10瓶)，將合并后的4～7部位經(jīng)40℃以下減壓濃縮至干，備用。

步驟4：將步驟3中所得物再經(jīng)預(yù)處理的Sephadex LH-20(羥丙基葡聚糖凝膠)處理，以甲醇-水(80：20)等度洗脫，得到7個部位(即洗脫得10個瓶，每瓶200mL)，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢測，顯色，將顯色的3,4部位分別合并，50℃以下減壓濃縮至干，備用。所述Sephadex LH-20凝膠的預(yù)處理過程為甲醇浸泡過24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中無混濁，再以初始流動相平衡。

步驟5：將步驟4中所得各顯色部位經(jīng)預(yù)處理的ODS中壓柱層析分離，其中填料粒度為20～40μm，用甲醇-水(80：20，v/v)等度洗脫(加壓，使流速為1mL/min，溫度為室溫)，得到酰胺類生物堿化合物。歸一法測定純度90～99％。所述ODS的預(yù)處理過程為甲醇浸泡過24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中無混濁，再以初始流動相平衡。

本發(fā)明酰胺類生物堿化合物的抗炎作用。

1、主要材料。

1.1、藥品和試劑：實驗所用酰胺類生物堿化合物由上述方法制備，純度為90～99％，精密稱取，用DMSO稀釋至下述各劑量組所需溶液。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Hyclone公司)；青霉素、鏈霉素(杭州四季青公司)；LPS(美國Sigma公司)；IL-6、TNF-α、PGE₂的ELISA試劑盒(美國Cayman公司)；細(xì)胞裂解液、Griess試劑(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2細(xì)胞株：RAW264.7巨噬細(xì)胞(美國ATCC細(xì)胞庫)。

1.3分組：分為對照組、LPS組和實驗組，各一組。

2實驗方法。

2.1細(xì)胞培養(yǎng)，DMEM高糖培養(yǎng)基，加入l0％的胎牛血清，l％抗菌素(100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)，置于37.5％，CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2MTT比色法測定細(xì)胞活力，上述三組分別取對數(shù)生長期RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1×10⁴個/mL，每孔100μL，溫度37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)過夜后，實驗組加入不同濃度的本發(fā)明新生物堿化合物oleraciamide C(1-50μM)，孵育1h后向LPS組和實驗組分別加入終濃度為1μg/mL的LPS，另設(shè)調(diào)零組(含DMSO溶媒的培養(yǎng)液)，每組設(shè)3個復(fù)孔，考察加入藥物后對細(xì)胞的影響。上述各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，在各孔細(xì)胞中加入5mg/mL MTT 20μL，溫度37℃，5％CO₂條件下繼續(xù)孵育4h后，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入100μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10min，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀570nm波長處測定各孔吸光值。

2.3利用格里斯(Griess)法測定NO的含量，考察本發(fā)明新生物堿化合物對LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的NO產(chǎn)生量的抑制作用。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7傳代后在含10％胎牛血清的高糖細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM中培養(yǎng)，實驗組加入不同濃度的本發(fā)明新生物堿化合物oleraciamide C(1-20μM)，在37℃，5％CO₂條件下孵育1h后用LPS(終濃度為1μg/mL)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，24h后收集上清液，每組處理重復(fù)3孔。Griess法測定細(xì)胞上清液中NO的含量，根據(jù)不同濃度本發(fā)明新生物堿化合物對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響，用以反映NO水平。

2.4ELISA法測定炎癥因子IL-6、TNF-α和炎癥介質(zhì)PGE₂：將對數(shù)生長期RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1×10⁵個/mL，每孔1mL，溫度37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)過夜，實驗組加入本發(fā)明新生物堿化合物oleraciamide C(1-20μM)，培育1h后，在每孔加入LPS(終濃度為1μg/mL)，共孵育24h，每組處理重復(fù)3孔。ELISA法測定馬齒莧來源新生物堿處理后的RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-α和PGE₂的含量。

3實驗結(jié)果。

實驗結(jié)果表明本發(fā)明特殊酰胺類生物堿化合物對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖無影響，安全無毒；并可有效抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7所產(chǎn)生過量炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和炎癥介質(zhì)NO、PGE₂，且呈濃度依賴。

細(xì)胞相對存活率實驗結(jié)果如表2所示。

表2：本發(fā)明對RAW264.7巨噬細(xì)胞相對存活率的影響。

注：^*P<0.05與對照組比較(高濃度組有顯著性差異)。

利用格里斯(Griess)法測定NO的含量實驗結(jié)果見表3。

表3：本發(fā)明對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝3)。

注：^*P<0.05與對照組比較，^#P<0.05與LPS組比較。

ELISA法測定炎癥因子IL-6、TNF-α和炎癥介質(zhì)PGE₂結(jié)果如表4所示。

表4：本發(fā)明對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-α和PGE₂含量的影響(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝3)。

注：^*P<0.05與對照組比較，^#P<0.05與LPS組比較。

本發(fā)明酰胺類生物堿化合物的抗腫瘤作用。

1主要材料。

1.1藥品和試劑：實驗所用酰胺類生物堿化合物由上述方法制備，純度為90～99％，精密稱取，用DMSO稀釋至下述各劑量組所需溶液。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Hyclone公司)；青霉素、鏈霉素(杭州四季青公司)。

1.2細(xì)胞株：人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人胃癌細(xì)胞BGC-823、人肺腺癌細(xì)胞SPC-A1、人肝癌細(xì)胞BEL-7402、人宮頸癌細(xì)胞Hela-229、卵巢癌細(xì)胞Ho-8910、人類口腔表皮樣癌細(xì)胞KB(以上細(xì)胞均來源于中科院上海細(xì)胞庫)。

1.3分組：分為對照組、實驗組和調(diào)零組(含DMSO溶媒的培養(yǎng)液)。

2實驗方法。

2.1細(xì)胞培養(yǎng)，DMEM高糖培養(yǎng)基，加入l0％的胎牛血清，l％抗菌素(100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2MTI法檢測細(xì)胞增殖，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1×10⁴個/mL，每孔100μL，溫度37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)過夜后，實驗組加入不同濃度的本發(fā)明新生物堿化合物，每組設(shè)3個復(fù)孔，加藥后置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。將含藥培養(yǎng)液吸去，加入體積比為4：1的無血清培養(yǎng)液和MTT(終質(zhì)量濃度為5mg/mL)共100mL，繼續(xù)孵育4h，小心吸去上清液后，每孔加入DMSO 150μL，放于震蕩器上震蕩以使結(jié)晶完全溶解(5min)，酶標(biāo)儀在570nm波長下檢測各孔的吸光度(A)值。然后，計算各濃度化合物對細(xì)胞生長的抑制率，抑制率公式：細(xì)胞生長抑制率＝(1-A_加藥孔/A_對照孔)×100％，再應(yīng)用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)，將抑制率對藥物濃度作曲線，計算IC₅₀值。

3實驗結(jié)果。

實驗結(jié)果表明本發(fā)明酰胺類生物堿化合物對人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人胃癌細(xì)胞BGC-823、人肺腺癌細(xì)胞SPC-A1、人肝癌細(xì)胞BEL-7402、人宮頸癌細(xì)胞Hela-229、卵巢癌細(xì)胞Ho-8910、人類口腔表皮樣癌細(xì)胞KB、的增殖具有抑制作用，且隨藥物濃度增大，抑制率也明顯升高，即呈濃度依賴。本發(fā)明新化合物對上述八種腫瘤細(xì)胞IC₅₀值見表5。

表5本發(fā)明新化合物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。

本發(fā)明酰胺類生物堿化合物的神經(jīng)保護(hù)作用。

1主要材料。

1.1藥品和試劑：實驗所用新生物堿化合物由上述方法制備，純度為90～99％，精密稱取，用DMSO稀釋至下述各劑量組所需溶液。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Hyclone公司)；青霉素、鏈霉素(杭州四季青公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)，(武漢博士德有限公司)，ROS檢測試劑盒(海門碧云天試劑公司)。

1.2細(xì)胞株：人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y、IMR-32)(中科院上海細(xì)胞。

1.3分組：分為對照組、H₂O₂損傷模型組和實驗組。

2實驗方法。

2.1細(xì)胞培養(yǎng)，DMEM高糖培養(yǎng)基，加入l0％的胎牛血清，l％抗菌素(100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2MTT比色法測定細(xì)胞活力，上述三組分別取對數(shù)生長期SH-SY5Y細(xì)胞和IMR-32細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1×10⁴個/mL，每孔100μL，溫度37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)過夜后，實驗組加入不同濃度的本發(fā)明酰胺類生物堿化合物oleraciamide C(5-40μM)，孵育1h后向H₂O₂組和實驗組分別加入終濃度為800μM/L的H₂O₂，另設(shè)調(diào)零組(含DMSO溶媒的培養(yǎng)液,酶標(biāo)儀檢測時調(diào)零用)，每組設(shè)3個復(fù)孔，考察加入藥物后對細(xì)胞的影響。上述各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，在各孔細(xì)胞中加入5mg/mL MTT 20μL，溫度37℃，5％CO₂條件下繼續(xù)孵育4h后，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入100μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10min，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀450nm波長處測定各孔吸光值(A)值，計算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率＝(AH₂O₂損傷－A空白)/(A對照－A空白)。

2.3DCFH-DA法檢測SH-SY5Y細(xì)胞和IMR-32細(xì)胞內(nèi)ROS，各組細(xì)胞給予相應(yīng)物質(zhì)后孵育24h，孵育結(jié)束前30min，各孔加入DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L，于37℃繼續(xù)孵育30min，收集細(xì)胞，PBS洗2次，細(xì)胞計數(shù)，將各組細(xì)胞制成相同濃度的細(xì)胞懸液。取100μL細(xì)胞懸液檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長538nm。以對照組熒光強(qiáng)度為100％，其余各組與對照組熒光強(qiáng)度相比較，計算胞內(nèi)ROS變化。

2.4INT顯色反應(yīng)法測定LDH的釋放量，除上述對照組、H₂O₂損傷模型組和實驗組外，另設(shè)立空白對照組(空白對照組不接種細(xì)胞)，各組細(xì)胞加入相應(yīng)物質(zhì)培養(yǎng)24h，取各孔上清120μL至新的96孔板中，加60μL配好的LDH檢測工作液，避光室溫孵育30min，在490nm處用多功能酶標(biāo)儀測定A值，計算相對于對照管的LDH釋放量百分率。LDH釋放率＝(A給藥－A空白)/(A對照－A空白)。

3實驗結(jié)果。

細(xì)胞相對存活率實驗結(jié)果如表6所示。

表6：本發(fā)明對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y和IMR-32細(xì)胞相對存活率的影響。

注：^*P<0.05與H₂O₂損傷模型組比較。

SH-SY5Y細(xì)胞和IMR-32細(xì)胞內(nèi)ROS量檢測結(jié)果如表7所示。

表7：本發(fā)明對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y和IMR-32細(xì)胞內(nèi)ROS量的影響。

注：^*P<0.05與對照組比較，^#P<0.05與H₂O₂損傷模型組比較。

SH-SY5Y細(xì)胞和IMR-32細(xì)胞內(nèi)LDH釋放的影響結(jié)果如表8所示。

表8：本發(fā)明對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y和IMR-32細(xì)胞內(nèi)LDH釋放的影響。

注：^*P<0.05與對照組比較，^#P<0.05與H₂O₂損傷模型組比較。

綜上所述，本發(fā)明提供特殊酰胺類生物堿化合物及其提取分離方法，依次采用50％乙醇回流提取、大孔吸附樹脂層析、乙酸乙酯萃取、聚酰胺柱層析、硅膠柱層析、Sephadex LH-20純化、ODS中壓柱分離純化，成功的分離得到一種特殊酰胺類新生物堿化合物，該方法簡便，快速，環(huán)保，且經(jīng)該方法分離得到的化合物純度較高，由于所得化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特，從常用中藥馬齒莧中提取出來，其具有抗炎、抗腫瘤及神經(jīng)保護(hù)作用，因此本發(fā)明特殊酰胺類生物堿及其鹽和衍生物可以作為天然產(chǎn)物開發(fā)中藥新藥，具有廣闊的前景。