本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種可增強(qiáng)目的基因表達(dá)的非融合表達(dá)載體及其制備方法。

背景技術(shù)：

谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)通過與目標(biāo)蛋白融合可提高目標(biāo)蛋白的可溶性該手段已經(jīng)非常成熟。然而，在雙基因表達(dá)載體中，通過在多克隆位點(diǎn)1中引入GST而使多克隆位點(diǎn)2的蛋白在大腸桿菌里的可溶性表達(dá)大大提高，這種方法目前未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種可增強(qiáng)目的基因表達(dá)的非融合表達(dá)載體。本發(fā)明提供一種新型高效的實(shí)現(xiàn)蛋白可溶性表達(dá)的原核表達(dá)系統(tǒng)，通過增加GST的表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)與之非融合的胞內(nèi)其它外源基因的可溶性表達(dá)。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述可增強(qiáng)目的基因表達(dá)的非融合表達(dá)載體的制備方法。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，一種可增強(qiáng)目的基因表達(dá)的非融合表達(dá)載體，以pETduet-1質(zhì)粒為骨架載體，插入pETduet-1質(zhì)粒克隆位點(diǎn)1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，目的基因插入pETduet-1質(zhì)?？寺∥稽c(diǎn)2。所述的目的基因?yàn)榇磉_(dá)的基因。在pETduet-1質(zhì)?？寺∥稽c(diǎn)1插入SEQ ID NO.1所示序列對(duì)應(yīng)的基因序列后，可顯著提高克隆位點(diǎn)2的基因表達(dá)水平。

上述的可增強(qiáng)目的基因表達(dá)的非融合表達(dá)載體的制備方法，包括如下步驟：

第一步，將片段GST-CTB克隆到pETduet-1載體中構(gòu)建質(zhì)粒pETduet-GST-CTB(其中，CTB為霍亂毒素B亞單位)；

第二步，將片段EGFP-CTA2-TAT克隆到pET22b載體中構(gòu)建質(zhì)粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT，作為對(duì)照質(zhì)粒；

第三步，將片段EGFP-CTA2-TAT克隆到pETduet-GST-CTB載體中構(gòu)建質(zhì)粒pETDuet-GST-CTB/EGFP-CTA2-TAT；

第四步，將構(gòu)建好的兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析比較。

所述第一步，具體包括如下步驟：

(1)通過質(zhì)粒抽提試劑盒提取獲得質(zhì)粒PGEX-4T3為模板，其中，PGEX-4T3上有GST的基因序列；通過設(shè)計(jì)引物，PCR獲得BamHI-CTB-XhoI片段，將PGEX-INSITE和BamHI-CTB-XhoI同時(shí)經(jīng)過BamHI/XhoI雙酶切，獲得載體片段和PCR片段，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后用T4連接酶連接過夜，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)，挑選陽性克隆子，送上海生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明CTB正確連上載體PGEX，新建了質(zhì)粒PGEX-CTB；

(2)以PGEX-CTB為模板，引物序列如下：

上游引物5’-CATGCCATGGGTATGTCCCCTATACTAGGTTAT-3’，下游引物5’-CCCAAGCTTTTAATTTGCCATACTAATTGCG-3’，PCR得目的片段GST-CTB，產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化；

(3)pETduet-1載體和PCR產(chǎn)物GST-CTB經(jīng)Nco I和Hind III雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，并按載體與片段1：1比例，加入T4連接酶于4℃反應(yīng)過夜，反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，Nco I和Hind III雙酶切鑒定，質(zhì)粒PCR，送上海生工測(cè)序，測(cè)序正確結(jié)果記為pETduet-GST-CTB。

所述第二步構(gòu)建質(zhì)粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT，具體包括如下步驟：

通過NCBI，查找EGFP、CTA2、TAT基因序列，由于EGFP分子較大，為使其更好與CTA2融合，以不至于表達(dá)時(shí)發(fā)生中止，在EGFP與CTA2之間加入連接短肽GGGGS作為linker，修飾，增強(qiáng)表達(dá)穩(wěn)定性；同時(shí)EGFP與CTA2之間還加入酶切位點(diǎn)，以便于替換EGFP為目標(biāo)藥物蛋白；將基因序列串聯(lián)，并送往北京普爾普樂公司合成；合成的基因序列命名為EGFP-CTA2-TAT，并構(gòu)建到pET22b載體上，最后載體標(biāo)記為pET22b-EGFP-CTA2-TAT。

第三步具體步驟為：

(1)依托引物設(shè)計(jì)軟件primer premier 5.0，通過PCR擴(kuò)增，以pET22b-EGFP-CTA2-TAT作為模板，獲得目的片段EGFP-CTA2-TAT；

(2)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過酶切，酶連，克隆到載體pETduet-GST-CTB多克隆位點(diǎn)2上，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，通過氨芐抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化子，通過酶切，測(cè)序鑒定是否符合預(yù)期，新構(gòu)建載體記為pETduet-GST-CTB/EGFP-CTA2-TAT。

所述第四步，具體包括如下步驟：

a)將質(zhì)粒pETDuet-GST-CTB/EGF-CTA2-TAT轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)中，通過抗氨芐青霉素抗性LB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，甘油保存；

b)1：100菌液比例加入含100ug/mL的400mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2h；

c)加1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；

d)SDS-PAGE和western blot分析蛋白表達(dá)情況。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

本發(fā)明的GST通過與蛋白CTB融合形成GST-CTB，并克隆入雙基因表達(dá)載體petduet-1載體的多克隆位點(diǎn)1中，形成pETduet-GST-CTB。研究發(fā)現(xiàn)CTB與GST連接而引入的GST可以誘導(dǎo)大大增加多克隆位點(diǎn)2的蛋白的可溶性表達(dá)。本發(fā)明構(gòu)建了重組質(zhì)粒pETduet-GST-CTB/EGFP-CTA2-TAT和pET22b-EGFP-CTA2-TAT，再將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)，誘導(dǎo)目的蛋白EGFP-CTA2-TAT表達(dá)，經(jīng)過SDS PAGE，和western blot分析比較，發(fā)現(xiàn)含pETduet-GST-CTB/EGFP-CTA2-TAT的菌上清表達(dá)目的蛋白EGFP-CTA2-TAT比含pET22b-EGFP-CTA2-TAT表達(dá)的高20倍。

附圖說明

圖1是pETduet-GST-CTB/EGFP-CTA2-TAT載體質(zhì)粒圖。

圖2是誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳圖。其中1是未誘導(dǎo)菌體，2是BL21(pET22b-EGFP-CTA2-TAT)菌誘導(dǎo)6小時(shí)后，3是BL21(pETduet-EGFP-CTA2-TAT)菌誘導(dǎo)6小時(shí)后。

圖3是Western Blot分析BL21(DE3)-)pETduet-GST-CTB/EGFP-CTA2-TAT表達(dá)；其中：a，EGFP抗體作用誘導(dǎo)表達(dá)蛋白；b，EGFP抗體作用誘導(dǎo)表達(dá)蛋白；c，CTB抗體作用誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1含GST的非融合重組質(zhì)粒pETDuet-GST-CTB/EGF-CTA2-TAT制備的具體步驟如下：

(1)通過質(zhì)粒抽提試劑盒提取獲得質(zhì)粒PGEX-4T3為模板，其中，PGEX-4T3上有GST的基因序列。通過設(shè)計(jì)引物，PCR獲得BamHI-CTB-XhoI片段，將PGEX-INSITE和BamHI-CTB-XhoI同時(shí)經(jīng)過BamHI/XhoI雙酶切，獲得載體片段和PCR片段，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后用T4連接酶連接過夜，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)，挑選陽性克隆子，送上海生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明CTB正確連上載體PGEX，新建了質(zhì)粒PGEX-CTB。

(2)以PGEX-CTB為模板，引物序列如下：

5’-CATGCCATGGGTATGTCCCCTATACTAGGTTAT-3’(上游引物)

5’-CCCAAGCTTTTAATTTGCCATACTAATTGCG-3’(下游引物)PCR得目的片段GST-CTB。產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化。

(3)pETduet-1載體和PCR產(chǎn)物GST-CTB經(jīng)Nco I和Hind III雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，并按載體與片段1：1比例，加入T4連接酶于4℃反應(yīng)過夜，反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，Nco I和Hind III雙酶切鑒定，質(zhì)粒PCR，送上海生工測(cè)序，測(cè)序正確結(jié)果記為pETduet-GST-CTB。

(4)通過NCBI，查找EGFP、CTA2、TAT基因序列，由于EGFP分子較大，為使其更好與CTA2融合，以不至于表達(dá)時(shí)發(fā)生中止，在EGFP與CTA2之間加入連接短肽GGGGS作為linker，修飾，增強(qiáng)表達(dá)穩(wěn)定性。同時(shí)EGFP與CTA2之間還加入酶切位點(diǎn)，以便于替換EGFP為目標(biāo)藥物蛋白。將基因序列串聯(lián)，并送往北京普爾普樂公司合成。合成的基因序列命名為EGFP-CTA2-TAT，并委托北京普爾普樂公司構(gòu)建到pET22b載體上，最后載體標(biāo)記為pET22b-EGFP-CTA2-TAT。

(5)依托引物設(shè)計(jì)軟件primer premier 5.0，通過PCR擴(kuò)增，以pET22b-EGFP-CTA2-TAT作為模板，獲得目的片段EGFP-CTA2-TAT。

(6)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過酶切，酶連，克隆到載體pETduet-GST-CTB多克隆位點(diǎn)2上，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，通過氨芐抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化子，通過酶切，測(cè)序鑒定是否符合預(yù)期，新構(gòu)建載體記為pETduet-GST-CTB/EGFP-CTA2-TAT(質(zhì)粒構(gòu)建圖如圖1所示)。

其中EGFP的測(cè)序的核苷酸序列結(jié)果如下所示：

AACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGAATCTGGTTCCGCGTGGATCCACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACAACACACAAATATATACGCTAAATGATAAGATATTTTCGTATACAGAATCTCTAGCTGGAAAAAGAGAGATGGCTATCATTACTTTTAAGAATGGTGCAATTTTTCAAGTAGAAGTACCAGGTAGTCAACATATAGATTCACAAAAAAAAGCGATTGAAAGGATGAAGGATACCCTGAGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCGAAAAATTATGTGTATGGAATAATAAAACGCCTCATGCGATTGCCGCAATTAGTATGGCAAATTAAAAGCTTGCGGCCGCATAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATAATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGCTAGCGAATTCGAGCTCGGAGGTGGTGGATCCATGAGCAATACGTGCGATGAGAAGACACAAAGCCTGGGCGTGAAATTCTTAGACGAATATCAAAGCAAAGTGAAACGCCAAATCTTCAGCGGATACCAAAGCGATATTGACACGCACAATCGCATCAAGGATGAGTTAGTCGACGGTCGTAAGAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTCCACCACAGCTCGAGTCTGGTAAAGAAACCGCTGCTGCGAAATTTGAACGCCAGCACATGGACTCGTCTACTAGCGCAGCTTAATACCTAGTTGCC。

實(shí)施例2比較分析EGFP-CTA2-TAT蛋白表達(dá)情況：

將質(zhì)粒pETduet-GST-CTB/EGFP-CTA2-TAT和pET22b-EGFP-CTA2-TAT分別轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中，并通過抗氨芐青霉素抗性LB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，保存為甘油菌。繼而將菌液按1：100比例加入含100μg/mL的400mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2h后，加入1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6h，SDS PAGE和Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況(如圖2和3所示)。

經(jīng)過SDS PAGE和western blot分析比較發(fā)現(xiàn)本發(fā)明非融合表達(dá)的EGFP-CTA2-TAT比正常表達(dá)的高20倍。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。