本發(fā)明涉及化合物萃取及分離純化領域，具體而言，涉及一種三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球，固相萃取柱及其應用。
背景技術：
三唑類農(nóng)藥自20世紀70年代出現(xiàn)以來在防治病蟲害方面已經(jīng)顯示出巨大的潛力。三唑類農(nóng)藥以殺菌劑為主，普遍具有高效、低毒、低殘留、持效期長、內(nèi)吸性強等特點。此外三唑類作為植物生長調(diào)節(jié)劑在國內(nèi)外有廣泛的應用，特別是多效唑的應用。
三唑類農(nóng)藥在土壤中的殘留時間一般較長，其代謝主要依靠光解和微生物降解。雖然三唑類農(nóng)藥低毒、低殘留，對人畜較為安全，但如果在農(nóng)產(chǎn)品中濫用和過量施用，不僅會使病蟲害抗藥性日趨嚴重，同時會產(chǎn)生其在農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境中的高殘留問題，威脅食品安全和人類生命健康。
目前三唑類農(nóng)藥殘留的主要檢測方法是液相色譜及其聯(lián)用技術。但由于其殘留濃度低，前處理繁瑣和基體干擾大，嚴重限制了常規(guī)快速檢測方法和儀器分析方法對樣品中該類農(nóng)藥殘留的有效檢測。另外，傳統(tǒng)的QuEChERS等前處理方法的選擇能力較差，在富集分析物的同時，大量基體和干擾物質(zhì)也被富集，導致洗脫液中仍含有基體和雜質(zhì)，干擾最后的色譜分析。因此，探索一種集樣品前處理技術和高靈敏度的快速檢測為一體的新方法，對于提高農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測靈敏度和準確性十分必要。
分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)是一種人工理性設計制備的特定分子識別材料，它的高效識別性對復雜樣品基質(zhì)中的目標分子有很好的選擇富集作用。除了預定性、識別性和實用性三大特點外，還具有制備簡單、成本低、模板分子可回收重復利用等特點，因此非常適合作為選擇吸附劑。同時與生物抗體相比，表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性，具有抗惡劣環(huán)境的能力。因此其在手性分離、固相萃取、化學與生物傳感器、模擬酶催化、膜分離等領域得到了廣泛的應用。分子印跡聚合物的制備常采用沉淀聚合法，和本體聚合相比，減少研磨步驟操作簡便，同時聚合物形狀更加規(guī)則，呈現(xiàn)均勻球狀。
關于三唑類化合物的分子印跡聚合物及其MISPE方法的文獻報道尚不多見，如彭暢(2009)等采用鄰硝基苯酚為替代模板，4-乙烯基吡啶為功能單體，合成了對7種三唑類化合物具有特異性吸附的印跡聚合物，并應用于土壤樣品的分析中；胡艷云(2014)等以三唑酮為模板分子，三氟甲基丙烯酸為功能單體，合成了對20種三唑類農(nóng)藥具有高選擇性的MIP材料，建立了對蓮藕、梨、胡蘿卜樣品中20種三唑類農(nóng)藥分子印跡固相萃取技術。
這些方法均采用傳統(tǒng)的本體聚合方法，需要研磨過篩，其聚合物存在著吸附均一性差，類特異性識別能力弱等缺點，同時由于功能單體的差異，上述合成的聚合物因親水性能差不能萃取水含量多的蔬果基質(zhì)，也不適用于三唑類農(nóng)藥中使用最廣的多效唑和烯效唑等藥物的富集與萃取。
有鑒于此，特提出本發(fā)明。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球，所述的分子印跡聚合物微球可以實現(xiàn)對三唑類農(nóng)藥進行的專一性識別、分離、富集和純化；利用該三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球作為填料可制成固相萃取柱，本發(fā)明還提供了所述的固相萃取柱在檢測三唑類農(nóng)藥中的應用。
本發(fā)明還提供了一種所述三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球的制備方法，此方法制備的MIP對印跡分子有良好的選擇性和識別特性，操作條件簡單，便于普及。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術方案：
一種三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球，所述分子印跡聚合物微球以三唑酮為模板分子、甲基丙烯酸為功能單體、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈為引發(fā)劑在惰性溶劑中反應后脫除模板分子而得到。
可選的，所述惰性溶劑為乙腈。
本發(fā)明通過選擇三唑酮為模板分子，合成了具有高度“類”特異性、選擇性的分子印跡聚合物微球(MIP)，同時可由此實現(xiàn)對三唑類農(nóng)藥的檢測。
功能單體的選擇對于分子印跡聚合物的吸附性能有很大影響，需要根據(jù)模板分子的結構和基本性質(zhì)進行選擇。本發(fā)明選用了甲基丙烯酸(MAA)作為功能單體，可非常好的提高合物對模板分子的識別作用。
為了使生成的印跡聚合物具有一定的空間網(wǎng)絡結構和穩(wěn)定的結合位點，分子印跡聚合物要求的交聯(lián)度很高。本發(fā)明所優(yōu)選的三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)具有較高的交聯(lián)度(70～90％)，且在預聚合溶液中具有良好的溶解性。
在分子印跡聚合反應中多為自由基引發(fā)反應，因此在反應時需加入引發(fā)劑引發(fā)聚合反應，本發(fā)明優(yōu)選偶氮二異丁腈(AIBN)作為引發(fā)劑。偶氮二異丁腈是油溶性的偶氮引發(fā)劑，偶氮類引發(fā)劑反應穩(wěn)定，是一級反應，沒有副反應，比較好控制。
致孔劑實際也起著溶劑的作用。溶劑的選擇在分子印跡制備中發(fā)揮著重要作用，對分子間的作用力和MD的形態(tài)影響很大，且起著致孔劑的作用。通常選擇的溶劑要具備以下3個條件：1)、能溶解模板分子和功能單體；2)、能形成大的流通孔；3)、對模板分子與功能單體之間的相互作用干擾小。一般根據(jù)印跡分子與功能單體間可能的作用力類型選擇適宜極性的溶劑，溶劑的極性越大，對分子識別的干擾也就越大，吸附率就越低。本發(fā)明所采用的乙腈極性小，介電常數(shù)低，同時對幾種反應物的溶解性也非常好。
可選的，如上所述的三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球，所述三唑酮與所述甲基丙烯酸的摩爾比為1:(5～7)。
可選的，如上所述的三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球，所述微球的粒徑≤2μm。
如上所述的三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球的制備方法，包括：
將所述模板分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑溶解在惰性溶劑中，隨后通惰性氣體除氧，熱引發(fā)聚合反應，再經(jīng)洗脫以及干燥后即得。
本發(fā)明的聚合方法為沉淀聚合法，特點是得到的產(chǎn)物粒徑比較均一，比表面積大，具有更多的識別位點，因而具有更優(yōu)秀的吸附性能。
可選的，如上所述的三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球的制備方法，將所述模板分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑溶解在惰性溶劑中時，先將所述模板分子以及功能單體溶解在惰性溶劑中并預聚合25～35min后，再加入所述交聯(lián)劑和引發(fā)劑。
可選的，如上所述的三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球的制備方法，所述熱引發(fā)聚合反應的反應條件為55～65℃聚合反應22～26h。
一種固相萃取柱，所述固相萃取柱以如上所述的三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球為填料。
如上的固相萃取柱在檢測三唑類農(nóng)藥中的應用。
可選的，如上所述的應用，所述三唑類農(nóng)藥的種類包括殺菌劑和植物生長調(diào)節(jié)劑；
可選的，所述殺菌劑包括多效唑和/或烯效唑；
可選的，所述植物生長調(diào)節(jié)劑包括葉菌唑、三唑酮、聯(lián)苯三唑醇、烯唑醇、三唑醇、己唑醇、環(huán)丙唑醇、戊唑醇、糠菌唑、苯醚甲環(huán)唑、氟環(huán)唑、腈苯唑、腈菌唑、戊菌唑、丙環(huán)唑、四氟醚唑、氟菌唑及芐氯三唑醇中的一種或多種。
為表述方便，以下將固相萃取柱簡稱為SPE，將填充有三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球的固相萃取柱簡稱為MISPE柱。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：
1)、首次將甲基丙烯酸(MAA)做為功能單體，采用沉淀聚合法制備三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物，以此聚合物為填料制成的MISPE柱，解決了傳統(tǒng)固相萃取柱的吸附普遍性、洗脫復雜性、無法重復使用的缺點，實現(xiàn)了分子印跡聚合物和固相萃取柱的技術集成。
2)、吸附類特異性，由于SPE常用的吸附劑主要選擇性較差，在富集分析物的同時，大量基體和干擾物質(zhì)也被富集，導致洗脫液中仍含有基體和雜質(zhì)，干擾最后的色譜分析。同時，市場上的MISPE柱只能特異性吸附一種物質(zhì)，而當前研制的固相萃取小柱，具有能高度的選擇性和吸附性以及類特異性，實現(xiàn)了以分子印跡聚合物同時吸附和富集多種同類藥物的固相萃取技術的應用。
3)、方便快捷，采用MISPE柱進行樣品前處理，步驟簡單，且分離、富集、凈化效果好。
4)、環(huán)保，MISPE柱前處理技術有機溶劑使用量少，符合當前環(huán)保的要求。
5)、回收利用，在MIP的制備中使用的模板分子可以回收利用，減少成本。
6)、本發(fā)明通過對溶劑、功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑的種類和用量進行選擇，優(yōu)化聚合條件，制得具有更好的粒徑分布、物理穩(wěn)定性、優(yōu)良的吸附性能的分子印跡聚合物，能夠選擇性識別與模板分子結構類似的20種三唑類農(nóng)藥，具有良好的“類”特異性。
具體實施方式
下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
一種三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球，所述分子印跡聚合物微球以三唑酮為模板分子、甲基丙烯酸為功能單體、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈為引發(fā)劑在惰性溶劑中反應后脫除模板分子而得到。
基于MIPs以上特點和三唑類農(nóng)藥檢測的實際需要，采用沉淀聚合法，合成了具有高度“類”特異性、選擇性的分子印跡聚合物微球，并以此為填料開發(fā)出適用于特異性吸附三唑類農(nóng)藥的MISPE通用小柱，實現(xiàn)了對20種三唑類農(nóng)藥的多殘留高效富集和檢測。
截至目前，尚未見以三唑酮為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙腈為溶劑，AIBN為引發(fā)劑，TRIM為交聯(lián)劑制備三唑類農(nóng)藥MISPE柱的報道。
因此，本發(fā)明三唑酮為模板，MAA為功能單體，乙腈為溶劑，AIBN為引發(fā)劑以及TRIM為交聯(lián)劑，采用沉淀聚合法合成對多種三唑類農(nóng)藥有較高吸附性能的MIP，以此MIP作為填料制成的MISPE柱對可用于樣品中痕量三唑類農(nóng)藥的檢測，其方法簡便快捷，回收率高。此方法是將固相萃取柱的方便和分子印跡聚合物的特異性結合起來達到樣品前處理快速、簡便的目的。
優(yōu)選的，所述惰性溶劑包括甲苯、二氯甲烷、乙腈、氯仿中的一種或多種；更優(yōu)選的，所述惰性溶劑為乙腈。
優(yōu)選的，如上所述的三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球，所述三唑酮與所述甲基丙烯酸的摩爾比為1:(5～7)；更優(yōu)選的，所述三唑酮與所述甲基丙烯酸的摩爾比為1:6；
進一步優(yōu)選的，所述模板分子中三唑酮在所述惰性溶劑中的濃度為0.05mmol～0.15mmol，更優(yōu)選為0.1mmol；所述甲基丙烯酸在所述惰性溶劑中的濃度為0.3mmol～0.9mmol，更優(yōu)選為0.6mmol。
優(yōu)選的，所述三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯在所述惰性溶劑中的濃度為0.6mmol～1.4mmol，更優(yōu)選為1.0mmol。
優(yōu)選的，所述微球的粒徑≤2μm；更優(yōu)選的粒徑≤1μm；更優(yōu)選的粒徑≤0.5μm。
本領域技術人員可根據(jù)本發(fā)明提供的分子印跡聚合物、模板分子、功能單體、交聯(lián)劑種類選用本體聚合法、沉淀聚合法、懸浮聚合法、電聚合法；最優(yōu)選的，采用沉淀聚合法，該方法包括：
將所述模板分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑溶解在惰性溶劑中，隨后通惰性氣體除氧，熱引發(fā)聚合反應，再經(jīng)洗脫以及干燥后即得；
優(yōu)選的，所述惰性氣體為氮氣。
優(yōu)選的，如上所述的三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球的制備方法，將所述模板分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑溶解在惰性溶劑中時，先將所述模板分子以及功能單體溶解在惰性溶劑中并預聚合25～35min后，再加入所述交聯(lián)劑和引發(fā)劑；進一步優(yōu)選的，所述預聚合時，反應的條件為室溫下，在震蕩器中震蕩25～35min，所述震蕩器的振蕩頻率為200轉/分。
優(yōu)選的，所述熱引發(fā)聚合反應的反應條件為55～65℃聚合反應22～26h。
一種固相萃取柱，所述固相萃取柱以如上所述的三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球為填料。
優(yōu)選的，所述三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球填充在固相萃取柱內(nèi)時填充量為5mg～50mg，更優(yōu)選的為20mg～40mg。
如上所述的固相萃取柱在檢測三唑類農(nóng)藥中的應用。
優(yōu)選的，如上所述的應用，所述三唑類農(nóng)藥的種類包括殺菌劑和植物生長調(diào)節(jié)劑；
更優(yōu)選的，所述殺菌劑包括多效唑和/或烯效唑；
更優(yōu)選的，所述植物生長調(diào)節(jié)劑包括葉菌唑、三唑酮、聯(lián)苯三唑醇、烯唑醇、三唑醇、己唑醇、環(huán)丙唑醇、戊唑醇、糠菌唑、苯醚甲環(huán)唑、氟環(huán)唑、腈苯唑、腈菌唑、戊菌唑、丙環(huán)唑、四氟醚唑、氟菌唑及芐氯三唑醇中的一種或多種。
優(yōu)選的，如上所述的應用，其檢測三唑類農(nóng)藥時的具體操作包括：
使用乙腈和水活化MISPE柱后，將待測物預處理后過固相萃取柱，隨后用體積百分數(shù)為15％～25％的乙腈的水溶液淋洗，再用乙腈洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干供檢測；優(yōu)選的，所述檢測的方法為LC-MS/MS。
實施例1
A)、將0.0145g三唑酮模板分子(0.05mmol)和0.07mL甲基丙烯酸(0.35mmol)溶于20mL乙腈中，在震蕩器中震蕩預作用25min；
B)、模板分子和甲基丙烯酸預聚合后，向A)中的混合液中加入0.1824mL TRIM(終濃度0.6mmol)和30.0mg AIBN充分混勻。充氮氣除氧之后密封；
C)、55℃恒溫水浴加熱26h，冷卻、離心、過篩，棄去上清液，得到沉淀物，再將沉淀物自然干燥；
D)、用乙酸和甲醇體積比為1:9的混合溶液洗脫除去殘余的單體和交聯(lián)劑等物質(zhì)，再用甲醇洗滌5h去除乙酸，直至用高效液相色譜檢測不到三唑酮；
將洗脫去除模板分子的粉末置于干燥箱中烘干，得到三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球，其為白色，粒徑≤2μm；
E)、稱取30mg聚合物均勻裝填于固相萃取柱中得到MISPE柱。
實施例2
A)、將0.0435g三唑酮模板分子(0.15mmol)和0.15mL甲基丙烯酸(0.75mmol)溶于20mL乙腈中，在震蕩器中震蕩預作用35min；
B)、模板分子和甲基丙烯酸預聚合后，向A)中的混合液中加入0.4256mL TRIM(終濃度1.4mmol)和30.0mg AIBN充分混勻。充氮氣除氧之后密封；
C)、65℃恒溫水浴加熱22h，冷卻、離心、過篩，棄去上清液，得到沉淀物，再將沉淀物自然干燥；
D)、用乙酸和甲醇體積比為1:9的混合溶液洗脫除去殘余的單體和交聯(lián)劑等物質(zhì)，再用甲醇洗滌5h去除乙酸，直至用高效液相色譜檢測不到三唑酮；
將洗脫去除模板分子的粉末置于干燥箱中烘干，得到三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球，其為白色，粒徑≤2μm；
E)、稱取30mg聚合物均勻裝填于固相萃取柱中得到MISPE柱。
實施例3
A)、將0.029g三唑酮模板分子(0.1mmol)和0.12mL甲基丙烯酸(0.6mmol)溶于20mL乙腈中，在震蕩器中震蕩預作用30min；
B)、模板分子和甲基丙烯酸預聚合后，向A)中的混合液中加入0.304mL TRIM(終濃度1.0mmol)和30.0mg AIBN充分混勻。充氮氣除氧之后密封；
C)、60℃恒溫水浴加熱24h，冷卻、離心、過篩，棄去上清液，得到沉淀物，再將沉淀物自然干燥；
D)、用乙酸和甲醇體積比為1:9的混合溶液洗脫除去殘余的單體和交聯(lián)劑等物質(zhì)，再用甲醇洗滌5h去除乙酸，直至用高效液相色譜檢測不到三唑酮；
將洗脫去除模板分子的粉末置于干燥箱中烘干，得到三唑類農(nóng)藥分子印跡聚合物微球，其為白色，粒徑≤2μm；
E)、稱取30mg聚合物均勻裝填于固相萃取柱中得到MISPE柱。
實驗例
取實施例3制備得到的MISPE柱事先用3mL乙腈、1mL水活化，隨后每個MISPE柱量取添加濃度為1μg/kg、2μg/kg和10μg/kg的20種三唑類農(nóng)藥葡萄提取樣；
每個MISPE柱用1mL體積百分數(shù)為20％的乙腈的水溶液淋洗去除雜質(zhì)，再用3mL乙腈洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干至1mL，采用LC-MS/MS檢測。
其中，20種三唑類農(nóng)藥分子印跡固相萃取柱的吸附性如表1所示：
表1 20種三唑類農(nóng)藥分子印跡固相萃取柱的回收率和精密度值
為更好地說明本申請的效果，申請人根據(jù)胡艷云等(分子印跡固相萃取·液相色譜-質(zhì)譜法測定果蔬中20種三唑類農(nóng)藥殘留，2014年2月，分析化學研究報告第42卷第2期，227～232)文章中記載的方法合成了相應的MIP并制備成MISPE小柱作為對比例，每個小柱中同樣稱取30mg聚合物，實驗條件與操作均與對比例文章中記載的相同。實驗結果如表2所示：
表2 對比例20種三唑類農(nóng)藥分子印跡固相萃取柱的回收率和精密度值
本發(fā)明采用沉淀聚合技術，以三唑酮為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑構成的新型聚合體系中獲得了對多效唑等20種常用三唑類農(nóng)藥具有類特異性吸附能力的分子印跡聚合物微球，實現(xiàn)了適用于葡萄等多種蔬果樣品中20種三唑類農(nóng)藥的高效富集、萃取與分離，解決了分子印跡聚合物技術不能特異性識別多效唑等三唑類農(nóng)藥的技術難題。
從以上結果可知，對比例方法制備的大部分MIP在進行葡萄中的三唑類農(nóng)藥殘留檢測時，在回收率與RSD上與本申請效果無明顯區(qū)別，但在多效唑、烯效唑及芐氯三唑醇的檢測上存在顯著的差異。而多效唑、烯效唑為現(xiàn)在非常常用的三唑類農(nóng)藥分子。這種差異的產(chǎn)生一方面可能是由于不同聚合物的制備方法制備的MIP的親水性能差異較大，因而導致在水分含量較多是水果中(在這個例子中，即葡萄)使用效果發(fā)生了較大差異；另一方面，由于本申請采用MAA為功能單體，使得制備的MIP在偏酸性的環(huán)境下仍然具有優(yōu)秀的吸附性能。
綜上所述，本發(fā)明所提供的MIP及MISPE小柱，除可對含水量較低的果蔬進行檢測外，還可針對高含水量的果蔬(如葡萄、西紅柿、黃瓜、桃等)進行檢測，且更對檢測環(huán)境(如pH值)有較高的寬容度，因而具有更為廣泛的應用。
最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制；為敘述方便，本發(fā)明僅在實驗例中給出了最佳實施例3的效果，但實際上在本申請權利要求的記載范圍內(nèi)該效果均可實現(xiàn)，其中實施例1～2的實驗數(shù)據(jù)(回收率和RSD)與實施例3的實驗數(shù)據(jù)相比浮動不超過8％。
盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。