本發(fā)明涉及分子生物學(xué)DNA標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及黃連木微衛(wèi)星位點(diǎn)及引物和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黃連木(Pistacia chinensis Bunge)，隸屬于漆樹科(Anacardiaceae)黃連木屬，雌雄異株，落葉喬木。黃連木性喜陽，族生，對干旱貧瘠具有一定的耐受性，易于栽培，在中國的分布較為廣泛，在西北、華北、華東、中南、華南等地的23個省市區(qū)均有記載。黃連木不僅具有較高的觀賞價值，而且具有較高的經(jīng)濟(jì)開發(fā)價值，其木材堅(jiān)韌耐腐，屬于上等的建筑、家具材料；其葉子、種子、樹皮等均可入藥；種子含油量高達(dá)35.05％，黃連木籽油不僅可以作為食用油，而且可以作為脂肪酸、潤滑油和肥皂等產(chǎn)品的原料，更為重要的是作為一種生物柴油的重要來源之一，已受到越來越多的關(guān)注和研究。由于黃連木是可再生的綠色能源生物柴油的重要來源，并且具有很高的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價值，有關(guān)黃連木的研究也越來越受到重視，但對于黃連木的研究主要集中在生理、分布、能源開發(fā)等方面，有關(guān)分子生物水平，種質(zhì)資源分析、群體遺傳結(jié)構(gòu)等方面的研究非常少。

微衛(wèi)星(Microsatellite)，又稱簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat,SSR)，通常是由1-6個核苷酸為重復(fù)單位的核心序列和相對保守的側(cè)翼序列組成。隨著分子標(biāo)記的發(fā)展，微衛(wèi)星標(biāo)記作為一種遺傳穩(wěn)定性好、信息量豐富、通用性強(qiáng)、共顯性遺傳等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于種群遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳關(guān)系、遺傳育種、圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定等研究中。微衛(wèi)星引物的獲得途徑大致可以分為從已發(fā)表的近緣種中篩選；從公共數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的同種近緣種的序列中查找微衛(wèi)星位點(diǎn)；從基因組DNA中通過構(gòu)建文庫的方法篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)。三種方法中通過構(gòu)建文庫的篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)的方法效率最高。本專利利用基于AFLP(擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，Amplified Fragment Length Polymorphism)的FIASCO(生物素-磁珠富集法，F(xiàn)ast Isolation by AFLP Sequences containing repeats)方法構(gòu)建黃連木微衛(wèi)星富集文庫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種黃連木微衛(wèi)星位點(diǎn)及多態(tài)性引物，即提供12個黃連木微衛(wèi)星位點(diǎn)，以及相應(yīng)的多態(tài)性微衛(wèi)星引物，為黃連木物種有效性的鑒定、種群遺傳多樣性分析提供分子標(biāo)記。

本發(fā)明通過磁珠雜交法從黃連木基因組DNA中篩選出6個微衛(wèi)星序列，在GenBank登錄號為KT780354-365，分別如SEQ ID NO：1～12。

微衛(wèi)星序列還包括在嚴(yán)格條件下與上述的核苷酸序列雜交的，包含相同微衛(wèi)星重復(fù)單位的核苷酸序列分子。

本發(fā)明的黃連木微衛(wèi)星引物是從序列PC1、PC19、PC44、PC64、PC70、PC96、PC106、PC172、PC189、PC193、PC196、PC205的微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列上設(shè)計(jì)的正向、反向引物。

微衛(wèi)星引物序列分別為SEQ ID NO：PC1F/R、PC19F/R、PC44F/R、PC64F/R、PC70F/R、PC96F/R、PC106F/R、PC172F/R、PC189F/R、PC193F/R、PC196F/R、PC205F/R。

微衛(wèi)星位點(diǎn)，位點(diǎn)序列和對應(yīng)的引物信息如表1：

表1黃連木微衛(wèi)星引物開發(fā)得到的12對引物的基本特征

本發(fā)明的微衛(wèi)星多態(tài)性引物用于黃連木種群遺傳多樣性檢測，包括如下步驟：

1)基因組DNA的提取：采用天根生化科技(北京)有限公司植物葉片DNA提取試劑盒操作基礎(chǔ)上針對黃連木自身特征做稍微調(diào)整進(jìn)行黃連木基因組DNA的提?。?/p>

2)微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增：采用設(shè)計(jì)的引物，黃連木基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，獲得黃連木個體微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物；

3)電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物：采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染法檢測微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物,并且擴(kuò)增結(jié)果利用ABI 3730XL測序儀進(jìn)行測序；

4)遺傳多樣性分析:根據(jù)每個個體微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小確定基因型，序結(jié)果經(jīng)Genmapper4.0判讀后利用POPGENE Version 1.32軟件進(jìn)行群體遺傳分析，計(jì)算微衛(wèi)星等位基因數(shù)(Na)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、是否偏離Hardy-Weinberg平衡(P)。利用PIC軟件(PIC_CALC 0.6版本)計(jì)算多態(tài)信息含量。

本發(fā)明從黃連木基因組DNA中篩選出12個微衛(wèi)星位點(diǎn)，并根據(jù)這些位點(diǎn)在微衛(wèi)星位點(diǎn)兩端的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)特異性引物，使用所獲引物的擴(kuò)增結(jié)果具有高的多態(tài)性和穩(wěn)定性，可用于黃連木的種群遺傳多樣性檢測，物種有效性鑒定以及分子輔助育種等領(lǐng)域。

附圖說明

圖1是黃連木基因組瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖；

圖2是黃連木基因組酶切結(jié)果；

圖3是黃連木磁珠富集產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果；

圖4是黃連木部分陽性克隆PCR檢測電泳圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的分析。

一、黃連木基因組DNA提取

本發(fā)明在天根生化科技(北京)有限公司植物葉片DNA提取試劑盒操作基礎(chǔ)上針對黃連木自身特征做稍微調(diào)整進(jìn)行黃連木基因組的提取。

(1)稱取約30mg黃連木硅膠干燥去除葉柄和葉脈的葉片，置于2ml離心管，在液氮中浸泡1min，置于研磨儀中充分研磨。

(2)在上述離心管中加入700μl預(yù)熱的GP1和2μlβ-巰基乙醇，漩渦震蕩混勻，65℃水浴50min，水浴過程中顛倒離心管數(shù)次以混勻樣品。

(3)加入700μl氯仿，充分混勻，12,000rpm離心5min。

(4)將上層轉(zhuǎn)入新離心管中，加700μl GP2，漩渦震蕩混勻。

(5)將上述液體轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，12,000rpm，離心30s，棄廢液。

(6)將CB3重新放入收集管中，加入500μl GD緩沖液，12,000rpm，離心30s，棄廢液。

(7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液，12,000rpm離心30s，棄廢液。重復(fù)兩次，置于室溫15min。

(8)將CB3轉(zhuǎn)入一個無菌的離心管中，懸空滴加100μl超純水在吸附膜的中間部位，室溫放置5min，使DNA充分溶解，12,000rpm離心2min。離心得到的溶液重新懸浮加入CB3的吸附柱中，放置10min，5,000rpm離心1min得到DNA儲存液。

(9)首先利用濃度為1.5％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢查所得基因組質(zhì)量，選擇條帶清晰的樣本，如圖1所示，利用微量紫外分光光度計(jì)檢測其質(zhì)量和濃度。

二、基因組DNA酶切與磁珠富集微衛(wèi)星文庫

1、基因組DNA酶切、接頭連接及產(chǎn)物預(yù)擴(kuò)增

(1)基因組酶切。利用限制性內(nèi)切酶MseI進(jìn)行酶切，酶切體系為25μl：含基因組DNA 250ng，內(nèi)切酶5U，Cutsmart 2.5μl，ddH₂O補(bǔ)齊體系；37℃水浴1h，65℃水浴中20min。酶切結(jié)果利用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，分離并回收大小在100-800bp之間的條帶，如圖2所示。

(2)酶切產(chǎn)物連接。連接反應(yīng)中總體系包含30μl，含酶切產(chǎn)物15μl：T4DNA連接酶4.0U，MseI接頭30pmol(接頭序列F:5′-TACTCAGGACTCAT-3′，如SEQ ID NO：37,R:5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′，如SEQ ID NO：38)，ddH₂O補(bǔ)齊體系，16℃連接12h。

(3)預(yù)擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為20μl：含10×Buffer 2μl，dNTPs(2.5mM)5μl,Taq DNA聚合酶0.5U，酶切連接產(chǎn)物產(chǎn)物5μl，MseI-N引物(5′-GATGAGTCCTGAGTAAN-3′)20pmol。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，53℃退火60s，72℃延伸60s，20個循環(huán)，72℃延伸8min，4℃保存。

2、生物素探針與預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物雜交及磁珠富集

(1)以生物素作為標(biāo)記的(AG)₁₅為探針和預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，雜交反應(yīng)體系為250μl，其中PCR產(chǎn)物30μl，探針300pmol，20×SSC52.5μl，10％SDS 1.75μl，ddH₂O補(bǔ)齊，輕輕地混勻后95℃變性5分鐘，然后置于48℃水浴雜交2h。將磁珠處理好后與上述雜交產(chǎn)物進(jìn)行混合，室溫50min，期間不斷輕柔搖晃，然后將上述反應(yīng)產(chǎn)物置于磁力架上進(jìn)行吸附，用移液槍輕輕將液體吸出。

(2)非嚴(yán)格洗滌。用TEN1000 500μl洗滌3次，8min/次。處理結(jié)束后將反應(yīng)產(chǎn)物置于磁力架上進(jìn)行吸附，用移液槍輕輕將液體吸出。

(3)嚴(yán)格洗滌。用0.2×SSC+0.1％SDS混合液500μl，清洗3次。

(4)洗脫。加入50μl 1×TE，95℃水浴5min，反應(yīng)產(chǎn)物置于磁力架上進(jìn)行吸附，用移液槍輕輕將液體吸出，迅速置于另一無菌的1.5ml離心管中。

(5)富集產(chǎn)物擴(kuò)增與純化。將富集產(chǎn)物以MseI-N引物(5′-GATGAGTCCTGAGTAAN-3′)進(jìn)行擴(kuò)增，總反應(yīng)體系為20μl，含有10×Buffer 2μl，dNTPs(2.5mM)2μl，引物20pmol，Taq DNA聚合酶0.5U，模板5μl，ddH₂O補(bǔ)齊體系。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，53℃退火60s，72℃延伸60s，20個循環(huán)，72℃延伸8min，4℃保存。

(6)利用1.5％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，如果產(chǎn)物呈現(xiàn)均勻彌散條帶，并且大小在200-800bp之間，則說明上述富集洗脫過程比較成功，如圖3所示。然后利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收目標(biāo)產(chǎn)物。

2、富集產(chǎn)物克隆與陽性克隆檢測

(1)載體連接。將上述純化后的產(chǎn)物連接到pMD19-T載體中，連接反應(yīng)體系為上一步中純化后DNA 4.5μl，T載體0.5μl，連接液5μl，總體系為10μl。反應(yīng)程序?yàn)?6℃，連接2h，PCR儀不使用熱蓋。

(2)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。將連接好的產(chǎn)物加入至100μl感受態(tài)細(xì)胞，冰中放置30min后迅速轉(zhuǎn)入42℃水浴鍋中45秒鐘后，再在冰中放置1min。加入890μl SOC培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60min。

(3)陽性克隆培養(yǎng)。將連接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含100mg/L的Amp的LB固體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，挑取飽滿透亮的陽性克隆，在含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，250r/min，37℃培養(yǎng)至菌液輕度渾濁。

(4)利用限制性內(nèi)切酶MseI測序通用引物M13(M13-47：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’；

M13-48：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’)與無生物素標(biāo)記的上述探針(AG)15組成的三引物組合對富集文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物組合分別為組合a：M13-47+(AG)15；組合b：M13-48+(AG)15；組合c：M13-47+M13-48，篩選陽性克隆)。PCR體系為15μl，其中含有10×Buffer 1.5μl，dNTPs(2.5mM)2μl，上下游引物各30pmol，Taq DNA聚合酶0.25U，菌液2μl，ddH2O補(bǔ)齊，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)，72℃延伸8min，4℃保存。擴(kuò)增結(jié)果利用1.5％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，如圖4所示。將陽性克隆菌液送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測序。

三、微衛(wèi)星引物

陽性克隆測序結(jié)果利用DNA star 8.0去掉載體序列，利用SSR Hunter 1.3查找核心序列，選擇微衛(wèi)星側(cè)翼序列較長和重復(fù)單元重復(fù)次數(shù)較多的序列，利用Primer premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)引物時遵循的原則主要有引物長度18-22bp；GC含量40-60％；Tm值45-65℃，以55℃為最佳；正反引物GC含量差值在10％內(nèi)，Tm值差在5℃內(nèi)；產(chǎn)物長度200-400bp；設(shè)計(jì)好的引物由上海生工生物有限公司進(jìn)行合成。

四、微衛(wèi)星引物有效性和通用性的檢測

1、引物的有效性檢測

分別用4株黃連木個體對合成的引物進(jìn)行初步篩選，通過梯度篩選優(yōu)化每一條引物的退火溫度，對于能夠穩(wěn)定擴(kuò)增出目的條帶的引物進(jìn)行下一步的多態(tài)性檢測。對于初步篩選得到的引物用24個千島湖黃連木個體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系為15μl，其中含有10×Buffer 1.5μl，dNTPs(2.5mM)1.5μl，上下游引物各50pmol，Taq DNA聚合酶0.25U，模板1.5μl，ddH2O補(bǔ)齊，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，Tm(51-59℃)退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)，72℃延伸8min，4℃保存。

擴(kuò)增結(jié)果利用8％(W/V)非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE)和硝酸銀染色經(jīng)拍照后檢測其多態(tài)性，選出具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物。電泳檢測步驟如下：

(1)裝槽：裝槽之前利用100％無水乙醇擦拭兩片玻璃板的內(nèi)側(cè)，裝上膠條密封用的膠條，然后固定在電泳槽中，并用夾子將兩端夾緊。

(2)封膠：使用濃度為2％瓊脂將電泳槽邊緣進(jìn)行密封，以防漏膠。

(3)制膠：8％PAGE膠配方(總共100ml：去離子水51.25ml；40％Acrylamide溶液20ml；10×TBE溶液20ml；20％過硫酸銨1ml；TEMED 100μl)。

(4)灌膠：攪拌均勻后將灌入裝好的膠槽中，輕輕垂直將梳子插入，室溫靜置2小時。

(5)上樣：依次向加樣孔中加入10μl的混有載樣緩沖液的PCR產(chǎn)物，選用500bp DNA Marker，200V，穩(wěn)壓進(jìn)行電泳至指示劑到達(dá)膠板底部，停止電泳。

(6)銀染顯色并拍照記錄

①分離膠板：使用流動水沖洗膠板便于分離，在膠板右側(cè)打孔做標(biāo)記。隨后步驟搖床上操作，使得效果更加充分。

②漂洗：500ml蒸餾水浸泡膠板，5min，去除表面殘留的緩沖液中的離子。

③染色：將膠板置于1％AgNO3的染色液中膠浸泡至少5min，時間可以適當(dāng)延長，使效果更好。

④洗滌：將上述膠板浸泡在500ml蒸餾水中，5min，去除表面殘留的陰離子。

⑤顯色：配置500ml，1％顯影液與2ml甲醛溶液混合溶液，混勻后后迅速將膠板置于其中，密切觀察，有條帶隱現(xiàn)的時刻將膠板取出，置于500ml蒸餾水中停止染色。然后拍照記錄結(jié)果。

2、引物的通用性檢測

對于篩選出的具有有效多態(tài)性的引物經(jīng)6′-FAM，HEX，TAMRA，ROX進(jìn)行標(biāo)記后利用千島湖一個大陸種群和兩個島嶼種群中各8個個體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件與PAGE膠篩選體系和程序除退火溫度升高2℃外相同，擴(kuò)增結(jié)果利用ABI 3730XL測序儀進(jìn)行測序。測序結(jié)果經(jīng)Genmapper 4.0判讀后利用POPGENE 1.32軟件進(jìn)行遺傳分析，計(jì)算相關(guān)指標(biāo)：微衛(wèi)星等位基因數(shù)(Na)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、是否偏離Hardy-Weinberg平衡。利用PIC軟件(PIC_CALC 0.6版本)計(jì)算多態(tài)信息含量。

如表2所示，篩選得到的12對引物在24個個體中共檢測等位基因總數(shù)為125；單個個體的等位基因數(shù)的變化范圍為2-8，平均值位3.5；三個種群的多態(tài)信息含量(PIC)分別為在0.5449(0.3589–0.7993)、0.4931(0.3047–0.7654)、0.5442(0.1948–0.8157)；觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)范圍在0.1250-0.8750和0.2333-0.8917，12個位點(diǎn)中除中島種群和大陸種群的PC193位點(diǎn)和大陸種群中的PC205位點(diǎn)之外，其他位點(diǎn)等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg平衡。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州師范大學(xué)錢江學(xué)院

<120> 黃連木微衛(wèi)星位點(diǎn)及引物和應(yīng)用

<130> 1

<160> 38

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 314

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atattggaga aggaagggac gttgcataat atgagagtta cattcaaata cctgaagact 60

tgaaaatcga tcaacatacc aatgacgaag aaacaataat gaatgttgtt tttctgattt 120

atctgctcaa ataaataata ttgactatat gagagagaga gagagcaata ttgacaccca 180

aaaatgagac aatatataga ttgaatgact atatcacctt gaggctgcca atagatggaa 240

agacgtattt cagctagata gcacttgcaa agcagcaggt atctcaaacg atgatgacat 300

tctttatccg acca 314

<210> 2

<211> 317

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aaaagaaaaa cggagaagaa gaaggaaaac agcaaacaat gagagaggaa aaagagagaa 60

gaaaaaggag agaaataaaa gagagaaaga agaagaagag aaggaaagga ataaataaag 120

taagaatgga gagaaagatg aaaccaagat agagagagag agagagagag agagagagag 180

agagagagag gagagaagaa aaaagggtgg cagagatggc tggaaaagtg gccgccggtg 240

ggcaaaactc cggtgatcgg agagttgagg aagatcaagc atatgggagg tgagtaaagc 300

ttactcagga ctcatca 317

<210> 3

<211> 322

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atattggaga aggaagggac gttgcataat atgagagtta cattcaaata cctgaagact 60

tgaaaatcga tcaacatacc agtgacgaag aaacaataat gaatgttgtt tttccgattt 120

atctgctcaa ataaataata ttgactatat gagagagaga gagagagaga gagcaatatt 180

gacacccaaa aatgagacaa tacatagatt gaatgaccat atcaccttga ggctgccaat 240

agatggaaag acgtatttca gcttagatag cacttgcaaa gcaacaggta tctcaaacga 300

tgatgacatt ctctatccga cc 322

<210> 4

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gtcagtggag aaatgtttga tggacatgtt tggaaggcga gaaagtgaga aggaaaataa 60

attgggagaa atagggagag gactggaggg ctcaaaggat aattattatg gatttgattt 120

gatgaagcaa agagaagaga tatgacaaac agagagagag agagagagag agagagagag 180

agaaggagga gaactgtgag taagcacaag gtaacgagag taccttactc aggactcatc 240

<210> 5

<211> 279

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gagtcctgag taagtgcaac caaaaataaa aatcaaataa ctctaatatt ctaaacccta 60

gctgtccact atctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 120

ctctctctcc cccaagccgt ggtcacccat tgttgtggat ctaggagaat ctttgaatct 180

tgcggtttca gctagcactt cgaattgtta ggtgatcgtc atcctgtctt tgtgtgggta 240

ctgagagttc actctcgtct tagagtggga gtgattcgc 279

<210> 6

<211> 246

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

aacttctttg gactatagct ctcaagccac tactcgaatt tagatcaatg agagtgagag 60

aaggttggag aagagagagg cttttgaaac ccacttgggc gaaggatcca atgcaacata 120

tatacacata catacacacc gtctctctcc ctctctctct ctctctctct tttctttctc 180

actttatcac agtaagtgag aaagtgaggt ctctttcgct aaatctccct tactcaggac 240

tcatca 246

<210> 7

<211> 326

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gcgggcgggc gatcatatga aagagcagtg atagataaaa atacaaacag aaacgctaat 60

atgaaatgaa gaggctgtag ttgaagcaac atggtgggcg tcacgggtgg cagatcaaga 120

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attcttgtgg ggatttttat atatattctc tttagtcctt gtggtttctg tttatcattt 300

ttagtctagc agtttcaaat attata 326

<210> 8

<211> 227

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tttagattgc atccgtacac tcacgtggat ggctcgcttt gaccactcaa actcttccca 60

ttcacttgtc cggccatcat agtgaaacaa cagaatagta aaattttctg agaactgtcc 120

aaaaaagaaa tttgatgaaa aagagaacac gagagagaga gagagagaga gagagagaga 180

gagagagaga gagcgagcaa actaaccttt ttactcagga ctcatca 227

<210> 9

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gatgagtcct gagtaagcaa atgaaaaata agttttagtt ctggaaatat tcaacatttt 60

ctctctctct ctctctttct tttctgaaat ttctatttgg ttcttgagaa agtttcgcaa 120

ttttcaaatc ttttcttttt cttgatccta ggactctatt acatcttcac gccctctaaa 180

gaagccacta tccatcacaa tcccctcaag acattcgtgc aacca 225

<210> 10

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gatgagtcct gagtaaggat gtttgtgtgg agggaaacac gtgaagaact tcattttcaa 60

tcatcaaagt tgatttcact tgcagaggag agagagagag agagagagag agagagagat 120

tgaagtgaga tttgattgca tatatgcagt ataaagcagt aattggaaga tgtgtgggaa 180

gatttgatgg catttggtaa aaccttatga tgataataac tttactcagg actcatcaa 239

<210> 11

<211> 295

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

aaggaaggat ctgcacggta tccatctccc tttctacgga ttcagtaatg attactccaa 60

tgaatcccat tataaataga gagcctctct cccgtttgtg ggattcgctc attctactct 120

ttattagctc aactcactct gtaataacta ctctctctct ctctctcaca tttgtaatct 180

caacactata aagcagctcg ctaaccgtga cctgatccca caaaatatga ataatatatc 240

agtggacgta ggattcgctt ttgagcatcc gaaccacctt actcaggact catca 295

<210> 12

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

aaaagtatct gttatgttgg gaacaaccat ttgtaatggt agaacacctg tccctctgaa 60

aactgtagct tttgaagggt gcatttgtga caatggcttt ttacttcaaa agatagagaa 120

caacaataaa tagagtgatt tattgcacaa agagagagag agagagagag agagagagaa 180

tatcaaagaa acaaaagtct tataaaaaat attctcacat aatcccttga gctaaaaaaa 240

tccaaatcat taccactttc ttgtactcat attggaaact tttgaatgtg ttgtttttat 300

tgtgtgttta ctcaggactc atca 324

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

tattggagaa ggaagggacg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

tcgtttgaga tacctgctgc 20

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

aggaaaacag caaacaat 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

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gctttactca cctcccat 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

attggagaag gaagggac 18

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<212> DNA

<213> 人工合成

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gagaatgtca tcatcgtttg 20

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aaatagggag aggactggag 20

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<212> DNA

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<212> DNA

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cgaatcactc ccactctaag 20

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<400> 38

gacgatgagt cctgag 16