本發(fā)明屬于生物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從油橄欖果渣中提取分離熊果酸的方法。
背景技術(shù)：
油橄欖(Olea europare L.)是世界著名的木本油料樹種，有4000多年的栽培歷史。油橄欖果經(jīng)壓榨后產(chǎn)生大量的果渣，大部分直接被廢棄，不僅嚴(yán)重污染環(huán)境，也造成了資源的浪費。油橄欖果渣由油橄欖果皮、果核及殘余果肉組成，其中主要含有三萜類、黃酮類、揮發(fā)油、維生素等有效成分。三萜類化合物主要是由6個異戊二烯結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成，大部分為含30個碳原子的萜類化合物。油橄欖果渣三萜類成分主要包括齊墩果酸、山楂酸和熊果酸，而這三種物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，通常采用柱色譜技術(shù)將其進行分離，但反復(fù)硅膠柱色譜分離和重結(jié)晶導(dǎo)致最終得到的樣品量很少。又由于柱色譜技術(shù)普遍存在處理周期長，連續(xù)操作性不強，不易作為分離介質(zhì)用于生物活性物質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)進程。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種從油橄欖果渣中提取熊果酸的方法，該方法簡單，周期短，得到的熊果酸純度高，收率大。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案是從油橄欖果渣中提取熊果酸的方法，包括以下步驟：
1)將油橄欖果渣用體積濃度為70～90％的乙醇溶液提取，將提取液過濾，取濾液減壓回收乙醇，得到粗提物；
2)將粗提物加入體積濃度為50～65％乙醇溶液重新溶解，得到混合溶液；
3)將混合溶液上AB-8大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫至無色，然后采用40～50℃、0.1～0.15mol/L的碳酸氫鈉溶液進行洗脫，再用75～78℃、0.6～0.8mol/L的碳酸氫鈉溶液進行洗脫，收集第三次洗脫液，調(diào)節(jié)pH至3～5，過濾，取濾渣干燥，即得。
在步驟1)中，采用體積濃度為70～90％的乙醇溶液提取橄欖果渣，可充分提取橄欖果渣中的齊墩果酸、山楂酸以及熊果酸。橄欖果渣與乙醇溶液的料液比為1g：10～20ml。所述提取為加熱回流提取，提取次數(shù)為1～3次，每次提取時間為1～3h。
步驟2)中，采用體積濃度為50～65％的乙醇溶液溶解粗提物，可去除粗提物中極性較小的雜質(zhì)，起到初步純化的效果。加入乙醇溶液至粗提物濃度為0.06～0.10g/ml，此時上柱的吸附效果最佳。
步驟3)中，AB-8型號的大孔樹脂為弱極性，平均孔徑為13～14nm，比表面積為480～520m2/g。由于齊墩果酸、山楂酸、熊果酸均為弱極性物質(zhì)，且具有一定的疏水性，生成氫鍵的能力較弱，因而易被非極性及弱極性樹脂所吸附。其次，大孔吸附樹脂吸附物質(zhì)時，被吸附組分是通過樹脂的孔徑擴散到樹脂孔內(nèi)表面而被吸附，當(dāng)樹脂孔徑小于吸附的有效成分分子時，有效成分分子不能進入樹脂內(nèi)部，只能吸附在樹脂外表面，當(dāng)樹脂孔徑大于有效成分分子時，有效成分既能吸附在樹脂外表面也可吸附在內(nèi)表面，對山楂酸、齊墩果酸以及熊果酸來說，其分子量分別為472、456和456，因此采用AB-8大孔樹脂的吸附效果較好。樹脂柱的徑高比為1:3～6為宜，以1:4最佳。
齊墩果酸、山楂酸和熊果酸結(jié)構(gòu)極為相似，其中熊果酸和齊墩果酸更是同分異構(gòu)體，普通的柱色譜很難將其分離開來，但是本發(fā)明采用40～50℃、0.1～0.15mol/L的碳酸氫鈉溶液可以與樹脂中極性較大的山楂酸反應(yīng)生成可溶性鈉鹽，進而洗脫下來，而極性偏小的齊墩果酸和熊果酸的羧基和水分子的極化能力較差，不能電離出H+，無法與碳酸氫鈉進行反應(yīng)生成鈉鹽，則留在樹脂柱中。碳酸氫鈉溶液的洗脫速度為1～1.5BV/h，其用量為1～1.5BV時，洗脫效果較好。
采用75～78℃、0.6～0.8mol/L的碳酸氫鈉溶液進行洗脫，此時可以洗脫熊果酸，而齊墩果酸不被洗脫，由于齊墩果酸和山楂酸結(jié)構(gòu)為同分異構(gòu)體，因此，采用較快的洗脫速度2～2.5BV/h，較小的洗脫劑量為0.5～1BV，可最大程度洗脫熊果酸，而齊墩果酸不被洗脫。
本發(fā)明的方法簡單、周期短，提取的熊果酸純度高，收率大。
具體實施方式
以下具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但不作為對本發(fā)明的限定。
實施例1
1)將油橄欖果渣與體積濃度為70％的乙醇溶液按料液比為1g：10ml的比例混合，加熱回流提取3h，將提取液過濾，取濾液減壓回收乙醇，得到粗提物；
2)將粗提物加入體積濃度為50％乙醇溶液至粗提物濃度為0.06g/ml，攪勻，得到混合溶液；
3)將混合溶液上AB-8大孔吸附樹脂柱，樹脂柱徑高比為1:3，先用水洗脫至無色，然后加入40℃、0.1mol/L的碳酸氫鈉溶液進行洗脫，碳酸氫鈉溶液的洗脫速度為1BV/h，其用量為1BV，再用75℃、0.6mol/L的碳酸氫鈉溶液進行洗脫，洗脫速度為2BV/h，其用量為0.5BV，收集第三次洗脫液(即0.6mol/L的碳酸氫鈉洗脫液)，調(diào)節(jié)pH至3，過濾，取濾渣干燥，即得。
根據(jù)高效液相色譜法進行測定，其純度為99.1％，收率為90.5％。
實施例2
1)將油橄欖果渣與體積濃度為90％的乙醇溶液按料液比為1g：20ml的比例混合，加熱回流提取3次，每次提取時間為3h，將提取液過濾，取濾液減壓回收乙醇，得到粗提物；
2)將粗提物加入體積濃度為65％乙醇溶液至粗提物濃度為0.10g/ml，攪勻，得到混合溶液；
3)將混合溶液上AB-8大孔吸附樹脂柱，樹脂柱徑高比為1:6，先用水洗脫至無色，然后加入50℃、0.15mol/L的碳酸氫鈉溶液進行洗脫，碳酸氫鈉溶液的洗脫速度為1.5BV/h，其用量為1.5BV，再用78℃、0.8mol/L的碳酸氫鈉溶液進行洗脫，洗脫速度為2.5BV/h，其用量為1BV，收集第三次洗脫液(即0.8mol/L的碳酸氫鈉洗脫液)，調(diào)節(jié)pH至5，過濾，取濾渣干燥，即得。
根據(jù)高效液相色譜法進行測定，其純度為99.0％，收率為90.6％。
實施例3
1)將油橄欖果渣與體積濃度為90％的乙醇溶液按料液比為1g：20ml的比例混合，加熱回流提取2次，每次提取時間為2h，將提取液過濾，取濾液減壓回收乙醇，得到粗提物；
2)將粗提物加入體積濃度為55％乙醇溶液至粗提物濃度為0.08g/ml，攪勻，得到混合溶液；
3)將混合溶液上AB-8大孔吸附樹脂柱，樹脂柱徑高比為1:4，先用水洗脫至無色，然后加入45℃、0.12mol/L的碳酸氫鈉溶液進行洗脫，碳酸氫鈉溶液的洗脫速度為1.2BV/h，其用量為1.2BV，再用76℃、0.7mol/L的碳酸氫鈉溶液進行洗脫，洗脫速度為2.5BV/h，其用量為0.5BV，收集第三次洗脫液(0.7mol/L的碳酸氫鈉洗脫液)，調(diào)節(jié)pH至4，過濾，取濾渣干燥，即得。
根據(jù)高效液相色譜法進行測定，其純度為99.5％，收率為93.5％。
實施例4
1)將油橄欖果渣與體積濃度為70％的乙醇溶液按料液比為1g：20ml的比例混合，加熱回流提取3次，每次提取時間為1h，將提取液過濾，取濾液減壓回收乙醇，得到粗提物；
2)將粗提物加入體積濃度為65％乙醇溶液至粗提物濃度為0.06g/ml，攪勻，得到混合溶液；
3)將混合溶液上AB-8大孔吸附樹脂柱，樹脂柱徑高比為1:3，先用水洗脫至無色，然后加入50℃、0.1mol/L的碳酸氫鈉溶液進行洗脫，碳酸氫鈉溶液的洗脫速度為1.5BV/h，其用量為1BV，再用75℃、0.8mol/L的碳酸氫鈉溶液進行洗脫，洗脫速度為2BV/h，其用量為1BV，收集第三次洗脫液(即0.8mol/L的碳酸氫鈉洗脫液)，調(diào)節(jié)pH至3～5，過濾，取濾渣干燥，即得。
根據(jù)高效液相色譜法進行測定，其純度為99.0％，收率為91.2％。