本發(fā)明專利屬于微生物及其應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及一株高效降解氮污染物的芽孢桿菌，為白翎芽孢桿菌BBHS-01，可高效降解水產(chǎn)養(yǎng)殖水體氮污染物，能應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的水環(huán)境調(diào)控以及微生態(tài)修復(fù)，能凈化水質(zhì)、顯著改善養(yǎng)殖水環(huán)境；本發(fā)明還涉及一種以上述白翎芽孢桿菌BBHS-01為主要成分的復(fù)合菌制劑；本發(fā)明還涉及一種以上述白翎芽孢桿菌BBHS-01為主要成分的復(fù)合菌制劑的制備方法。

背景技術(shù)：

20世紀(jì)80年代以來(lái)，在野生資源匱乏受限和廣大消費(fèi)市場(chǎng)需求的驅(qū)動(dòng)下，我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，養(yǎng)殖集約化程度越來(lái)越高，與此同時(shí)，養(yǎng)殖水體污染日益加劇，其中在集約化養(yǎng)殖污染中以氮污染尤為突出。

養(yǎng)殖水體中的氮主要以分子態(tài)氮、有機(jī)氮、無(wú)機(jī)氮形式存在。在無(wú)機(jī)態(tài)氮中，氨氮和亞硝氮態(tài)氮對(duì)養(yǎng)殖水生動(dòng)物具有強(qiáng)烈地毒害作用，甚至?xí)痧B(yǎng)殖生物死亡。有研究表明，凡納濱對(duì)蝦對(duì)氨氮和亞硝氮的耐受濃度分別為2.667mg/L和5.551mg/L。此外水體中的氮含量過(guò)高，會(huì)造成養(yǎng)殖水體中的浮游植物過(guò)量生長(zhǎng)，大量消耗水體的氧氣，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖生物的正常生活和生長(zhǎng)。因此水產(chǎn)養(yǎng)殖中的高濃度的氨氮和亞硝氮成為影響?zhàn)B殖生物生長(zhǎng)和健康、制約養(yǎng)殖發(fā)展的重要因素。

為了提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)速度，過(guò)量的投餌導(dǎo)致大量殘餌的累積，殘餌中溶解出的有機(jī)氮等有害物質(zhì)不易被分解，水體中氮的累積超過(guò)養(yǎng)殖生物的 耐受范圍會(huì)對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生直接的毒害作用。

隨著微生物技術(shù)的發(fā)展，利用有益微生物進(jìn)行微生物調(diào)控來(lái)改善和凈化水質(zhì)，受到越來(lái)越多的關(guān)注和研究。已有研究者提出微生物在養(yǎng)殖池塘中起著至關(guān)重要的作用，降解微生物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有凈化水質(zhì)、改善和修復(fù)養(yǎng)殖水環(huán)境的功能。近年，利用有益降解微生物研制成益生菌或復(fù)合菌制劑產(chǎn)品直接投入到水體中使用，用以改善和修復(fù)養(yǎng)殖水環(huán)境的研究越來(lái)越多，已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌等復(fù)合菌制劑可有效的降解水體中的有機(jī)污泥，促進(jìn)羅非魚(Tilapia)生長(zhǎng)；另有學(xué)者在實(shí)驗(yàn)水族箱內(nèi)添加莢膜紅假單胞菌(Rhodopseudomonas capsulata)1d后，測(cè)得水體中的亞硝酸鹽和氨氮含量分別降低了70％-81％和35％-41％；此外，已有學(xué)者研究了在羅非魚(Tilapia)養(yǎng)殖過(guò)程中使用菌制劑的作用，研究發(fā)現(xiàn)水體中的氨氮和亞硝氮含量明顯降低，養(yǎng)殖水體底層溶氧增加，養(yǎng)殖水質(zhì)明顯改善。

由于應(yīng)用于養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)控的益生菌制劑具有針對(duì)性和適應(yīng)性差等缺點(diǎn)，因此從養(yǎng)殖水體、底質(zhì)環(huán)境中分離篩選有益的菌株并以此為基礎(chǔ)制成菌制劑，在水產(chǎn)養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)控與修復(fù)的應(yīng)用中具有極為深遠(yuǎn)的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種可應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的水環(huán)境調(diào)控以及微生態(tài)修復(fù)的菌株——白翎芽孢桿菌BBHS-01(Bacillus baekryungensis)，其具有高效降解養(yǎng)殖水體氮污染物的功效，能凈化水質(zhì)、顯著改善養(yǎng)殖水環(huán)境。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案，一株高效降解氮污染物的芽孢桿菌，為白翎芽孢桿菌BBHS-01(Bacillus baekryungensis)，于2012年12月7日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為：CGMCC NO.6939，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

一種上述高效降解氮污染物的芽孢桿菌——白翎芽孢桿菌BBHS-01(Bacillus baekryungensis)在降解水產(chǎn)養(yǎng)殖污染物中的應(yīng)用。

所述芽孢桿菌——白翎芽孢桿菌BBHS-01(Bacillus baekryungensis)的降解性能主要包括對(duì)無(wú)機(jī)氮的降解方面，該菌株篩選自對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘。

經(jīng)發(fā)明人深入研究，從對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘底泥中分離馴化篩選獲得了上述可作為添加物可以高效降解水體無(wú)機(jī)氮的白翎芽孢桿菌BBHS-01(Bacillus baekryungensis)。所述白翎芽孢桿菌BBHS-01(Bacillus baekryungensis)的主要特征如下：

1、形態(tài)特征：

形態(tài)為桿狀，能運(yùn)動(dòng)，可產(chǎn)生芽孢，二分裂生殖，菌體單個(gè)、兩兩或短鏈相聚。

2、培養(yǎng)特征：

在海水2216E基礎(chǔ)培養(yǎng)基或?qū)ξr餌料培養(yǎng)基(市售對(duì)蝦餌料20g研成細(xì)粉，滅菌陳海水1000ml，浸泡48h后離心取上清，加瓊脂25g，調(diào)pH 7.8，121℃，滅菌20min)上于(5～45)℃下生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)溫度范圍為(18～28)℃，最佳溫度范圍為(24～28)℃，其生長(zhǎng)pH范圍為4～10，生長(zhǎng)最適pH范圍為7.5～8.0，其最適生長(zhǎng)的NaCl濃度范圍為30‰～60‰，28±1℃在2216E基礎(chǔ)培養(yǎng)基或?qū)ξr餌料培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h的菌落直徑可達(dá)1.8mm左右，菌落呈菌落呈乳白色、圓形、扁平、不透明、邊緣整齊、表面較干燥粗糙。在(0-6)h白翎芽孢桿菌處于生長(zhǎng)調(diào)整期，(6-22)h為生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，生長(zhǎng)速度明顯加快，尤其是(6-10)h內(nèi)，菌體生長(zhǎng)最快，22h后菌株進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期和衰亡期。

3、生理生化特征：

菌株革蘭氏陽(yáng)性，芽孢染色陽(yáng)性，油脂水解酶陽(yáng)性，淀粉水解酶陽(yáng)性，接 觸酶陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)陰性，葡萄糖氧化發(fā)酵產(chǎn)產(chǎn)氣、明膠陽(yáng)性、乳糖陽(yáng)性、麥芽糖陽(yáng)性、甘露醇陰性、甘露糖陽(yáng)性、蔗糖陰性、阿拉伯糖陰性、木糖陰性。

4、菌株鑒定

根據(jù)芽孢桿菌——白翎芽孢桿菌BBHS-01和相關(guān)菌株的16SrDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)最終確定菌株為白翎芽孢桿菌屬(Bacillus baekryungensis)的細(xì)菌。

5、降解特性

實(shí)驗(yàn)表明，所述芽孢桿菌——白翎芽孢桿菌BBHS-01對(duì)水體中的氨氮(NH₄-N)、亞硝酸氮(NO₂-N)和硝酸氮(NO₃-N)的去除率分別高達(dá)63.43％、93.98％、70.37％，可見(jiàn)該菌株在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的具有很大的應(yīng)用潛力。

本發(fā)明的另一目的是提供一種以上述芽孢桿菌為主要成分的復(fù)合菌制劑，所述復(fù)合菌制劑是由白翎芽孢桿菌BBHS-01、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌以6～8:1:1的細(xì)菌數(shù)比例復(fù)合而成。

所述枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌均購(gòu)自青島根源生物技術(shù)集團(tuán)公司。所述復(fù)合菌制劑能夠有效的去除養(yǎng)殖水體中的污染物，改善養(yǎng)殖環(huán)境。經(jīng)發(fā)明人反復(fù)研究表明，將上述各菌株以6～8:1:1的細(xì)菌數(shù)比例混合的優(yōu)點(diǎn)是不僅菌株生長(zhǎng)快、無(wú)拮抗作用，而且所制得的復(fù)合菌制劑對(duì)水體中的NH₄-N、NO₂-N以及NO₃-N的降解率高。

本發(fā)明還提供了一種上述以白翎芽孢桿菌BBHS-01為主要成分的復(fù)合菌制劑的制備方法，所述復(fù)合菌制劑的制備方法包括以下步驟：

(1)菌種活化與純化：將白翎芽孢桿菌BBHS-01、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌分別接種到改良后的2216E固體培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)22小時(shí)；所述改良后的2216E固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨6.0g、酵母粉3.0g、陳海水1000mL、瓊脂25.0g以及微量元素液1ml，所述微量元素液的微量元素成分 為：0.4g/L的K₂HPO₄·3H₂O，0.3g/L的MgSO₄·7H₂O，0.5g/L的MnSO₄，0.1g/L的FeSO₄·7H₂O，0.2g/L的CuSO₄，調(diào)節(jié)pH為7.6，121℃、101KPa滅菌30min；挑取單菌落接種到2216E固體斜面培養(yǎng)基，于28℃純化培養(yǎng)20小時(shí)，所得的試管斜面菌株為固體純化菌株，所述2216E固體斜面培養(yǎng)基所含成分同改良后的2216E固體培養(yǎng)基；

(2)制作三角瓶液體菌種：將試管斜面菌株分別接種于改良后的2216E液體培養(yǎng)基上，于28℃、160rpm培養(yǎng)20小時(shí)，得到各菌株的三角瓶液體菌種；所述改良后的2216E液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨6.0g、酵母粉3.0g、陳海水1000mL以及微量元素液1ml，所述微量元素液的微量元素組分為：0.4g/L的K₂HPO₄·3H₂O，0.3g/L的MgSO₄·7H₂O，0.5g/L的MnSO₄，0.1g/L的FeSO₄·7H₂O，0.2g/L的CuSO₄；

(4)混合菌液的制備：將培養(yǎng)好的各菌株的三角瓶液體菌種按照白翎芽孢桿菌BBHS-01、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌以6～8:1:1的細(xì)菌數(shù)比例接種到2216E液體培養(yǎng)基中，于28℃、160rpm培養(yǎng)20小時(shí)，得到三菌株的三角瓶混合液體菌種；

(5)復(fù)合菌制劑的制備：

a.將酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、豆粕粉、麥麩皮和水以2：6：1：1：2：10的重量比混合均勻，制成培養(yǎng)基固型物；

b.將沸石粉、花生粕和麥飯石粉以1：1：1的重量比例混合，所得混合物作為輔料填充物；

c.將海泥用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩，過(guò)篩后加入提取罐中，將質(zhì)量濃度為50％的酒精加入提取罐中，酒精用量為海泥重量的10倍，開(kāi)啟攪拌，將提取罐置于恒溫水浴搖床，在140rpm、70～80℃條件下提取30min，100目過(guò)濾取濾液， 濾渣返回提取罐中重復(fù)提取一次，100目過(guò)濾取濾液，合并兩次所得濾液，得海泥浸出液；

d.稱取以下重量份數(shù)的各組分：碎木屑12～15份、麥秸10～12份、桑葉10～12份、浮萍9～10份、白楊樹(shù)皮9～10份、魚鱗5份、苦瓜4～5份、蘆根1份、干酒糟1份、干酵母1份、貝殼粉1份，將稱量好的各組分混勻，并向混合物中加入等量的純化水，攪拌混勻，放入玻璃容器，28℃～30℃條件下避光發(fā)酵56小時(shí)，得發(fā)酵產(chǎn)物，將所得發(fā)酵產(chǎn)物用100目篩網(wǎng)過(guò)濾，取過(guò)濾所得的發(fā)酵液；

e.將培養(yǎng)基固型物、海泥浸出液、三角瓶混合液體菌種按照4：1：60的重量比例均勻混合，然后置于發(fā)酵罐內(nèi)于28℃，攪拌速度180～200rpm，通氣量為4V/V.min，培養(yǎng)5d，得到混合發(fā)酵菌液；

f.將輔料填充物、發(fā)酵液、膨潤(rùn)土、混合發(fā)酵菌液按照1：1～2：1：8～9的重量比混合，置于50℃烘干機(jī)烘干，粉碎，制成復(fù)合菌制劑。

步驟(5)的d操作步驟中，將所得發(fā)酵產(chǎn)物用100目篩網(wǎng)過(guò)濾，取過(guò)濾所得的發(fā)酵液的作用是防止發(fā)酵產(chǎn)物中的固體殘?jiān)M(jìn)入養(yǎng)殖水體，避免對(duì)養(yǎng)殖水體帶來(lái)二次污染。

優(yōu)選地，所述沸石粉和麥飯石粉的粒徑為100目，所述膨潤(rùn)土的粒徑為150目。由于比表面積的大小會(huì)對(duì)吸附效果產(chǎn)生影響，因此本發(fā)明的膨潤(rùn)土與沸石粉和麥飯石粉形成了不同比表面積的顆粒組團(tuán)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將膨潤(rùn)土與沸石粉和麥飯石粉粉碎至不同的粒徑，有利于提高膨潤(rùn)土、沸石粉和麥飯石粉之間的協(xié)同吸附作用，進(jìn)而提高復(fù)合菌制劑對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖污染物和氮污染物的降解率。

優(yōu)選地，步驟(4)中，芽孢桿菌BBHS-01、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌 以7:1:1的細(xì)菌數(shù)比例接種到2216E液體培養(yǎng)基中。

優(yōu)選地，步驟(5)的d操作步驟中，稱取的各組分的重量份數(shù)如下：碎木屑15份、麥秸12份、桑葉10份、浮萍10份、白楊樹(shù)皮9份、魚鱗5份、苦瓜4份、蘆根1份、干酒糟1份、干酵母1份、貝殼粉1份。

優(yōu)選地，步驟(5)的f操作步驟中，輔料填充物、發(fā)酵液、膨潤(rùn)土混合發(fā)酵菌液按照1：2：1：8的重量比混合。

在本發(fā)明中，復(fù)合菌制劑對(duì)水體中的NH₄-N、NO₂-N以及NO₃-N的最高降解率分別為93.27％、100.00％和92.09％，復(fù)合菌制劑的降解效果顯著優(yōu)于單菌株，可見(jiàn)芽孢桿菌BBHS-01、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌對(duì)氮污染物的降解作用方面具有協(xié)同作用，提高了白翎芽孢桿菌BBHS-01對(duì)氮污染物的降解率，此外，本發(fā)明的復(fù)合菌制劑具有存儲(chǔ)和使用方便的優(yōu)點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有廣闊的應(yīng)用前景。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明的白翎芽孢桿菌BBHS-01對(duì)水體中的氨氮(NH₄-N)、亞硝酸氮(NO₂-N)和硝酸氮(NO₃-N)的去除率分別高達(dá)63.43％、93.98％、70.37％，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的具有很大的應(yīng)用潛力；(2)將白翎芽孢桿菌BBHS-01、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌以6～8:1:1的細(xì)菌數(shù)比例混合的優(yōu)點(diǎn)是不僅菌株生長(zhǎng)快、無(wú)拮抗作用，而且所制得的復(fù)合菌制劑對(duì)水體中的NH₄-N、NO₂-N以及NO₃-N的降解率高，對(duì)水體中的NH₄-N、NO₂-N以及NO₃-N的最高降解率分別為93.27％、100.00％和92.09％，復(fù)合菌制劑的降解效果優(yōu)于單菌株，可見(jiàn)白翎芽孢桿菌BBHS-01、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌對(duì)氮污染物的降解作用方面具有協(xié)同作用；(3)本發(fā)明的復(fù)合菌制劑具有存儲(chǔ)和使用方便的優(yōu)點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的白翎芽孢桿菌BBHS-01的生長(zhǎng)曲線；

圖2為白翎芽孢桿菌BBHS-01及相關(guān)菌株的基于16SrDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

實(shí)施例1白翎芽孢桿菌的主要特征及其對(duì)水體污染物的降解實(shí)驗(yàn)

1.所述白翎芽孢桿菌BBHS-01(Bacillus baekryungensis)的主要特征如下：

(1)形態(tài)特征：

形態(tài)為桿狀，能運(yùn)動(dòng)，可產(chǎn)生芽孢，二分裂生殖，菌體單個(gè)、兩兩或短鏈相聚。

(2)培養(yǎng)特征：

在海水2216E基礎(chǔ)培養(yǎng)基或?qū)ξr餌料培養(yǎng)基(市售對(duì)蝦餌料20g研成細(xì)粉，滅菌陳海水1000ml，浸泡48h后離心取上清，加瓊脂25g，調(diào)pH 7.8，121℃，滅菌20min)上于(5～45)℃下生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)溫度范圍為(18～28)℃，對(duì)對(duì)蝦餌料成分降解的最佳溫度范圍為(24～28)℃，其生長(zhǎng)pH范圍為4～10，生長(zhǎng)和餌料降解的最適pH范圍為7.5～8.0，其最適生長(zhǎng)的NaCl濃度范圍為30‰～60‰，(28±1)℃在2216E基礎(chǔ)培養(yǎng)基或?qū)ξr餌料培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h的菌落直徑可達(dá)1.8mm左右，菌落呈菌落呈乳白色、圓形、扁平、不透明、邊緣整齊、表面較干燥粗糙。在(0-6)h白翎芽孢桿菌處于生長(zhǎng)調(diào)整期，(6-22)h為生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，生長(zhǎng)速度明顯加快，尤其是(6-10)h內(nèi)，菌體生長(zhǎng)最快，22h后菌株進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期和衰亡期，其生長(zhǎng)曲線見(jiàn)附圖1。

(3)生理生化特征：

菌株革蘭氏陽(yáng)性，芽孢染色陽(yáng)性，油脂水解酶陽(yáng)性，淀粉水解酶陽(yáng)性，接觸酶陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)陰性，葡萄糖氧化發(fā)酵產(chǎn)產(chǎn)氣、明膠陽(yáng)性、乳糖陽(yáng)性、麥芽糖陽(yáng)性、甘露醇陰性、甘露糖陽(yáng)性、蔗糖陰性、阿拉伯糖陰性、木糖陰性。

(4)菌株鑒定

根據(jù)白翎芽孢桿菌BBHS-01和相關(guān)菌株的16SrDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)最終確定菌株為白翎芽孢桿菌屬(Bacillus baekryungensis)的細(xì)菌(見(jiàn)圖2，其中BBHS-01為本發(fā)明的菌株白翎芽孢桿菌)。

(5)降解特性

實(shí)驗(yàn)表明，所述白翎芽孢桿菌BBHS-01對(duì)水體中的氨氮(NH₄-N)、亞硝酸氮(NO₂-N)和硝酸氮(NO₃-N)的去除率分別高達(dá)63.43％、93.98％、70.37％，可見(jiàn)該菌株在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的具有很大的應(yīng)用潛力。

2.所述白翎芽孢桿菌BBHS-01(Bacillus baekryungensis)對(duì)水體污染物的降解實(shí)驗(yàn)：

(1)對(duì)蝦餌料固體平板生長(zhǎng)情況檢測(cè)：

從對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘底泥中分離篩選出白翎芽孢桿菌BBSH-01(保藏號(hào)為：CGMCC NO.6939)，該菌株于28±1℃在20g/L的對(duì)蝦餌料培養(yǎng)基(市售對(duì)蝦餌料20g研成細(xì)粉，滅菌陳海水1000ml，浸泡48h后離心取上清，加瓊脂25g，調(diào)pH 7.8，121℃，滅菌20min)上長(zhǎng)勢(shì)好，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)24的菌落直徑可達(dá)2mm左右。

(2)對(duì)蝦餌料浸出液的降解效果檢測(cè)：

1)白翎芽孢桿菌BBHS-01對(duì)對(duì)蝦餌料浸出液的降解效果實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)所用的降解液：為市售對(duì)蝦餌料20g研成細(xì)粉，滅菌陳海水1000ml，浸泡48h后離心取上清，加亞硝酸鈉0.058g，調(diào)pH 7.8，分裝成100mL/瓶，于 121℃，滅菌20min。

將白翎芽孢桿菌BBHS-01的24h活化培養(yǎng)物8000r/min離心10min，以無(wú)菌生理鹽水洗劑沉淀菌體，并稀釋成含1×10⁶CFU/mL的菌液，然后將菌液按1％的比例加至100mL的對(duì)蝦餌料降解液中，28±1℃、160r/min下震蕩培養(yǎng)5d，每天定時(shí)取樣，測(cè)定樣品液中的氨氮(NH₄-N)、亞硝酸氮(NO₂-N)和硝酸氮(NO₃-N)含量，菌體生長(zhǎng)量采用光電比濁法以O(shè)D₆₀₀表示，以不加菌作為對(duì)照處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表1和表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：白翎芽孢桿菌BBHS-01對(duì)對(duì)蝦餌料降解液具有明顯的降解效果，在實(shí)驗(yàn)期間隨著該菌株的生長(zhǎng)，可顯著降解餌料降解液中的無(wú)機(jī)氮成分，其中對(duì)NH₄-N、NO₂-N、NO₃-N的最高降解率分別為63.43％、93.98％、70.37％。

表1白翎芽孢桿菌BBHS-01于不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)餌料降解液的降解效果(1～5d)

表2白翎芽孢桿菌BBHS-01于不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)餌料降解液的降解效果(1～5d)

實(shí)施例2白翎芽孢桿菌BBHS-01、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的拮抗實(shí)驗(yàn)

三菌株的拮抗實(shí)驗(yàn)：分別取白翎芽孢桿菌BBHS-01、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌與2216E固體培養(yǎng)基劃線，置于28℃培養(yǎng)24h后，分別挑取單菌落在2216E固體培養(yǎng)基上進(jìn)行兩兩交叉十字劃線，將劃線的平板于28℃培養(yǎng)24h后，檢查菌株生長(zhǎng)情況，拮抗實(shí)驗(yàn)劃線培養(yǎng)結(jié)果表明三菌株均不存在拮抗作用。

實(shí)施例3復(fù)合菌制劑的制備方法

本實(shí)施例的復(fù)合菌制劑的制備方法包括以下步驟：

(1)菌種活化與純化：將白翎芽孢桿菌BBHS-01、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌分別接種到改良后的2216E固體培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)22小時(shí)；所述改良后的2216E固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨6.0g、酵母粉3.0g、陳海水1000mL、瓊脂25.0g以及微量元素液1ml，所述微量元素液的微量元素成分為：0.4g/L的K₂HPO₄·3H₂O，0.3g/L的MgSO₄·7H₂O，0.5g/L的MnSO₄，0.1g/L的FeSO₄·7H₂O，0.2g/L的CuSO₄，調(diào)節(jié)pH為7.6，121℃、101KPa滅菌30min；挑取單菌落接種到2216E固體斜面培養(yǎng)基，于28℃純化培養(yǎng)20小時(shí)，所得的試管斜面菌株為固體純化菌株，所述2216E固體斜面培養(yǎng)基所含成分同改良后的2216E固體培養(yǎng)基；

(2)制作三角瓶液體菌種：將試管斜面菌株分別接種于改良后的2216E液體培養(yǎng)基上，于28℃、160rpm培養(yǎng)20小時(shí)，得到各菌株的三角瓶液體菌種；所述改良后的2216E液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨6.0g、酵母粉3.0g、陳海水1000mL以及微量元素液1ml，所述微量元素液的微量元素組分為：0.4g/L的K₂HPO₄·3H₂O，0.3g/L的MgSO₄·7H₂O，0.5g/L的MnSO₄，0.1g/L的FeSO₄·7H₂O，0.2g/L的CuSO₄；

(4)混合菌液的制備：將培養(yǎng)好的各菌株的三角瓶液體菌種按照白翎芽孢桿菌BBHS-01、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌以7:1:1的細(xì)菌數(shù)比例接種到2216E液體培養(yǎng)基中，于28℃、160rpm培養(yǎng)20小時(shí)，得到三菌株的三角瓶混合液體菌種；

(5)復(fù)合菌制劑的制備：

a.將酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、豆粕粉、麥麩皮和水以2：6：1：1：2：10的重量比混合均勻，制成培養(yǎng)基固型物；

b.將沸石粉和麥飯石粉分別粉碎，并過(guò)100目篩，將沸石粉、花生粕和麥飯石粉以1：1：1的重量比例混合，所得混合物作為輔料填充物；

c.將海泥用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩，過(guò)篩后加入提取罐中，將質(zhì)量濃度為50％的酒精加入提取罐中，酒精用量為海泥重量的10倍，開(kāi)啟攪拌，將提取罐置于恒溫水浴搖床，在140rpm、70～80℃條件下提取30min，100目過(guò)濾取濾液，濾渣返回提取罐中重復(fù)提取一次，100目過(guò)濾取濾液，合并兩次所得濾液，得海泥浸出液；

d.按照下列重量份數(shù)稱取以下各組分：碎木屑15份、麥秸12份、桑葉10份、浮萍10份、白楊樹(shù)皮9份、魚鱗5份、苦瓜4份、蘆根1份、干酒糟1份、干酵母1份、貝殼粉1份，將稱量好的各組分混勻，并向混合物中加入等量的純化水，攪拌混勻，放入玻璃容器，28℃～30℃條件下避光發(fā)酵56小時(shí)，得發(fā)酵產(chǎn)物，將所得發(fā)酵產(chǎn)物用100目篩網(wǎng)過(guò)濾，取過(guò)濾所得的發(fā)酵液；

e.將培養(yǎng)基固型物、海泥浸出液、三角瓶混合液體菌種按照4：1：60的重量比例均勻混合，然后置于發(fā)酵罐內(nèi)于28℃，攪拌速度180～200rpm，通氣量為4V/V.min，培養(yǎng)5d，得到混合發(fā)酵菌液；

f.將膨潤(rùn)土粉碎并過(guò)150目篩，將輔料填充物、發(fā)酵液、膨潤(rùn)土、混合發(fā)酵 菌液按照1：2：1：8的重量比混合，置于50℃烘干機(jī)烘干，粉碎，制成復(fù)合菌制劑。

實(shí)施例4復(fù)合菌制劑的制備方法

本實(shí)施例的復(fù)合菌制劑的制備方法包括以下步驟：

(1)菌種活化與純化：將白翎芽孢桿菌BBHS-01、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌分別接種到改良后的2216E固體培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)22小時(shí)；所述改良后的2216E固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨6.0g、酵母粉3.0g、陳海水1000mL、瓊脂25.0g以及微量元素液1ml，所述微量元素液的微量元素成分為：0.4g/L的K₂HPO₄·3H₂O，0.3g/L的MgSO₄·7H₂O，0.5g/L的MnSO₄，0.1g/L的FeSO₄·7H₂O，0.2g/L的CuSO₄，調(diào)節(jié)pH為7.6，121℃、101KPa滅菌30min；挑取單菌落接種到2216E固體斜面培養(yǎng)基，于28℃純化培養(yǎng)20小時(shí)，所得的試管斜面菌株為固體純化菌株，所述2216E固體斜面培養(yǎng)基所含成分同改良后的2216E固體培養(yǎng)基；

(2)制作三角瓶液體菌種：將試管斜面菌株分別接種于改良后的2216E液體培養(yǎng)基上，于28℃、160rpm培養(yǎng)20小時(shí)，得到各菌株的三角瓶液體菌種；所述改良后的2216E液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨6.0g、酵母粉3.0g、陳海水1000mL以及微量元素液1ml，所述微量元素液的微量元素組分為：0.4g/L的K₂HPO₄·3H₂O，0.3g/L的MgSO₄·7H₂O，0.5g/L的MnSO₄，0.1g/L的FeSO₄·7H₂O，0.2g/L的CuSO₄；

(4)混合菌液的制備：將培養(yǎng)好的各菌株的三角瓶液體菌種按照白翎芽孢桿菌BBHS-01、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌以8:1:1的細(xì)菌數(shù)比例接種到2216E液體培養(yǎng)基中，于28℃、160rpm培養(yǎng)20小時(shí)，得到三菌株的三角瓶混合液體菌種；

(5)復(fù)合菌制劑的制備：

a.將酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、豆粕粉、麥麩皮和水以2：6：1：1：2：10的重量比混合均勻，制成培養(yǎng)基固型物；

b.將沸石粉和麥飯石粉分別粉碎，并過(guò)100目篩，將沸石粉、花生粕和麥飯石粉以1：1：1的重量比例混合，所得混合物作為輔料填充物；

c.將海泥用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩，過(guò)篩后加入提取罐中，將質(zhì)量濃度為50％的酒精加入提取罐中，酒精用量為海泥重量的10倍，開(kāi)啟攪拌，將提取罐置于恒溫水浴搖床，在140rpm、70～80℃條件下提取30min，100目過(guò)濾取濾液，濾渣返回提取罐中重復(fù)提取一次，100目過(guò)濾取濾液，合并兩次所得濾液，得海泥浸出液；

d.按照下列重量份數(shù)稱取以下各組分：碎木屑14份、麥秸10份、桑葉10份、浮萍9份、白楊樹(shù)皮9份、魚鱗5份、苦瓜4份、蘆根1份、干酒糟1份、干酵母1份、貝殼粉1份，將稱量好的各組分混勻，并向混合物中加入等量的純化水，攪拌混勻，放入玻璃容器，28℃～30℃條件下避光發(fā)酵56小時(shí)，得發(fā)酵產(chǎn)物，將所得發(fā)酵產(chǎn)物用100目篩網(wǎng)過(guò)濾，取過(guò)濾所得的發(fā)酵液；

e.將培養(yǎng)基固型物、海泥浸出液、三角瓶混合液體菌種按照4：1：60的重量比例均勻混合，然后置于發(fā)酵罐內(nèi)于28℃，攪拌速度180～200rpm，通氣量為4V/V.min，培養(yǎng)5d，得到混合發(fā)酵菌液；

f.將膨潤(rùn)土粉碎并過(guò)150目篩，將輔料填充物、發(fā)酵液、膨潤(rùn)土、混合發(fā)酵菌液按照1：1：1：9的重量比混合，置于50℃烘干機(jī)烘干，粉碎，制成復(fù)合菌制劑。

實(shí)施例5復(fù)合菌制劑的制備方法

本實(shí)施例的復(fù)合菌制劑的制備方法包括以下步驟：

(1)菌種活化與純化：將白翎芽孢桿菌BBHS-01、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌分別接種到改良后的2216E固體培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)22小時(shí)；所述改良后的2216E固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨6.0g、酵母粉3.0g、陳海水1000mL、瓊脂25.0g以及微量元素液1ml，所述微量元素液的微量元素成分為：0.4g/L的K₂HPO₄·3H₂O，0.3g/L的MgSO₄·7H₂O，0.5g/L的MnSO₄，0.1g/L的FeSO₄·7H₂O，0.2g/L的CuSO₄，調(diào)節(jié)pH為7.6，121℃、101KPa滅菌30min；挑取單菌落接種到2216E固體斜面培養(yǎng)基，于28℃純化培養(yǎng)20小時(shí)，所得的試管斜面菌株為固體純化菌株，所述2216E固體斜面培養(yǎng)基所含成分同改良后的2216E固體培養(yǎng)基；

(2)制作三角瓶液體菌種：將試管斜面菌株分別接種于改良后的2216E液體培養(yǎng)基上，于28℃、160rpm培養(yǎng)20小時(shí)，得到各菌株的三角瓶液體菌種；所述改良后的2216E液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨6.0g、酵母粉3.0g、陳海水1000mL以及微量元素液1ml，所述微量元素液的微量元素組分為：0.4g/L的K₂HPO₄·3H₂O，0.3g/L的MgSO₄·7H₂O，0.5g/L的MnSO₄，0.1g/L的FeSO₄·7H₂O，0.2g/L的CuSO₄；

(4)混合菌液的制備：將培養(yǎng)好的各菌株的三角瓶液體菌種按照白翎芽孢桿菌BBHS-01、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌以6:1:1的細(xì)菌數(shù)比例接種到2216E液體培養(yǎng)基中，于28℃、160rpm培養(yǎng)20小時(shí)，得到三菌株的三角瓶混合液體菌種；

(5)復(fù)合菌制劑的制備：

a.將酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、豆粕粉、麥麩皮和水以2：6：1：1：2：10的重量比混合均勻，制成培養(yǎng)基固型物；

b.將沸石粉、花生粕和麥飯石粉以1：1：1的重量比例混合，所得混合物作 為輔料填充物；

c.將海泥用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩，過(guò)篩后加入提取罐中，將質(zhì)量濃度為50％的酒精加入提取罐中，酒精用量為海泥重量的10倍，開(kāi)啟攪拌，將提取罐置于恒溫水浴搖床，在140rpm、70～80℃條件下提取30min，100目過(guò)濾取濾液，濾渣返回提取罐中重復(fù)提取一次，100目過(guò)濾取濾液，合并兩次所得濾液，得海泥浸出液；

d.按照下列重量份數(shù)稱取以下各組分：碎木屑12份、麥秸12份、桑葉12份、浮萍10份、白楊樹(shù)皮10份、魚鱗5份、苦瓜5份、蘆根1份、干酒糟1份、干酵母1份、貝殼粉1份，將稱量好的各組分混勻，并向混合物中加入等量的純化水，攪拌混勻，放入玻璃容器，28℃～30℃條件下避光發(fā)酵56小時(shí)，得發(fā)酵產(chǎn)物，將所得發(fā)酵產(chǎn)物用100目篩網(wǎng)過(guò)濾，取過(guò)濾所得的發(fā)酵液；

e.將培養(yǎng)基固型物、海泥浸出液、三角瓶混合液體菌種按照4：1：60的重量比例均勻混合，然后置于發(fā)酵罐內(nèi)于28℃，攪拌速度180～200rpm，通氣量為4V/V.min，培養(yǎng)5d，得到混合發(fā)酵菌液；

f.將輔料填充物、發(fā)酵液、膨潤(rùn)土、混合發(fā)酵菌液按照1：2：1：9的重量比混合，置于50℃烘干機(jī)烘干，粉碎，制成復(fù)合菌制劑。

實(shí)施例6實(shí)施例3～實(shí)施例5所得的復(fù)合菌制劑對(duì)水體污染物的降解實(shí)驗(yàn)

1、復(fù)合菌制劑對(duì)對(duì)蝦餌料浸出液的降解效果實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)所用的降解液：為市售對(duì)蝦餌料20g研成細(xì)粉，滅菌陳海水1000ml，浸泡48h后離心取上清，加亞硝酸鈉0.058g，調(diào)pH 7.8，分裝成100mL/瓶，于121℃，高壓滅菌20min。

分別取實(shí)施例3～實(shí)施例5所得的復(fù)合菌制劑1mg，分別添加到100mL的對(duì)蝦餌料降解液中，28±1℃、160r/min下震蕩培養(yǎng)5d，每天定時(shí)取樣，測(cè)定樣 品液中的氨氮(NH₄-N)、亞硝酸氮(NO₂-N)和硝酸氮(NO₃-N)含量，菌體生長(zhǎng)量采用光電比濁法以O(shè)D₆₀₀表示，以不加菌制劑的作為對(duì)照處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表3～表6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：復(fù)合菌制劑對(duì)對(duì)蝦餌料降解液具有明顯的降解效果，在實(shí)驗(yàn)期間隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，可顯著降解餌料降解液中的無(wú)機(jī)氮成分，其中對(duì)NH₄-N、NO₂-N以及NO₃-N的最高降解率分別為93.27％、100.00％和92.09％，復(fù)合菌制劑對(duì)污染物的降解效果優(yōu)于單菌株。

表3實(shí)施例3所得的復(fù)合菌制劑于不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)餌料降解液的降解效果(1～5d)

表4實(shí)施例3所得的復(fù)合菌制劑于不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)餌料降解液的降解效果(1～5d)

表5實(shí)施例4所得的復(fù)合菌制劑于不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)餌料降解液的降解效果(1～5d)

表6實(shí)施例5所得的復(fù)合菌制劑于不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)餌料降解液的降解效果(1～5d)

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。