本發(fā)明涉及一種生物化工領(lǐng)域的微生物發(fā)酵方法，具體的說，是一種通過pH沖擊來提高井岡霉素產(chǎn)量的方法。

背景技術(shù)：

井岡霉素，又稱有效霉素A，是吸水鏈霉菌井岡變種5008產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，能有效防治水稻紋枯病等作物真菌性病害，是當(dāng)今我國(guó)使用面積最廣和產(chǎn)量最大的農(nóng)用抗生素。本次所用的菌株是上海農(nóng)藥所報(bào)道的吸水鏈霉菌井岡變種5008菌株(Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis 5008)。井岡霉素有著安全、高效、廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)，而且施用方便，易于推廣，使用史至今已有50余年，只有數(shù)例病原菌耐藥性的報(bào)道。此外，井岡霉素還是生產(chǎn)抗糖尿病臨床用藥阿卡波糖(拜糖平)和伏格列波糖(倍欣)的直接原料。

經(jīng)過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，近年來，人們對(duì)井岡霉素生產(chǎn)的研究在生物活性機(jī)制、生物合成途徑與生產(chǎn)工藝等方面取得大量進(jìn)展，但在生產(chǎn)工藝方面的優(yōu)化主要集中在補(bǔ)糖、加氧、加N⁺、溫度調(diào)節(jié)等方面，發(fā)酵pH是影響發(fā)酵過程的一種重要因素。

在發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵體系的pH逐漸增大，井岡霉素產(chǎn)量也逐漸增多，經(jīng)過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，pH與井岡霉素生產(chǎn)之間存在一定的關(guān)系，隨著pH的增加，井岡霉素產(chǎn)量也增加。為此，本發(fā)明通過嘗試pH沖擊來找到提高井岡霉素產(chǎn)量的方法，以有助于降低工業(yè)化生產(chǎn)的成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在現(xiàn)有的發(fā)酵技術(shù)基礎(chǔ)上，本發(fā)明的目的在于提供一種基于pH沖擊的井岡霉素優(yōu)化發(fā)酵方法，通過向發(fā)酵液中添加堿性溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行pH沖擊，刺激吸水鏈霉菌代謝，使其能更快利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，最終使井岡霉素發(fā)酵產(chǎn)量提高。該方法簡(jiǎn)單易行、能耗少，且獲得較高的井岡霉素產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本，本發(fā)明為提高井岡霉素產(chǎn)量提供了一種簡(jiǎn)單有效的方法，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明通過在吸水鏈霉菌井岡變種5008菌株的發(fā)酵培養(yǎng)階段添加堿性溶液進(jìn)行pH沖擊實(shí)現(xiàn)井岡霉素產(chǎn)量提高。

本發(fā)明的方案具體如下：

一種通過pH沖擊來提高井岡霉素產(chǎn)量的方法包括如下步驟：

第一步，將-80℃保存的吸水鏈霉菌井岡變種5008菌株的孢子懸浮液融化，將其涂布于含有固體培養(yǎng)基的平板上，然后將平板倒置，于37℃培養(yǎng)7-10d，待表面布滿青灰色孢子時(shí)取出，制備孢子活化液；所述的吸水鏈霉菌井岡變種5008菌株，Streptomyces hygroscopicus var.Jinggangensis 5008，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號(hào)為CGMCC4.1026；

第二步，將孢子活化液與種子培養(yǎng)基按照體積比為1：1000的比例接種到種子培養(yǎng)基中，接種后于37℃，220rpm條件下培養(yǎng)20-28小時(shí)；

第三步，將種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基按照體積比為1：10的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后以37℃，220rpm條件下培養(yǎng)12-24h后,加入堿溶液直到發(fā)酵體系pH達(dá)到7.5-8.5，繼續(xù)發(fā)酵96-120h，發(fā)酵結(jié)束。

優(yōu)選的，所述的堿溶液不含無機(jī)磷酸鹽離子。

優(yōu)選的，所述的堿溶液為KOH溶液、NaOH溶液或NH₃·H₂O溶液。

優(yōu)選的，所述的堿溶液的滴加方式為緩慢沿壁逐滴滴加堿溶液，并迅速搖勻。

優(yōu)選的，所述的堿溶液的濃度為2mol/L。

優(yōu)選的，所述的步驟三中，,加入堿溶液前的培養(yǎng)時(shí)間為20h，加入堿溶液直到發(fā)酵體系pH達(dá)到8.0。

優(yōu)選的，所述的固體培養(yǎng)基的組分為：黃豆餅粉20g/L、甘露醇20g/L以及瓊脂20g/L，余量為自來水；所述的種子培養(yǎng)基的組分為：玉米粉30g/L、黃豆餅粉22g/L、酵母粉10g/L、NaCl 2g/L以及KH₂PO₄ 0.8g/L，余量為蒸餾水；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：玉米粉100g/L、黃豆餅粉25g/L、酵母粉5g/L、NaCl 1g/L以及KH₂PO₄ 1.5g/L，余量為去離子水。

本發(fā)明利用堿性溶液對(duì)細(xì)胞的pH沖擊，使細(xì)胞處于一種受脅迫的極端環(huán)境，并激活相關(guān)應(yīng)激通路，促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)，刺激吸水鏈霉菌代謝，使吸水鏈霉菌加速分解和利用相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，最終使井岡霉素發(fā)酵產(chǎn)量提高。本發(fā)明確定了最佳堿處理溶液為NaOH溶液，最佳堿處理時(shí)間為發(fā)酵開始20h，井岡霉素的產(chǎn)量從11.34g/L提高到了14.44g/L，降低了生產(chǎn)成本。

附圖說明

圖1為實(shí)施例中不同堿性溶液添加對(duì)井岡霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響圖；

圖2為實(shí)施例中堿性溶液添加時(shí)間對(duì)井岡霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響圖。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，但下述的實(shí)施例不用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

發(fā)酵培養(yǎng)基中添加堿性溶液進(jìn)行pH沖擊對(duì)井岡霉素產(chǎn)量的影響，選擇三種堿性溶液：NaOH溶液、NH₃·H₂O溶液、帶有磷酸鹽緩沖液的KOH溶液，分別調(diào)整發(fā)酵液pH至8.0進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。實(shí)施步驟和結(jié)果如下：

1.實(shí)施步驟

(1)菌種活化與平板培養(yǎng)

將保存于-80℃冰箱的甘油凍藏管取出，待其融化后，在超凈工作臺(tái)中用接種環(huán)取一環(huán)孢子液在滅菌后的產(chǎn)孢平板培養(yǎng)基(成分：黃豆餅粉2g、甘露醇2g，瓊脂2g，自來水100mL)上劃線接種。接種后將平板倒置培養(yǎng)于37℃恒溫培養(yǎng)箱中7-10天后，觀察到培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿了青色孢子，向平板中加入8mL左右25％甘油，用接種環(huán)將孢子刮下，使其懸浮于甘油中，將孢子懸浮液轉(zhuǎn)移至滅菌后的2mL離心管中，置于-20℃保存，用于菌種活化及發(fā)酵接種。

(2)種子培養(yǎng)

將不銹鋼彈簧卷曲后置于250mL三角瓶底部，裝入50mL種子培養(yǎng)基(成分：玉米粉3g、黃豆餅粉2.2g、酵母粉1g、NaCl 0.2g，以及KH₂PO₄ 0.08g，蒸餾水100mL)，滅菌。在超凈工作臺(tái)中，吸取0.1mL(1)中所制備的孢子懸浮液接種到已滅菌的種子培養(yǎng)基中，再將種子培養(yǎng)基置于恒溫?fù)u床中，在37℃，220rpm條件下培養(yǎng)20-28小時(shí)，每次準(zhǔn)備3個(gè)平行。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)

對(duì)照組：不銹鋼彈簧卷曲后置于250mL三角瓶底部，裝入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基(成分：玉米粉10g、黃豆餅粉2.5g、酵母粉0.5g、NaCl 0.1g，以及KH₂PO₄ 0.15g，去離子水100mL)，滅菌。轉(zhuǎn)接時(shí)首先將三個(gè)平行種子液混和均勻，然后用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵培養(yǎng)基中，再將發(fā)酵培養(yǎng)基置于恒溫?fù)u床中，在37℃，220rpm條件下培養(yǎng)，準(zhǔn)備3個(gè)平行。培養(yǎng)進(jìn)行到24h、48h、72h、96h、120h，每個(gè)瓶分別取2mL發(fā)酵液進(jìn)行井岡霉素檢測(cè)。

NaOH溶液處理組：不銹鋼彈簧卷曲后置于250mL三角瓶底部，裝入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌。轉(zhuǎn)接時(shí)首先將三個(gè)平行種子液混和均勻，然后用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵培養(yǎng)基中，再將發(fā)酵培養(yǎng)基置于恒溫?fù)u床中，以37℃，220rpm培養(yǎng)，準(zhǔn)備4個(gè)平行。培養(yǎng)進(jìn)行到24h時(shí)，取出一個(gè)搖瓶，緩慢沿壁滴加2mol/L NaOH溶液，迅速搖勻，用pH計(jì)測(cè)發(fā)酵液pH，至pH調(diào)整為8.0，記錄加入NaOH溶液的劑量。將其他三組平行搖瓶取出置于超凈臺(tái)中，沿壁添加相同劑量的NaOH溶液，迅速搖勻，然后將三個(gè)平行放置于恒溫?fù)u床中，以37℃，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)進(jìn)行到48h、72h、96h、120h，每個(gè)瓶分別取2mL發(fā)酵液進(jìn)行井岡霉素檢測(cè)。

NH₃·H₂O溶液處理組：不銹鋼彈簧卷曲后置于250mL三角瓶底部，裝入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌。轉(zhuǎn)接時(shí)首先將三個(gè)平行種子液混和均勻，然后用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵培養(yǎng)基中，再將發(fā)酵培養(yǎng)基置于恒溫?fù)u床中，以37℃，220rpm培養(yǎng)，準(zhǔn)備4個(gè)平行。培養(yǎng)進(jìn)行到24h時(shí)，取出一個(gè)搖瓶，緩慢沿壁滴加2mol/L NH₃·H₂O溶液,迅速搖勻，用pH計(jì)測(cè)發(fā)酵液pH，至pH調(diào)整為8.0，記錄加入NH₃·H₂O溶液的劑量。將其他三組平行搖瓶取出置于超凈臺(tái)中，沿壁添加相同劑量的NH₃·H₂O溶液，迅速搖勻，然后將三個(gè)平行放置于恒溫?fù)u床中，以37℃，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)進(jìn)行到48h、72h、96h、120h，每個(gè)瓶分別取2mL發(fā)酵液進(jìn)行井岡霉素檢測(cè)。

磷酸鹽緩沖液處理組：不銹鋼彈簧卷曲后置于250mL三角瓶底部，裝入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌。轉(zhuǎn)接時(shí)首先將三個(gè)平行種子液混和均勻，然后用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵培養(yǎng)基中，再將發(fā)酵培養(yǎng)基置于恒溫?fù)u床中，以37℃，220rpm培養(yǎng)，準(zhǔn)備4個(gè)平行。培養(yǎng)進(jìn)行到24h時(shí)，取出一個(gè)搖瓶，緩慢沿壁滴加2mol/L KOH溶液,迅速搖勻，用pH計(jì)測(cè)發(fā)酵液pH，至pH調(diào)整為8.0，記錄加入KOH溶液的劑量。將其他三組平行搖瓶取出置于超凈臺(tái)中，沿壁添加相同劑量的KOH溶液，迅速搖勻，然后將三個(gè)平行放置于恒溫?fù)u床中，以37℃，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)進(jìn)行到48h、72h、96h、120h，每個(gè)瓶分別取2mL發(fā)酵液進(jìn)行井岡霉素檢測(cè)。

(4)井岡霉素產(chǎn)量檢測(cè)

樣品處理：取2mL發(fā)酵液置于2mL離心管中，于10000g離心5min，吸取0.5mL上清液于新離心管中，再加入0.5mL氯仿，劇烈震蕩至溶液形成乳濁液。室溫靜置15min后，12000g離心5min。小心吸取上清液，適當(dāng)稀釋至測(cè)量范圍以內(nèi)，以0.22μm的水系微孔濾膜過濾，作為HPLC上樣樣品。

井岡霉素標(biāo)品處理：稱取井岡霉素標(biāo)準(zhǔn)品粉末，配成10g/L母液，分別取100μL、200μL、300μL、400μL、500μL母液加水至l mL(濃度分別為1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L，再乘以井岡霉素標(biāo)品的純度即為實(shí)際濃度)。

流動(dòng)相處理：各流動(dòng)相(超純水、甲醇、磷酸鹽緩沖液)分別進(jìn)行抽濾并脫氣處理30min。

液相色譜條件：以98％的磷酸鹽緩沖液與2％的甲醇為流動(dòng)相；流速l mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，使用Promosil C18色譜柱4.6mm×250mm/5μm，柱溫為35℃；出峰時(shí)間約為7-9min。根據(jù)峰面積對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線得到井岡霉素含量，因樣品處理時(shí)均稀釋過，所以比對(duì)得到的含量乘以稀釋倍數(shù)就得到井岡霉素的發(fā)酵產(chǎn)量。

2.實(shí)施結(jié)果分析

對(duì)照組與堿溶液添加組三種不同堿性溶液處理下井岡霉素最高產(chǎn)量為：對(duì)照組11.34g/L；帶磷酸鹽緩沖液的氫氧化鉀處理組9.52g/L，氫氧化鈉處理組13.21g/L，氨水處理組12.61g/L。在氫氧化鈉和氨水的兩個(gè)處理組，井岡霉素的產(chǎn)量與對(duì)照組相比均有增加(圖1)，氫氧化鈉處理組井岡霉素的產(chǎn)量有較大提高。經(jīng)查閱文獻(xiàn)知，過多的無機(jī)磷酸鹽會(huì)阻礙次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，因此有磷酸鹽緩沖液處理組反而比對(duì)照組井岡霉素的產(chǎn)量要低。因此我們又對(duì)對(duì)照作了改變，以磷酸鹽緩沖液作為對(duì)照，以帶磷酸鹽緩沖液的氫氧化鉀溶液處理作為試驗(yàn)組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)井岡霉素產(chǎn)量相比于對(duì)照組也有很明顯的增加(數(shù)據(jù)沒有顯示)。由此可見，堿性溶液處理可以提高井岡霉素的產(chǎn)量。由于吸水鏈霉菌5008在發(fā)酵的12-24h是代謝較為旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，所以在本實(shí)施例中我們選擇24h作為堿性溶液處理的時(shí)間點(diǎn)。

進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，將終點(diǎn)PH調(diào)整在7.5-8.5的范圍內(nèi)，堿性溶液處理組與對(duì)照組相比，均可明顯提高井岡霉素的最高產(chǎn)量。

實(shí)施例2

由實(shí)施例一可知，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加NaOH溶液可促進(jìn)井岡霉素產(chǎn)量提高且效果最好，接下來詳細(xì)比較不同發(fā)酵階段添加NaOH溶液進(jìn)行pH沖擊對(duì)井岡霉素產(chǎn)量的影響，選擇6個(gè)時(shí)間點(diǎn)：發(fā)酵開始后4h，8h，12h，16h，20h，24h，分別調(diào)整發(fā)酵液pH至8.0進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。實(shí)施步驟和結(jié)果如下：

1.實(shí)施步驟

(1)菌種活化與平板培養(yǎng)

同實(shí)施例1

(2)種子培養(yǎng)

同實(shí)施例1

(3)發(fā)酵培養(yǎng)

對(duì)照組：不銹鋼彈簧卷曲后置于250mL三角瓶底部，裝入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基(成分：玉米粉10g、黃豆餅粉2.5g、酵母粉0.5g、NaCl 0.1g，以及KH₂PO₄ 0.15g，去離子水100mL)，滅菌。轉(zhuǎn)接時(shí)首先將三個(gè)平行種子液混和均勻，然后用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵培養(yǎng)基中，再將發(fā)酵培養(yǎng)基置于恒溫?fù)u床中，以37℃，220rpm培養(yǎng)，準(zhǔn)備3個(gè)平行。培養(yǎng)進(jìn)行到24h、48h、72h、96h、120h，每個(gè)瓶分別取2mL發(fā)酵液進(jìn)行井岡霉素檢測(cè)。

不同時(shí)間點(diǎn)處理組：不銹鋼彈簧卷曲后置于250mL三角瓶底部，裝入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌。轉(zhuǎn)接時(shí)首先將三個(gè)平行種子液混和均勻，然后用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵培養(yǎng)基中，再將發(fā)酵培養(yǎng)基置于恒溫?fù)u床中，以37℃，220rpm培養(yǎng)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理組4個(gè)平行。培養(yǎng)分別進(jìn)行到4h、8h、12h、16h、20h、24h時(shí)，取出相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處理組4個(gè)平行中的一個(gè)搖瓶，緩慢沿壁滴加2mol/L NaOH溶液,迅速搖勻，用pH計(jì)測(cè)發(fā)酵液pH，至pH調(diào)整為8.0，記錄加入NaOH溶液的劑量。將其他三個(gè)平行搖瓶取出置于超凈臺(tái)中，沿壁添加相同劑量的NaOH溶液，迅速搖勻，然后將三個(gè)平行放置于恒溫?fù)u床中，以37℃，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)進(jìn)行到24h、48h、72h、96h、120h，每個(gè)瓶分別取2mL發(fā)酵液進(jìn)行井岡霉素檢測(cè)。

(4)井岡霉素產(chǎn)量檢測(cè)

同實(shí)施例1

2.實(shí)施結(jié)果分析

對(duì)照組與不同時(shí)間點(diǎn)氫氧化鈉處理組井岡霉素最高產(chǎn)量為：對(duì)照組11.34g/L；4h添加氫氧化鈉處理組10.06g/L，8h添加氫氧化鈉處理組12.47g/L，12h添加氫氧化鈉處理組12.92g/L，16h添加氫氧化鈉處理組12.76g/L，20h添加氫氧化鈉處理組14.44g/L，24h添加氫氧化鈉處理組13.21g/L。在4h-24h間不同時(shí)間點(diǎn)添加氫氧化鈉溶液，使得井岡霉素產(chǎn)量有一定的增加，隨著時(shí)間點(diǎn)的推遲，井岡霉素產(chǎn)量越來越高，在20h添加氫氧化鈉溶液時(shí)井岡霉素產(chǎn)量達(dá)到最高(圖2)。經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵初期添加氫氧化鈉溶液，此時(shí)細(xì)胞還在剛開始生長(zhǎng)的階段，堿性溶液的刺激在一定程度上阻礙的細(xì)胞的生長(zhǎng)，所以發(fā)酵初期添加氫氧化鈉溶液對(duì)井岡霉素產(chǎn)量的提高效果不明顯甚至降低了井岡霉素的產(chǎn)量。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，細(xì)胞生長(zhǎng)基本完成，添加氫氧化鈉溶液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響減小，對(duì)代謝的影響增大，刺激次級(jí)代謝的進(jìn)行，從而使井岡霉素的產(chǎn)量提高。

雖然上文中已經(jīng)用一些說明和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以作適當(dāng)修改或者改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明的基礎(chǔ)上所作的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。