本發(fā)明屬于人間充質(zhì)干細(xì)胞領(lǐng)域，尤其涉及一種人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液凍干粉的制備方法及制得的凍干粉。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是一種重要的多能干細(xì)胞，主要分布于早期配胚胎的中胚層和外胚層。其中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是一種存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞。它在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為骨、軟骨、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、內(nèi)皮和心肌等多種組織細(xì)胞，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。由于其免疫原性較低，細(xì)胞含量高、增殖能力優(yōu)等特點，被廣泛應(yīng)用于美容整形等領(lǐng)域。但是在干細(xì)胞的培養(yǎng)擴增過程中亦難免會引入外源性的蛋白(胎牛血清)，容易引起免疫排斥反應(yīng)。細(xì)胞培養(yǎng)上清液含有各種具有生物活性的細(xì)胞因子，它的應(yīng)用可以避免干細(xì)胞美容時的免疫排斥反應(yīng)。但是，使用無胎牛血清的培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)時，干細(xì)胞的活性較低，分泌的因子很少，并且大量的干細(xì)胞在短時間內(nèi)大量死亡。使用一些常規(guī)方法，例如機械摩擦、紫外線照射和饑餓培養(yǎng)等方案，并不能顯著提高干細(xì)胞上清中因子的含量。此外，濃縮后的細(xì)胞培養(yǎng)基中，各種因子會在短時間內(nèi)迅速降解和失活。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
一方面，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞生產(chǎn)細(xì)胞因子的方法，本發(fā)明的方法誘導(dǎo)效率高、干細(xì)胞因子產(chǎn)量大，可短時間內(nèi)獲得大量的干細(xì)胞因子。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞生產(chǎn)細(xì)胞因子的方法，將人間充質(zhì)干細(xì)胞置于2～10℃的低溫下培養(yǎng)。
優(yōu)選地，培養(yǎng)時使用的培養(yǎng)基為DMEM無血清培養(yǎng)基。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液凍干粉的制備方法，包括以下步驟：
1)將人間充質(zhì)干細(xì)胞置于2～10℃的低溫下培養(yǎng)；
2)收集培養(yǎng)上清液，濃縮、凍干后，即得人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液凍干粉。
優(yōu)選地，所述步驟1)中，人間充質(zhì)干細(xì)胞為傳代倍數(shù)為1～10代的低傳代人間充質(zhì)干細(xì)胞。
優(yōu)選地，所述步驟1)中，培養(yǎng)時使用的培養(yǎng)基為DMEM無血清培養(yǎng)基。使用無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，不會引入外源性的蛋白(胎牛血清)，因而不易引起免疫排斥反應(yīng)，制得的凍干粉使用更為安全。
優(yōu)選地，所述步驟1)具體為：在2～10℃的低溫下培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)人間充質(zhì)干細(xì)胞生長到70-90％匯合度時，收集培養(yǎng)上清液，并與DMEM無血清培養(yǎng)基混合，繼續(xù)用于人間充質(zhì)干細(xì)胞的擴大培養(yǎng)，如此反復(fù)至細(xì)胞傳代至10～15代。
更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)上清液與DMEM無血清培養(yǎng)基等體積混合。
優(yōu)選地，所述低溫為4℃。在此溫度下誘導(dǎo)得到的干細(xì)胞因子產(chǎn)量更大。
優(yōu)選地，所述培養(yǎng)的時間為48～96h，更優(yōu)選為72h。
優(yōu)選地，所述人間充質(zhì)干細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
優(yōu)選地，所述步驟1)中，人間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取方法為：(1)人間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)：用含有胎牛血清的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代人間充質(zhì)干細(xì)胞；(2)人間充質(zhì)干細(xì)胞的收集：收集低傳代人間充質(zhì)干細(xì)胞并用生理鹽水洗脫數(shù)次，然后將其重懸于生理鹽水中，其中低傳代人間充質(zhì)干細(xì)胞是指傳代倍數(shù)為0～10代的人間充質(zhì)干細(xì)胞。
優(yōu)選地，所述步驟2)具體為：①收集培養(yǎng)上清液，在無菌環(huán)境下將人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液置于3.5KDa超濾離心管中，離心；②在無菌環(huán)境下打開離心管，用無菌槍頭吸出離心管中的上清液至3.5KDa透析袋中，在4℃條件下，將透析袋埋入PEG20000中脫水4小時；③將透析袋抽真空，升華干燥，除去冰晶，最后制得凍干粉。
再一方面，本發(fā)明還提供了根據(jù)所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液凍干粉的制備方法制得的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液凍干粉。
相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：
本發(fā)明的誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞生產(chǎn)細(xì)胞因子的方法誘導(dǎo)效率高、干細(xì)胞因子產(chǎn)量大，可短時間內(nèi)獲得大量的干細(xì)胞因子；
本發(fā)明的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液凍干粉的制備方法簡單、方便，相較于未低溫誘導(dǎo)的方法，其產(chǎn)量提高了15％-20％，且獲得的產(chǎn)品蛋白含量在97-99％之間。
發(fā)明人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液凍干粉的制備方法所制備的凍干粉最大程度上保存了人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清中的各種具有生物活性的細(xì)胞因子混合物，為人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液的在美容等方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
附圖說明
圖1顯示了不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)方式得到的人間充質(zhì)干細(xì)胞上清對人真皮成纖維細(xì)胞生長的促進作用。
具體實施方式
為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1
人間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取方法
人間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取方法，包括以下步驟：
(1)所用細(xì)胞來源于無菌條件取足月產(chǎn)的嬰兒臍帶5-10cm,生理鹽水洗干凈至組織無血色,去除表皮、兩條動脈血管及一條靜脈血管,將組織剪碎,用0.1％I型膠原酶37℃消化1小時，400g離心5min，吸棄上清，混勻用200目篩網(wǎng)過濾，所獲得的細(xì)胞懸液1200r/min，離心8min，細(xì)胞沉淀加入含10％FBS的DMEN/F12培養(yǎng)基(含雙抗)，37℃、飽和濕度、5％CO2:培養(yǎng)大約一個星期,即可得到原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。細(xì)胞融合度70％-80％時,0.25％的胰蛋白酶(含0.02％EDTA)消化細(xì)胞傳代培養(yǎng)。
(2)干細(xì)胞的收集:人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，當(dāng)生長到70％-80％融合度時，收集培養(yǎng)干細(xì)胞，用生理鹽水沖洗細(xì)胞三次。
實施例2
人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液凍干粉的制備方法
人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液凍干粉的制備方法，包括以下步驟：
(1)低溫誘導(dǎo)干細(xì)胞因子的分泌：將實施例1中收集的低代數(shù)細(xì)胞重懸于生理鹽水，在4℃、飽和濕度、5％CO2條件下,培養(yǎng)72小時；其間，當(dāng)人間充質(zhì)干細(xì)胞生長到70-90％匯合度時，收集培養(yǎng)上清液，并與DMEM無血清培養(yǎng)基等體積混合，繼續(xù)用于人間充質(zhì)干細(xì)胞的擴大培養(yǎng)，如此反復(fù)至細(xì)胞傳代至10～15代，收集全部細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用于后續(xù)凍干粉的制備。
(2)凍干粉的制備:將收集的培養(yǎng)上清液至3.5KDa透析袋中，在4℃條件下，將透析袋埋入PEG20000中脫水4小時；將透析袋置于圓底燒瓶中抽真空，升華干燥，除去冰晶，最后制得凍干粉，-20℃保存。
實施例3
使用不同的方法誘導(dǎo)培養(yǎng)實施例1中收集的第5代的干細(xì)胞，具體如下：
1.1空白對照
取第5代的干細(xì)胞，用生理鹽水洗滌細(xì)胞三次，加入DMEM無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72小時，收集上清。取干細(xì)胞培養(yǎng)上清測定其對人真皮成纖維細(xì)胞增殖活性。
1.2紫外線誘導(dǎo)
取第5代的干細(xì)胞，用生理鹽水洗滌細(xì)胞三次，加入DMEM無血清培養(yǎng)基，UVA照射細(xì)胞2h(間隔22小時，照射三次)，培養(yǎng)72小時，收集上清。取干細(xì)胞培養(yǎng)上清測定其對人真皮成纖維細(xì)胞增殖活性。
1.3機械摩擦
取第5代的干細(xì)胞，用生理鹽水洗滌細(xì)胞三次，加入DMEM無血清培養(yǎng)基，用無菌針頭在細(xì)胞表面摩擦損傷細(xì)胞(每次摩擦10分鐘，每24小時做一次)，培養(yǎng)72小時，收集上清。取干細(xì)胞培養(yǎng)上清測定其對人真皮成纖維細(xì)胞增殖活性。
1.4低營養(yǎng)方法
取第5代的干細(xì)胞，用生理鹽水洗滌細(xì)胞三次，加入舊DMEM無血清培養(yǎng)基(即將洗滌之前的細(xì)胞培養(yǎng)基收集，待細(xì)胞洗滌后加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用舊的培養(yǎng)基養(yǎng)細(xì)胞)，繼續(xù)培養(yǎng)72小時，收集上清。取干細(xì)胞培養(yǎng)上清測定其對人真皮成纖維細(xì)胞增殖活性。
1.5低溫
取第5代干細(xì)胞，用生理鹽水洗滌細(xì)胞三次，加入DMEM無血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞分別置于4℃、8℃、10℃的恒溫冰箱中，繼續(xù)培養(yǎng)72小時，收集上清。取干細(xì)胞培養(yǎng)上清測定其對人真皮成纖維細(xì)胞增殖活性。
2.1不同誘導(dǎo)條件干細(xì)胞分泌細(xì)胞因子量的檢測
采用考馬斯亮藍(lán)法檢測干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的量。即首先獲得蛋白質(zhì)濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測得樣品的吸光值，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，獲得樣品中蛋白的濃度，結(jié)果如下表所示。
由上表可見：1)干細(xì)胞會分泌大量的細(xì)胞因子和其他細(xì)胞產(chǎn)物，在不誘導(dǎo)的條件下細(xì)胞會分泌大量的細(xì)胞因子(空白對照，753μg/ml)；2)在不同的誘導(dǎo)條件下，均會刺激干細(xì)胞分泌因子。其中誘導(dǎo)效果為：低溫誘導(dǎo)〉紫外線誘導(dǎo)〉低營養(yǎng)誘導(dǎo)〉摩擦誘導(dǎo)。其中，紫外線誘導(dǎo)和低溫誘導(dǎo)的方法具有更加明顯的效果，低溫誘導(dǎo)是最優(yōu)組，特別是4℃下；3)低溫誘導(dǎo)作為最優(yōu)組，可能的原因為在其它誘導(dǎo)條件下，細(xì)胞會有大量的死亡，而在低溫條件下，細(xì)胞死亡數(shù)量少。
2.2對人真皮成纖維細(xì)胞增殖活性檢測
以1*104/孔的人真皮成纖維細(xì)胞的量加入96孔板，37℃、5％CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，棄上清，分別加入空白對照、紫外線誘、摩擦、低營養(yǎng)、低溫誘導(dǎo)方法獲得的干細(xì)胞上清，同時加入胎牛血清(10％),37℃、5％CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時,加入MTT 20μl/孔，培養(yǎng)4小時后，棄上清，加入二甲基亞砜(DMSO)10020μl/孔，震蕩15min，酶標(biāo)儀比色(波長570nm，參考波長630nm)，測吸光度A值。計算干細(xì)胞上清對人真皮成纖維細(xì)胞生長的促進作用。細(xì)胞促生長率＝加樣組A570/1*104人真皮成纖維細(xì)胞A570，結(jié)果如圖1所示，其中低溫為10℃下的結(jié)果。
綜上通過比較不同的物理刺激對于干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的影響，可以看出，低溫對于細(xì)胞因子的分泌具有較為顯著的效果。
人間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中可分泌許多細(xì)胞因子(蛋白質(zhì))，因此細(xì)胞培養(yǎng)上清液含有各種分泌的具有生物活性的細(xì)胞因子，主要有:表皮生長因子(EGF)，堿性成纖維生長因子(BFGF)，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，血小板衍化生長因子(PDGF)，角化細(xì)胞生長因子(KGF)等。表皮生長因子能促進表皮細(xì)胞新陳代謝，快速代謝老化角質(zhì)，修復(fù)痘印，細(xì)化皺紋，增強自身肌膚的保水及鎖水能力，具有增強肌膚彈性、減少皺紋，防止肌膚衰老和滲透滋養(yǎng),促進膠原蛋白的合成等作用。堿性成纖維生長因子，促進真皮細(xì)胞的增殖、分化，改善細(xì)胞生活微環(huán)境，促進受損皮膚的修復(fù)和細(xì)化皺紋，恢復(fù)細(xì)胞活力，內(nèi)源性調(diào)節(jié)膠原蛋白讓皮膚充盈有彈性，煥發(fā)健康光澤，可用于問題性皮膚的深層修復(fù)和除皺，同時啟動皮膚創(chuàng)傷愈合過程，減少傷口愈合過程中瘢痕組織的形成。胰島素樣生長因子-1對內(nèi)皮細(xì)胞起趨化作用，快速修復(fù)受損的皮膚，加快不同類型細(xì)胞的分裂和增殖,增加膠原蛋白的合成，去除皺紋。轉(zhuǎn)化生長因子-β，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，它能促進膠原纖維、網(wǎng)狀纖維和彈性纖維的形成,調(diào)節(jié)膠原蛋白形成，減少皺紋，調(diào)節(jié)皮膚油脂的分泌，使皮膚緊致，有光澤。血小板衍化生長因子使細(xì)胞向皮膚損傷部位聚集,并在那里分化、增殖，修復(fù)破損皮膚組織；同時還抑制結(jié)締組織細(xì)胞的溶解,延長其存活時間,從而選擇性地刺激結(jié)締組織細(xì)胞生長,促進皮膚組織損傷后的修復(fù)和愈合。角化細(xì)胞生長因子是角化細(xì)胞和毛囊形成過程中最重要的影響因素,刺激DNA的合成,促進維持人角化細(xì)胞、表皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞的生長，從而從整體上調(diào)節(jié)各種皮膚問題。
但是常規(guī)細(xì)胞因子溶于液體后保存期僅為數(shù)周，不利于干細(xì)胞在美容等方面的推廣應(yīng)用。而本發(fā)明人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液凍干粉的制備方法所制備的凍干粉有效地保存了人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的各種具有生物活性的細(xì)胞因子混合物，保存期可延長到2年，有效地解決上清液保存期有限這一瓶頸，為人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。