本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)方法,尤其是一種體外三維呼吸道干/祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù):
呼吸道干/祖細(xì)胞是呼吸道上皮修復(fù)與再生的重要細(xì)胞。與呼吸道上皮細(xì)胞粘膜損傷、增生或癌變可致支氣管哮喘、慢阻肺或肺癌等許多重大疾病密切相關(guān)。
目前呼吸道干/祖細(xì)胞的表型還沒(méi)有被完全揭示,對(duì)其功能與調(diào)控的研究受到一定的限制。因此建立一種體外三維呼吸道干/祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法將大大有益于呼吸道干/祖細(xì)胞功能研究。
現(xiàn)階段呼吸道干/祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法中支持細(xì)胞來(lái)源于小鼠的原代肺成纖維細(xì)胞,這些細(xì)胞需要利用流式分選獲得,由于含量不高,一次實(shí)驗(yàn)常常需要多只小鼠,不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力,還增加很多試劑成本。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種體外三維呼吸道干/祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明的技術(shù)方案是:
一種體外三維呼吸道干/祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法,具體步驟如下:
(1)將呼吸道干/祖細(xì)胞與MLg細(xì)胞(小鼠肺成纖維細(xì)胞)均勻混合在50μl的含10%胎牛血清的HBSS緩沖液里,其中,呼吸道干/祖細(xì)胞的用量為1000-10000細(xì)胞/小室,MLg細(xì)胞用量為200000細(xì)胞/小室,加入50μl Matrigel基質(zhì)膠,繼續(xù)混合均勻后將其加入細(xì)胞培養(yǎng)小室內(nèi);
(2)于37℃培養(yǎng)箱中靜置30分鐘,使Matrigel基質(zhì)膠凝固;
(3)向細(xì)胞培養(yǎng)小室下方的對(duì)應(yīng)孔板中加入410μl DMEM/F12培養(yǎng)基,將孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每隔一天換一次培養(yǎng)基,培養(yǎng)14天后呼吸道干/祖細(xì)胞長(zhǎng)成球狀結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選的,上述體外三維呼吸道干/祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法,所述呼吸道干/祖細(xì)胞為懸浮人、小鼠或其它哺乳動(dòng)物的呼吸道干/祖細(xì)胞。
優(yōu)選的,上述體外三維呼吸道干/祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法,所述細(xì)胞培養(yǎng)小室為德國(guó)Greiner Bio-One 1孔圓形可反復(fù)使用的細(xì)胞培養(yǎng)小室。
優(yōu)選的,上述體外三維呼吸道干/祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法,所述DMEM/F12培養(yǎng)基包括10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰島素、運(yùn)鐵蛋白、亞硒酸鈉、SB431542(為T(mén)GF-βReceptor抑制劑)和蒸餾水,其中,每100ml DMEM/F12培養(yǎng)基含10ml胎牛血清,10000U青霉素,10mg鏈霉素,1mg胰島素,0.55mg運(yùn)鐵蛋白,0.5μg亞硒酸鈉、10μM SB431542(為T(mén)GF-βReceptor抑制劑),其余為蒸餾水。
本發(fā)明的有益效果是:
所述體外三維呼吸道干/祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法,以小鼠成纖維細(xì)胞系為支持細(xì)胞,大大降低實(shí)驗(yàn)成本,而且時(shí)間快速,呼吸道干/祖細(xì)胞長(zhǎng)成球狀結(jié)構(gòu)所需用的時(shí)間由現(xiàn)有的4周縮短為2周,在呼吸道干/祖細(xì)胞表型鑒定之前可以研究其功能與調(diào)控。
附圖說(shuō)明
圖1是呼吸道干/祖細(xì)胞的球狀結(jié)構(gòu)圖;
圖2是呼吸道干細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)情況圖。
具體實(shí)施方式
為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案,下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1
一種體外三維呼吸道干/祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法,具體步驟如下:
(1)將小鼠呼吸道干/祖細(xì)胞與MLg細(xì)胞(小鼠肺成纖維細(xì)胞)均勻混合在50μl的含10%胎牛血清的HBSS緩沖液里,其中,呼吸道干/祖細(xì)胞的用量為1000-10000細(xì)胞/小室,MLg細(xì)胞用量為200000細(xì)胞/小室,加入50μl Matrigel基質(zhì)膠,繼續(xù)混合均勻后將其加入細(xì)胞培養(yǎng)小室內(nèi),所述細(xì)胞培養(yǎng)小室為德國(guó)Greiner Bio-One 1孔圓形可反復(fù)使用的細(xì)胞培養(yǎng)小室;
(2)于37℃培養(yǎng)箱中靜置30分鐘,使Matrigel基質(zhì)膠凝固;
(3)向細(xì)胞培養(yǎng)小室下方的對(duì)應(yīng)孔板中加入410μl DMEM/F12培養(yǎng)基,將孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每隔一天換一次培養(yǎng)基,培養(yǎng)14天后呼吸道干/祖細(xì)胞可長(zhǎng)成球狀結(jié)構(gòu)(球狀細(xì)胞圖片見(jiàn)圖1),其中,所述DMEM/F12培養(yǎng)基包括10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰島素、運(yùn)鐵蛋白、亞硒酸鈉、SB431542(為T(mén)GF-βReceptor抑制劑)和蒸餾水,其中,每100ml DMEM/F12培養(yǎng)基含10ml胎牛血清,10000U青霉素,10mg鏈霉素,1mg胰島素,0.55mg運(yùn)鐵蛋白,0.5μg亞硒酸鈉、10μM SB431542(為T(mén)GF-βReceptor抑制劑),其余為蒸餾水。
實(shí)施例2
采用實(shí)施例1所述方法進(jìn)行呼吸道干/祖細(xì)胞體外三維細(xì)胞培養(yǎng),這種方法幫助在無(wú)法純化干細(xì)胞的情況下仍然可以研究氣道干細(xì)胞的功能和調(diào)控。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下:
針對(duì)培養(yǎng)后的小鼠呼吸道干/祖細(xì)胞設(shè)定對(duì)照組和藥物處理組(JAG1)。培養(yǎng)14天后,在顯微鏡下觀察并記錄克隆生長(zhǎng)情況。發(fā)現(xiàn)在呼吸道干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入JAG1后,呼吸道干細(xì)胞的克隆形成率明顯下降(見(jiàn)圖2),這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明JAG1抑制呼吸道干細(xì)胞的增殖,說(shuō)明Notch1信號(hào)通路直接或間接調(diào)控呼吸道干細(xì)胞的功能。
上述參照具體實(shí)施方式對(duì)該體外三維呼吸道干/祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法進(jìn)行的詳細(xì)描述,是說(shuō)明性的而不是限定性的,可按照所限定范圍列舉出若干個(gè)實(shí)施例,因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改,應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。