本發(fā)明屬于冠突散囊菌培養(yǎng)領(lǐng)域，涉及一種從茯磚茶中分離、純化冠突散囊菌及其液態(tài)培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)今社會(huì)，經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展，而主導(dǎo)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的工業(yè)給人們賴以生存的環(huán)境冠突散囊菌作為一種散囊菌屬的真菌，又稱(chēng)“金花”菌，因其主要在茯茶發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生大量金黃色的閉囊殼而得名。
長(zhǎng)期以來(lái)，茯磚茶生產(chǎn)主要依靠自然發(fā)酵，以最終得到成品，對(duì)生產(chǎn)環(huán)境、產(chǎn)地等有嚴(yán)格的要求，因此茯磚茶的生產(chǎn)受到極大的限制，通過(guò)人工接種冠突散囊菌至茯磚茶及控制發(fā)酵條件可以有效突破傳統(tǒng)茯磚茶生產(chǎn)的限制。
申請(qǐng)?zhí)枮?01010598201.8的發(fā)明專(zhuān)利提供了一種冠突散囊菌的快速分離方法，首先將成品茯磚茶粉碎，然后配成懸浮液后涂布平板，這種方法操作不夠簡(jiǎn)便，且茶渣與冠突散囊菌閉囊殼混合物制得的懸浮液，染雜菌風(fēng)險(xiǎn)較高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種從茯磚茶中分離、純化冠突散囊菌及其液態(tài)培養(yǎng)方法。
本發(fā)明通過(guò)下述方案實(shí)現(xiàn)：
一種從茯磚茶中分離、純化冠突散囊菌及其液態(tài)培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)制備平板固態(tài)培養(yǎng)基；
(2)接種：用接種環(huán)或其它滅過(guò)菌的細(xì)簽挑取茯磚茶中的“金花”生長(zhǎng)茂盛的區(qū)域“金花”接種至步驟(1)中所得到的平板固態(tài)培養(yǎng)基；
(3)將接種后的平板固態(tài)培養(yǎng)基置于溫度為25-30℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
(4)待7-12天后平板固態(tài)培養(yǎng)基表面的冠突散囊菌菌落可辨時(shí)，在無(wú)菌環(huán)境中用接種環(huán)挑取用點(diǎn)接法或劃線法轉(zhuǎn)接至按步驟(1)新做的平板固態(tài)培養(yǎng)基上；
(5)重復(fù)步驟(3)、(4)兩至四次，直到得到冠突散囊菌純菌落，則得到純化后的冠突散囊菌；
(6)將步驟(1)制備的平板固態(tài)培養(yǎng)基加熱至60-80℃將其含有的瓊脂熔化，分裝到試管中，裝量約試管體積的1/3處，滅菌之后將試管斜放待其冷卻制成斜面培養(yǎng)基；
(7)將步驟(5)中所得純化后的冠突散囊菌的菌落轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，在25-30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-7天，每天觀察，生長(zhǎng)出菌落后置于冰箱中4℃保存，備用；
(8)待需要時(shí)將步驟(7)所得菌種置于溫度為25-30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-7天，每天觀察生長(zhǎng)情況，待菌落生長(zhǎng)良好時(shí)接種到平板固態(tài)培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，備用；
(9)配制液態(tài)的察氏培養(yǎng)基，初始pH調(diào)節(jié)至5.8左右，將所述液態(tài)的察氏培養(yǎng)基分裝至錐形瓶并滅菌，滅菌完成后冷卻；
(10)每天觀察步驟(8)平板固態(tài)培養(yǎng)基中菌落生長(zhǎng)情況，待長(zhǎng)勢(shì)良好時(shí)用接種環(huán)挑取接種至步驟(9)所得液態(tài)的察氏培養(yǎng)基中；
(11)將步驟(10)已接種的液態(tài)的察氏培養(yǎng)基置于搖床中振搖培養(yǎng)，溫度為25-32℃，轉(zhuǎn)速100-150r/min；培養(yǎng)10-20天；
(12)繼續(xù)培養(yǎng)至液態(tài)的察氏培養(yǎng)基逐漸變得渾濁，在液態(tài)的察氏培養(yǎng)基變?yōu)辄S色之后，變得渾濁之前，在無(wú)菌環(huán)境中用多層紗布或60-120目濾布過(guò)濾，取濾液轉(zhuǎn)接至步驟(9)所得的新的液態(tài)的察氏培養(yǎng)基中；
(13)將步驟(12)已接種的液態(tài)的察氏培養(yǎng)基系置于搖床中繼續(xù)振搖培養(yǎng)，溫度25-32℃，轉(zhuǎn)速100-150r/min；培養(yǎng)2-5天，有大量細(xì)小白色菌絲團(tuán)生長(zhǎng)出，培養(yǎng)5-10天液態(tài)的察氏培養(yǎng)基開(kāi)始變成黃色，繼續(xù)培養(yǎng)，液態(tài)的察氏培養(yǎng)基顏色變深，向橙色轉(zhuǎn)變，則液態(tài)擴(kuò)大培養(yǎng)成功。
在所述步驟(1)中，所述平板固態(tài)培養(yǎng)基是將察氏培養(yǎng)基滅菌、分裝于培養(yǎng)皿中、平放于水平臺(tái)面、冷卻固化后制得。
在所述步驟(12)中，所述所取的濾液與液態(tài)的察氏培養(yǎng)基的體積比1∶5-20。
本發(fā)明方法的有益效果為：
本發(fā)明是一種從茯磚茶中分離、純化冠突散囊菌及其液態(tài)培養(yǎng)方法在人為干預(yù)下突破冠突散囊菌原本的地域及環(huán)境生長(zhǎng)限制，實(shí)現(xiàn)不分地域、不分環(huán)境的人工大量培養(yǎng)，為將冠突散囊菌接種到其它茶葉或產(chǎn)品上進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)其它類(lèi)型產(chǎn)品提供了技術(shù)支持，也為單純培養(yǎng)冠突散囊菌以獲取其中有益成分提供了方法。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明：
一種從茯磚茶中分離、純化冠突散囊菌及其液態(tài)培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)制備平板固態(tài)培養(yǎng)基；
(2)接種：用接種環(huán)或其它滅過(guò)菌的細(xì)簽挑取茯磚茶中的“金花”生長(zhǎng)茂盛的區(qū)域“金花”接種至步驟(1)中所得到的平板固態(tài)培養(yǎng)基；在實(shí)際使用中可以用75％酒精消毒的牙簽挑取陜西產(chǎn)茯磚茶中生長(zhǎng)茂盛區(qū)域“金花”接種。
(3)將接種后的平板固態(tài)培養(yǎng)基置于溫度為25-30℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
(4)待7-12天后平板固態(tài)培養(yǎng)基表面的冠突散囊菌菌落可辨時(shí)，在無(wú)菌環(huán)境中用接種環(huán)挑取用點(diǎn)接法或劃線法轉(zhuǎn)接至按步驟(1)新做的平板固態(tài)培養(yǎng)基上；
(5)重復(fù)步驟(3)、(4)兩至四次，直到得到冠突散囊菌純菌落，則得到純化后的冠突散囊菌；
(6)將步驟(1)制備的平板固態(tài)培養(yǎng)基加熱至60-80℃將其含有的瓊脂熔化，分裝到試管中，裝量約試管體積的1/3處，滅菌之后將試管斜放待其冷卻制成斜面培養(yǎng)基；
(7)將步驟(5)中所得純化后的冠突散囊菌的菌落轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，在25-30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-7天，每天觀察，生長(zhǎng)出菌落(肉眼可見(jiàn))后置于冰箱中4℃保存，備用；
(8)待需要時(shí)將步驟(7)所得菌種置于溫度為25-30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-7天，每天觀察生長(zhǎng)情況，待菌落生長(zhǎng)良好時(shí)接種到平板固態(tài)培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，備用；
(9)配制液態(tài)的察氏培養(yǎng)基，初始pH調(diào)節(jié)至5.8左右，將所述液態(tài)的察氏培養(yǎng)基分裝至錐形瓶并滅菌，滅菌完成后冷卻；
(10)每天觀察步驟(8)平板固態(tài)培養(yǎng)基中菌落生長(zhǎng)情況，待長(zhǎng)勢(shì)良好時(shí)用接種環(huán)挑取接種至步驟(9)所得液態(tài)的察氏培養(yǎng)基中；
(11)將步驟(10)已接種的液態(tài)的察氏培養(yǎng)基置于搖床中振搖培養(yǎng)，溫度為25-32℃，轉(zhuǎn)速100-150r/min；培養(yǎng)10-20天；
(12)繼續(xù)培養(yǎng)至液態(tài)的察氏培養(yǎng)基逐漸變得渾濁，在液態(tài)的察氏培養(yǎng)基變?yōu)辄S色之后，變得渾濁之前，在無(wú)菌環(huán)境中用多層紗布或60-120目濾布過(guò)濾，取濾液轉(zhuǎn)接至步驟(9)所得的新的液態(tài)的察氏培養(yǎng)基中；
(13)將步驟(12)已接種的液態(tài)的察氏培養(yǎng)基系置于搖床中繼續(xù)振搖培養(yǎng)，溫度25-32℃，轉(zhuǎn)速100-150r/min；培養(yǎng)2-5天，有大量細(xì)小白色菌絲團(tuán)生長(zhǎng)出，培養(yǎng)5-10天液態(tài)的察氏培養(yǎng)基開(kāi)始變成黃色，繼續(xù)培養(yǎng)，液態(tài)的察氏培養(yǎng)基顏色變深，向橙色轉(zhuǎn)變，則液態(tài)擴(kuò)大培養(yǎng)成功。培養(yǎng)2-5天，每天觀察，可發(fā)現(xiàn)有大量細(xì)小白色菌絲團(tuán)生長(zhǎng)出，培養(yǎng)5-10天培養(yǎng)液開(kāi)始變成黃色，再之后，顏色變深，向橙色轉(zhuǎn)變，則液態(tài)擴(kuò)大培養(yǎng)成功。
在所述步驟(1)中，所述平板固態(tài)培養(yǎng)基是將察氏培養(yǎng)基滅菌、分裝于培養(yǎng)皿中、平放于水平臺(tái)面、冷卻固化后制得。
在所述步驟(12)中，所述所取的濾液與液態(tài)的察氏培養(yǎng)基的體積比1∶5-20。
本發(fā)明中的液態(tài)的察氏培養(yǎng)基包括蒸餾水水，將NaNO3、K2HPO3、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4、蔗糖、瓊脂等，其具體的組成和配置方法為現(xiàn)有公知技術(shù)，在此不再贅述。本發(fā)明中的“金花”即為茯磚茶中的冠突散囊菌菌群。
盡管已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做了較為詳細(xì)的闡述和列舉，應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，對(duì)上述實(shí)施例做出修改或者采用等同的替代方案，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。