本發(fā)明屬于兔角膜內(nèi)皮制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種角膜內(nèi)皮分離和擴(kuò)增培養(yǎng)液。

背景技術(shù)：

角膜內(nèi)皮細(xì)胞是位于角膜內(nèi)側(cè)的單層細(xì)胞，可不斷排出角膜基質(zhì)中的水分，對(duì)于維持角膜透明和正常生理功能起著重要作用。然而，角膜內(nèi)皮細(xì)胞缺乏增殖能力，人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量隨著年齡的增長(zhǎng)而不斷減少。當(dāng)經(jīng)過外傷,白內(nèi)障手術(shù)或者急性閉角型青光眼大發(fā)作等創(chuàng)傷或Fuch角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良后，角膜內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生障礙，因?yàn)榻悄?nèi)皮細(xì)胞缺乏增殖能力,當(dāng)內(nèi)皮受損到一定程度時(shí)就會(huì)導(dǎo)致大泡性角膜病變。穿透性角膜移植一直以來都是角膜內(nèi)皮細(xì)胞失代償最主要的治療手段。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在接受全層角膜移植的病人中超過一半的病人是由于角膜內(nèi)皮的原因而進(jìn)行的手術(shù)。角膜移植需要新鮮的角膜供體,但世界范圍內(nèi)面臨著供體緊缺，極大的制約了角膜移植手術(shù)的開展，且這一問題在我國(guó)尤為顯著。

隨著細(xì)胞生物學(xué)和角膜內(nèi)皮細(xì)胞組織培養(yǎng)方面的進(jìn)展,以體外培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞的組織工程移植研究已經(jīng)成為解決這些困境的新的途徑。與人角膜內(nèi)皮不同，兔角膜內(nèi)皮在體外具有一定的增殖能力。因此，兔角膜內(nèi)皮成為理想的種子細(xì)胞，用于驗(yàn)證角膜內(nèi)皮植片支架的生物材料以及相關(guān)藥物檢測(cè)。然而，以往研究證實(shí)兔角膜內(nèi)皮培養(yǎng)液在長(zhǎng)期培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞后，極易發(fā)生使培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，且在其維持角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、抑制衰老凋亡方面未見有明顯成效。因此，探索兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，尋找能促進(jìn)其大量分離、擴(kuò)增、維持正常形態(tài)功能、抑制衰老凋亡的培養(yǎng)體系迫在眉睫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供了一種角膜內(nèi)皮分離和擴(kuò)增培養(yǎng)液，可以大量分離、擴(kuò)增兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞，維持內(nèi)皮細(xì)胞規(guī)則形態(tài)，避免因長(zhǎng)期體外培養(yǎng)而導(dǎo)致的內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及細(xì)胞衰老凋亡。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是：

本發(fā)明的角膜內(nèi)皮細(xì)胞分離和擴(kuò)增培養(yǎng)液為含有胎牛血清，L-谷氨酰胺，慶大霉素，兩性霉素B，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF，Y-27632和A-83-01的低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基。

作為優(yōu)選，其中各組分的濃度如下：胎牛血清5％～10％，L-谷氨酰胺0.35～0.50mg/L,慶大霉素40～60mg/L,兩性霉素B1～1.5mg/L,bFGF 1～4ng/L，Y-27632 8～15μmol/L,A-83-01 0.8～1.2μmol/L。

作為一種實(shí)施例的優(yōu)選，各組分的濃度如下：胎牛血清5％，L-谷氨酰胺0.35mg/L,慶大霉素40mg/L,兩性霉素B1mg/L,bFGF 1ng/L，Y-27632 8μmol/L,A-83-01 0.8μmol/L。

作為另一種實(shí)施例的優(yōu)選，各組分的濃度如下：胎牛血清8％，L-谷氨酰胺0.40mg/L,慶大霉素50mg/L,兩性霉素B1.25mg/L,bFGF 2ng/L，Y-27632 10μmol/L,A-83-01 1.0μmol/L。

作為再一種實(shí)施例的優(yōu)選，各組分的濃度如下：胎牛血清10％，L-谷氨酰胺0.50mg/L,慶大霉素60mg/L,兩性霉素B1.5mg/L,bFGF 4ng/L，Y-27632 15μmol/L,A-83-01 1.2μmol/L。

上述的培養(yǎng)液的制備方法如下：

1)配制低糖DMEM培養(yǎng)基：

取低糖DMEM培養(yǎng)基粉末加入注射用水溶解后，用Hepes調(diào)整PH值至7.2～7.4；過濾滅菌，配制得到低糖DMEM培養(yǎng)基；

2)在步驟1)的低糖DMEM培養(yǎng)基中加入胎牛血清，慶大霉素，兩性霉素B，Y-27632和A-83-01；終濃度分別為5％～10％，40～60mg/L，1～1.5mg/L，8～15μmol/L，0.8～1.2μmol/L；

3)使用前，在步驟2)的培養(yǎng)基中加入L-谷氨酰胺和bFGF，并使L-谷氨酰胺和bFGF的終濃度分別為0.35～0.50mg/L和1～4ng/L。

本發(fā)明的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液用于兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)。利用本發(fā)明的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，可以實(shí)現(xiàn)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的高效分離以及大量擴(kuò)增。此外，本發(fā)明的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液可以使得兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞在經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)后，仍能夠保持角膜內(nèi)皮細(xì)胞的規(guī)則形態(tài)，表達(dá)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，避免因長(zhǎng)期體外培養(yǎng)而導(dǎo)致的內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

附圖說明

圖1：兔角膜內(nèi)皮分離、擴(kuò)增培養(yǎng)液對(duì)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)影響圖。

圖2：兔角膜內(nèi)皮分離、擴(kuò)增培養(yǎng)液對(duì)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響圖。

圖3：兔角膜內(nèi)皮分離、擴(kuò)增培養(yǎng)液對(duì)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物ZO-1表達(dá)的影響圖。

圖4：兔角膜內(nèi)皮分離、擴(kuò)增培養(yǎng)液對(duì)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物Na+/K+ATPase表達(dá)的影響圖。

圖5：兔角膜內(nèi)皮分離、擴(kuò)增培養(yǎng)液對(duì)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin表達(dá)的影響圖。

具體實(shí)施方式

申請(qǐng)人針對(duì)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)中存在的問題，從培養(yǎng)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和活力檢測(cè)角度對(duì)組分和配比進(jìn)行篩選，從而促成了本發(fā)明。

下面通過實(shí)施例來具體說明本發(fā)明的內(nèi)容：

實(shí)施例1

一種兔角膜內(nèi)皮分離、擴(kuò)增培養(yǎng)液，該角膜內(nèi)皮分離、擴(kuò)增培養(yǎng)液為含有胎牛血清，L-谷氨酰胺，慶大霉素，兩性霉素B，bFGF，Y-27632二鹽酸鹽單水合物和A-83-01的低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，其中各組分的濃度如下：胎牛血清5％，L-谷氨酰胺0.35mg/L,慶大霉素40mg/L,兩性霉素B1mg/L,bFGF 1ng/L，Y-27632 8μmol/L,A-83-01 0.8μmol/L。

上述角膜內(nèi)皮分離、擴(kuò)增培養(yǎng)液的制備方法包括：

1)配制低糖DMEM培養(yǎng)基，按照低糖DMEM培養(yǎng)基的說明書，取低糖DMEM培養(yǎng)基粉末9.4g加入注射用水500ml,溶解后用Hepes調(diào)整PH值至7.2～7.4.過濾滅菌，配制得到低糖DMEM培養(yǎng)基。

2)向1)步驟所得低糖DMEM培養(yǎng)基中加入胎牛血清，L-谷氨酰胺，慶大霉素，兩性霉素B，bFGF，Y-27632和A-83-01，使其終濃度分別為5％，40mg/L，1mg/L，8μmol/L，0.8μmol/L。即得所述之角膜內(nèi)皮分離、擴(kuò)增培養(yǎng)液。

實(shí)施例2

本實(shí)施例之中，所述角膜內(nèi)皮分離、擴(kuò)增培養(yǎng)液各組分的濃度如下：胎牛血清8％，L-谷氨酰胺0.40mg/L,慶大霉素50mg/L,兩性霉素B1.25mg/L,bFGF 2ng/L，Y-27632 10μmol/L,A-83-01 1.0μmol/L。其余同實(shí)施例1。

實(shí)施例3

本實(shí)施例之中：所述角膜內(nèi)皮分離、擴(kuò)增培養(yǎng)液各組分的濃度如下：胎牛血清10％，L-谷氨酰胺0.50mg/L,慶大霉素60mg/L,兩性霉素B1.5mg/L,bFGF 4ng/L，Y-27632 15μmol/L,A-83-01 1.2μmol/L。其余同實(shí)施例1。

上述實(shí)施例制備的培養(yǎng)液的應(yīng)用效果描述如下：

步驟一：在無菌條件下，利用角膜內(nèi)皮鑷將兔角膜內(nèi)皮及后彈力層輕輕撕下，利用維納斯剪將角膜內(nèi)皮層剪成4mm×4mm大小的小塊，將上述小塊置于預(yù)先包被IV型膠原的六孔板中，角膜內(nèi)皮面朝下。按照500ul/孔體積，加入本發(fā)明實(shí)施例1制備的角膜內(nèi)皮分離、擴(kuò)增培養(yǎng)液，于5％CO₂，37攝氏度培養(yǎng)，如圖1所示，培養(yǎng)72小時(shí)后，有大量的原代角膜內(nèi)皮細(xì)胞從組織塊中爬出。

步驟二，待原代角膜內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)滿，利用含有EDTA的0.25％胰酶消化，按照1:8的比例進(jìn)行傳代。原代及第4代兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀況見圖1。如圖1所示，經(jīng)本發(fā)明優(yōu)化的角膜內(nèi)皮培養(yǎng)液培養(yǎng)的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞在第4代仍保持規(guī)則六邊形，排列緊密，符合典型的兔角膜內(nèi)皮形態(tài)，而未經(jīng)優(yōu)化的對(duì)照培養(yǎng)液培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞在傳代1次后即表現(xiàn)出明顯的內(nèi)皮-間質(zhì)分化現(xiàn)象。如圖2所示，經(jīng)本發(fā)明優(yōu)化的角膜內(nèi)皮培養(yǎng)液培養(yǎng)的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞在第4代仍然可以保持良好的擴(kuò)增效率，在接種后96小時(shí)后，細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照培養(yǎng)的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量增加了2-2.5倍(*P<0.01)。由此，證明了本發(fā)明的兔角膜內(nèi)皮培養(yǎng)液可以促進(jìn)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞大量增殖。

步驟三，將第4代兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞按照3000/cm²細(xì)胞密度接種在豬的脫細(xì)胞角膜后彈力層上，加入本發(fā)明的角膜內(nèi)皮分離、擴(kuò)增培養(yǎng)液培養(yǎng)7天后，通過免疫熒光方法檢測(cè)角膜內(nèi)皮標(biāo)記(ZO-1，N-cadherin，Na+/K+ATPase)，如圖2-5所示，利用本發(fā)明的角膜內(nèi)皮分離、擴(kuò)增培養(yǎng)液培養(yǎng)的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞可以在脫細(xì)胞角膜后彈力層上生長(zhǎng)，細(xì)胞間形成緊密連接，表達(dá)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物ZO-1，N-cadherin，Na+/K+ATPase，由此，證明了利用本發(fā)明的培養(yǎng)液擴(kuò)增的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞符合典型的角膜內(nèi)皮細(xì)胞特征。

實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的培養(yǎng)液的效果與培養(yǎng)液類似，證明本發(fā)明的培養(yǎng)液能有效的對(duì)兔角膜內(nèi)皮進(jìn)行分離和擴(kuò)增培養(yǎng)。而且，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表面，其它組分和配比的效果明顯差于本發(fā)明制備的培養(yǎng)液。