本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一種降解棒曲霉素的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

棒曲霉素(Patulin)是部分青霉屬和曲霉屬真菌的次生代謝產(chǎn)物。它對(duì)人及動(dòng)物具有廣泛而強(qiáng)烈的毒性作用。急性毒性表現(xiàn)為抽搐、痙攣、皮下組織水腫、肺腸充血、腸炎、無尿直至死亡；慢性毒性可導(dǎo)致胃潰瘍，并具有抑制免疫、致畸性以及潛在的致癌性等，還有可能影響男性的生育能力。棒曲霉素能溶于水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和氯仿，微溶于乙醚、苯，不溶于石油醚，在酸性條件下化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

在具有棒曲霉素產(chǎn)生能力的真菌中，部分真菌是植物致病菌，其中最主要的一種是擴(kuò)展青霉病菌(Penicillium expansum)。這種病原菌是世界范圍內(nèi)引起果實(shí)采后腐爛的最重要的病原菌之一，常見的寄主包括蘋果、梨、葡萄、櫻桃、桃、草莓等等。它在引起果實(shí)腐爛的同時(shí)，會(huì)向果實(shí)組織中分泌大量的棒曲霉素。在果汁加工產(chǎn)業(yè)中，如果腐爛的果實(shí)混入原材料中，那么生產(chǎn)出的果汁就會(huì)有不同程度的棒曲霉素殘留，給消費(fèi)者(特別是兒童)的身體健康帶來危害?；诎羟顾貙?duì)人體健康的潛在危害，世界上很多國(guó)家都對(duì)果汁產(chǎn)品中棒曲霉素的最大限量做了規(guī)定，EU、USFDA規(guī)定果汁產(chǎn)品中棒曲霉素的最大限量為50μg/kg，WHO建議人每天棒曲霉素的攝入量不超過0.4μg/kg體重。

目前，主要通過吸附、微波處理等物理手段進(jìn)行去除棒曲霉素，但效果不是十分理想，亟需研發(fā)新型的降解棒曲霉素的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種降解棒曲霉素的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。

本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，命名為Cgscd，來源于季也蒙假絲酵母菌(Candida guilliermondii)，具體是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且具有降解棒曲霉素功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。

為了便于上述(a)中所示蛋白質(zhì)的純化，可在由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標(biāo)簽。

表：標(biāo)簽的序列

上述(b)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變。

在本發(fā)明中，所述蛋白質(zhì)具體為將pET-30a(+)載體的多克隆位點(diǎn)BamHI和XhoI之間的小片段替換為序列表中序列2所示的DNA片段后得到的重組載體所表達(dá)的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)的N端有6×His標(biāo)簽。

編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述核酸分子為編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因(命名為Cgscd)，所述基因?yàn)槿缦?)-3)中任一的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼具有降解棒曲霉素功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)的DNA分子；

3)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同一性，且編碼具有降解棒曲霉素功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)的DNA分子。

含有上述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組微生物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述重組載體可為重組表達(dá)載體，也可為重組克隆載體。

在本發(fā)明中，所述重組載體具體為將pET-30a(+)載體的多克隆位點(diǎn)BamHI和XhoI之間的小片段替換為序列表中序列2所示的DNA片段后得到的重組載體(命名為pET30a(+)-Cgscd)。

在本發(fā)明中，所述重組微生物具體為導(dǎo)入了所述重組載體pET30a(+)-Cgscd的大腸桿菌BL21(DE3)。

所述蛋白質(zhì)或所述核酸分子或所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組微生物在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

(a)降解棒曲霉素；

(b)制備具有降解棒曲霉素功能的產(chǎn)品。

本發(fā)明還提供了一種降解棒曲霉素的方法。

本發(fā)明所提供的降解棒曲霉素的方法，具體可包括如下步驟：在氧化型輔酶存在的情況下，采用所述蛋白質(zhì)體外催化棒曲霉素的降解反應(yīng)。

在所述方法中，所述降解反應(yīng)的溫度可為25-30℃(如25℃)，pH可為4-6(如6)，時(shí)間可為12-24h(如12h)。

所述降解反應(yīng)的反應(yīng)體系中所述氧化型輔酶的濃度具體可為2-5mM(如2.1mM)。所述降解反應(yīng)的反應(yīng)體系中所述蛋白質(zhì)與待降解的棒曲霉素的質(zhì)量比具體可為12:5。進(jìn)一步，所述降解反應(yīng)的反應(yīng)體系中所述蛋白質(zhì)的濃度具體可為60μg/mL；所述降解反應(yīng)的反應(yīng)體系中所述待降解的棒曲霉素的濃度具體可為25μg/mL。

在所述方法中，進(jìn)行所述降解反應(yīng)時(shí)，最好將所述反應(yīng)體系置于搖床上振蕩，具體轉(zhuǎn)速可為120-200rpm(如120rpm)。

本發(fā)明還提供了一種具有降解棒曲霉素功能的產(chǎn)品。

本發(fā)明所提供的具有降解棒曲霉素功能的產(chǎn)品，其活性成分為所述蛋白質(zhì)或所述核酸分子或所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組微生物。

根據(jù)需要，所述產(chǎn)品中還可含有氧化型輔酶。

在本發(fā)明中，所述氧化型輔酶具體可為氧化型輔酶I(NAD⁺)或氧化型輔酶II(NADP⁺)。

實(shí)驗(yàn)證明，在氧化型輔酶存在的情況下，采用本發(fā)明所提供的Cgscd蛋白(序列1)可體外降解棒曲霉素，且效果非常好。本發(fā)明所提供的Cgscd蛋白(序列1)在清除棒曲霉素方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為Cgscd基因克隆的PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果及菌液PCR檢測(cè)結(jié)果。其中，A為PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果；B為菌液PCR檢測(cè)結(jié)果(泳道1-6為陽性轉(zhuǎn)化菌株)。

圖2為Cgscd重組蛋白的原核表達(dá)結(jié)果。1，3：pET-30a(+)上清和包涵體；2，4：pET-30a(+)-Cgscd上清和包涵體。

圖3為Cgscd重組蛋白的鎳柱親和純化結(jié)果。1：載入蛋白；2：貫穿蛋白；3-4：洗滌液；5-8：洗脫液。

圖4為不同輔酶對(duì)Cgscd蛋白降解棒曲霉素的影響。*p＜0.05。

圖5為不同pH對(duì)Cgscd蛋白降解棒曲霉素的影響。*p＜0.05。

圖6為不同溫度對(duì)Cgscd蛋白降解棒曲霉素的影響。*p＜0.05。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、Cgscd基因的克隆及Cgscd蛋白的原核表達(dá)

一、Cgscd基因的克隆

根據(jù)Cgscd蛋白(gi|190348612，Short-chain dehydrogenase)的GI號(hào)在NCBI中查找對(duì)應(yīng)的Cgscd基因序列，在該基因兩端設(shè)計(jì)引物并在引物上增加BamHI和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)，分別命名為pET-30a-F(BamHI)和pET-30a-R(XhoI)。

pET-30a-F(BamHI)：5’-GGATCCATGGAACAAACGTACTTTATTTCAGGCG-3’；

pET-30a-R(XhoI)：5’-CTCGAGTTACCATGGAAGTTCGGTTCCATCG-3’。

以季也蒙假絲酵母(Candida guilliermondii)CGMCC 2.63(記載于“Yuanyuan Zong,Jia Liu,Boqiang Li,et al.Effects of yeast antagonists in combination with hot water treatment on postharvest diseases of tomato fruit.Biological Control 54(2010)316-321”一文，公眾可從申請(qǐng)人處獲得，僅可用于重復(fù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)使用)的基因組DNA為模板，以pET-30a-F(BamHI)和pET-30a-R(XhoI)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系如下：25μL Q5超保真2×Master Mix(紐英倫生物技術(shù)有限公司)，2.5μL正向引物(10μM)，2.5μL反向引物(10μM)，0.5μL模板DNA，19.5μL去離子水。

擴(kuò)增條件為：98℃30s；98℃10s，52℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸2min。

PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小，結(jié)果如圖1中A所示，目的產(chǎn)物大小為750bp左右。

DNA凝膠回收試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司)回收目的基因片段。取4μL該基因膠回收產(chǎn)物加入1μLSimple Cloning Vector(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，吸打混勻后離心使反應(yīng)液至管底，25℃連接20min。

取50μL Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)置于冰上緩慢融化，加入5μL連接產(chǎn)物，輕彈混勻，冰浴放置30min。42℃水浴熱激90s后立即冰浴靜置90s。超凈臺(tái)中加入800μL新鮮配制的LB液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm培養(yǎng)1h。6000rpm離心1min，去掉750μL上清，用余下的100μL培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞后，均勻涂布于LB平板上(含100μg/mL Kan)，37℃倒置培養(yǎng)12h左右至單菌落長(zhǎng)出。

挑取單菌落，轉(zhuǎn)接于含有Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)6h后進(jìn)行菌液PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系如下：10μL 2×Taq PCR Master Mix buffer，0.4μLpET-30a-F(BamHI)引物，0.4μL pET-30a-R(XhoI)引物，1μL菌液，8.2μL去離子水。

擴(kuò)增條件為：95℃3min；95℃30s，52℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5min。

PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖1中B所示，陽性克隆得到大小約為750bp的目的條帶。將鑒定的陽性克隆菌液提取質(zhì)粒(命名為pEASY-Blunt-Cgscd)，共取了兩個(gè)重復(fù)，將質(zhì)粒送到北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。兩個(gè)重復(fù)的測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件與NCBI中得到的該基因進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果顯示：兩個(gè)重復(fù)測(cè)序結(jié)果在DAMAN中進(jìn)行比對(duì)，相似性為100％，Cgscd基因的序列如序列表中序列2所示，編碼所得Cgscd蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。將基因序列與NCBI中已知序列進(jìn)行blast比對(duì)分析，最高相似性為83.93％，氨基酸最高相似性為85.20％，表明本發(fā)明所得的Cgscd基因是一個(gè)新基因。

二、Cgscd蛋白的原核表達(dá)及純化

1、重組原核表達(dá)載體pET30a(+)-Cgscd的構(gòu)建

取步驟一構(gòu)建的pEASY-Blunt-Cgscd質(zhì)粒和pET-30a(+)，分別用BamHI和XhoI雙酶切，酶切體系為：質(zhì)粒30μL，5μL 10×K(Double Restriction Digestion Buffers，TakaRa)，1μL BamHI，1μL XhoI(TakaRa)，30μL去離子水。吸打混勻后稍離心，37℃，酶切反應(yīng)2h，加入10μL 6×loading buffer，混勻后1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，條帶大小無誤后，DNA凝膠回收試劑盒回收片段。

將回收的Cgscd片段分別與切開的pET30a(+)質(zhì)粒骨架大片段連接，連接體系如下：4.5μL Cgscd片段，4μL pET30a(+)質(zhì)粒骨架大片段，1μL 10×T4DNALigase buffer，1μL T4DNALigase(TakaRa)。吸打混勻后離心，16℃，過夜連接，轉(zhuǎn)化，菌液PCR鑒定陽性克隆后，提取其質(zhì)粒即為重組原核表達(dá)載體，命名為pET30a(+)-Cgscd。

經(jīng)測(cè)序，pET30a(+)-Cgscd的結(jié)構(gòu)描述為：將pET-30a(+)載體的多克隆位點(diǎn)BamHI和XhoI之間的小片段替換為序列表中序列2所示的DNA片段后得到的重組載體

2、重組蛋白的原核表達(dá)

轉(zhuǎn)化pET30a(+)-Cgscd質(zhì)粒及對(duì)應(yīng)的空載pET-30a(+)至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中，涂布于Kan抗性的LB固體平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取生長(zhǎng)較好的單菌落于Kan抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃、200rpm，振蕩培養(yǎng)過夜。按1:100的比例接種菌液于新鮮的Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm繼續(xù)培養(yǎng)至OD600≈0.5，向菌液中加入終濃度為1mM的IPTG，37℃、200rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)3h后，4℃，12000rpm離心10min收集菌體。向菌體沉淀(3mL培養(yǎng)液)中加入150μL 50mM Tris-Cl(pH7.4)重懸菌體；超聲處理(功率200W，脈沖1s，間隔2s，共120次)破碎大腸桿菌細(xì)胞，4℃，12000rpm離心15min收集上清，將沉淀重懸于150μL 50mM Tris-Cl(pH 7.4)中，100℃煮10min，SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)效果。

Cgscd蛋白大小約為25kDa，pET30a(+)攜帶的His標(biāo)簽大小約為6-7kDa，因此，通過pET30a(+)-Cgscd載體，表達(dá)獲得的目的蛋白條帶的大小約為31-32kDa，如圖2中方框所示。由圖可見，以pET30a(+)-Cgscd為表達(dá)載體時(shí)，Cgscd蛋白主要存在于上清中，以可溶蛋白形式存在。

3、重組蛋白的大規(guī)模制備及純化

(1)按上述步驟2的方法擴(kuò)大培養(yǎng)體系，100mL LB培養(yǎng)導(dǎo)入pET30a(+)-Cgscd的大腸桿菌BL21(DE3)重組菌，IPTG誘導(dǎo)后，4℃10000g離心10min收集菌體沉淀，加入10mL的1×binding buffer(50mM磷酸二氫鈉，0.3M NaCl，10mM咪唑，pH8.0)重懸菌體后冰上放置30min。超聲處理(功率300W，脈沖20s，間隔50s，共30次)以破碎大腸桿菌細(xì)胞，4℃10000g離心20min收集上清液。

(2)將層析柱底端堵住，向?qū)游鲋屑尤?0mL的1×binding buffer，輕輕顛倒混勻His-bind Resin(Novagen)，吸取1.5mL樹脂到層析柱中，并輕柔顛倒混勻，靜置4min后，自然沉降排空貯存液，如此重復(fù)3次平衡柱子。

(3)將(1)中收集的上清吸出0.5mL后，余下上清液均加入平衡好的His-bind樹脂柱中，4℃輕柔顛倒混合2h后，讓其中液體自然流下，保存該貫穿液。

(4)用10mL的1×wash buffer(50mM磷酸二氫鈉，0.3M NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)洗滌柱子，反復(fù)5次，依次收集，分別命名為洗滌液1-5。

(5)準(zhǔn)備好4個(gè)1.5mL離心管，加入4mL的1×elute buffer(50mM磷酸二氫鈉，0.3M NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)洗脫與鎳柱結(jié)合的蛋白，每管收集1mL左右的洗脫液。

(6)SDS-PAGE檢測(cè)鎳柱純化過程中各步驟中所得的樣品，以評(píng)估純化效果。

如圖3所示，泳道1為純化前的蛋白，目的蛋白表達(dá)量相對(duì)較高；泳道2為穿過鎳柱后的蛋白，絕大部分目的蛋白已經(jīng)結(jié)合到鎳柱；部分未結(jié)合到鎳柱上的目的蛋白被洗脫下來(泳道3-4)；依次洗脫了4管蛋白(5-8泳道)，目的蛋白主要集中在前兩管(對(duì)應(yīng)泳道5和6)中，取這兩管蛋白做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例2、Cgscd蛋白對(duì)棒曲霉素降解作用研究

考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得實(shí)施例1中純化的Cgscd蛋白濃度后，取純化后的蛋白，探索不同輔酶、pH及共培養(yǎng)溫度對(duì)Cgscd蛋白體外催化降解棒曲霉素的影響。

棒曲霉素：加拿大Toronto Research Chemicals(TRC)公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為P206500。

1、輔酶

共分為4組：(1)還原型輔酶Ⅰ(NADH)；(2)氧化型輔酶Ⅰ(NAD⁺)；(3)還原型輔酶Ⅱ(NADPH)；(4)氧化型輔酶Ⅱ(NADP⁺)。

反應(yīng)體系總體積為300μL，其中含有245μL 50mM的MES緩沖液(pH6)(配制方法：MES溶于適量水后用2M NaOH調(diào)節(jié)pH為6，然后水定容使得溶液中MES的終濃度為50mM)，20μL濃度為0.9mg/mL的Cgscd蛋白溶液(1×elute buffer溶解)，5μL濃度為1.5mg/mL的棒曲霉素母液，四個(gè)實(shí)驗(yàn)組中分別加入30μL濃度為21mM不同類型的輔酶。對(duì)照組(CK)中無Cgscd蛋白，加入了與蛋白等體積(20μL)的1×elutebuffer(配方：50mM磷酸二氫鈉，0.3M NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)。

25℃，120rpm共培養(yǎng)12h后0.22μm濾膜過濾，HPLC檢測(cè)棒曲霉素殘余量。每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)，結(jié)果取均值。

其中，HPLC檢測(cè)棒曲霉素殘余量的具體檢測(cè)條件如下：

色譜儀：美國(guó)Waters公司高效液相色譜儀，配備有自動(dòng)進(jìn)樣器(Waters 2498)，雙向HPLC泵(Waters 1525)，紫外檢測(cè)器(Waters 2487)；

色譜柱：ODS反相柱(C18柱，5μm，250×4.6mm，GL Sciences，Japan)；

流動(dòng)相：乙腈∶水＝10∶90(v/v)，流速1.0mL/min；

柱溫：25℃；

檢測(cè)波長(zhǎng)：276nm；

進(jìn)樣量：10μL。

結(jié)果如圖4所示，由圖可見，添加兩種氧化型輔酶NAD⁺和NADP⁺對(duì)Cgscd蛋白體外降解棒曲霉素的效果最好，共培養(yǎng)12h后，棒曲霉素的含量均下降了一半左右；而還原型輔酶NADH和NADPH效果稍差，棒曲霉素含量只減少了3/10。

2、pH

反應(yīng)體系總體積為300μL，其中含有245μL不同pH的50mM的MES緩沖液(分別為pH4，pH5和pH6)(配制方法：MES溶于適量水后用2M NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH為4、5或6，然后水定容使得溶液中MES的終濃度為50mM)，20μL濃度為0.9mg/mL的Cgscd蛋白溶液(1×elute buffer溶解)，5μL濃度為1.5mg/mL的棒曲霉素母液，30μL濃度為21mM的NAD⁺。對(duì)照組(CK)中無Cgscd蛋白，加入了與蛋白等體積(20μL)的1×elute buffer(配方同上)。

25℃，120rpm共培養(yǎng)12h后0.22μm濾膜過濾，HPLC檢測(cè)棒曲霉素殘余量(檢測(cè)方法同上)。每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)，結(jié)果取均值。

結(jié)果如圖5所示，由圖可見，當(dāng)pH為4-6，在氧化型輔酶NAD⁺存在條件下，Cgscd蛋白體外降解棒曲霉素的效果都不錯(cuò)，特別是pH為6時(shí)，共培養(yǎng)12h后，棒曲霉素的含量下降了近一半。

3、溫度

反應(yīng)體系總體積為300μL，其中含有245μL 50mM的MES緩沖液(pH6)(配制方法同上)，20μL濃度為0.9mg/mL的Cgscd蛋白溶液(1×elute buffer溶解)，5μL濃度為1.5mg/mL的棒曲霉素母液，30μL濃度為21mM的NAD⁺。對(duì)照組(CK)中無Cgscd蛋白，加入了與蛋白等體積(20μL)的1×elute buffer(配方同上)。

分別于25℃、30℃和37℃，120rpm共培養(yǎng)12h后0.22μm濾膜過濾，HPLC檢測(cè)棒曲霉素殘余量(檢測(cè)方法同上)。每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)，結(jié)果取均值。

結(jié)果如圖6所示，由圖可見，當(dāng)溫度為25-37℃時(shí)，氧化型輔酶NAD⁺對(duì)Cgscd蛋白體外降解棒曲霉素的效果都很好，共培養(yǎng)12h后，棒曲霉素的含量下降了一半左右。其中，37℃條件下棒曲霉素自降解程度較高，因此最佳反應(yīng)溫度為25-30℃。