本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及中藥及中藥材鑒定領(lǐng)域，特別涉及一種用于霍山石斛與重唇石斛的比對鑒定方法。
背景技術(shù)：
：霍山石斛（Dendrobiumhuoshanense）是安徽省大別山區(qū)特有的、國家重點保護的名貴中草藥，隸屬于蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）。重唇石斛（Dendrobiumhercoglossum）為霍山石斛的同屬近緣種，兩者形態(tài)特征比較相近，制成楓斗后兩者不易通過外形進行鑒別，導(dǎo)致在市場上重唇石斛成為霍山石斛的混淆品之一。由于霍山石斛與重唇石斛通過外形鑒別比較困難，采用傳統(tǒng)的鑒定方法有一定的局限。因此，亟需尋找一種快速、準確的鑒定方法，以確?；羯绞幉蔫b定的準確性。栗丹等利用DNA條形碼ITS序列對霍山石斛及其近緣物種進行了鑒定（栗丹，李振堅，毛萍，嚴雪鋒，淳澤，馬欣榮，基于ITS序列石斛材料的鑒定及系統(tǒng)進化分析，園藝學(xué)報，2012，39（8）：1539），但該方法需要進行測序，耗時較長，且使用大型儀器，不利于實現(xiàn)快速、現(xiàn)場檢測。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定霍山石斛的引物對。一種用于霍山石斛與重唇石斛的比對鑒定的操作步驟如下：（1）提取待測樣品的DNA作為模板，采用引物對進行PCR擴增反應(yīng)，得到PCR擴增產(chǎn)物；所述引物對為：上游引物CP6s：5’-GCCCATAAATGGGTTTC-3’下游引物CP6a：5’-GCACATCCGAGCCTTA-3’；（2）瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR擴增產(chǎn)物若PCR擴增產(chǎn)物中含有275bp的DNA片段，則所述待測樣品中含有霍山石斛；若PCR擴增產(chǎn)物中不含有275bp的DNA片段，則所述待測樣品為非霍山石斛。進一步限定的比對鑒定技術(shù)方案如下：步驟（1）PCR擴增反應(yīng)中，PCR反應(yīng)體系的總體積25μL，其中0.5μL待測樣品的DNA，1.0μL含量為10pmol的上游引物CP6s，1.0μL含量為10pmol的下游引物CP6a，2.5μL10×buffer緩沖液，1.5μL濃度為25mM的氯化鎂（MgCl2）水溶液，0.5μL濃度為10mM的dNTPs，0.5μL濃度為5U/μL的TaqDNA聚合酶，無菌雙蒸水補足至25μL；PCR擴增反應(yīng)條件：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，45個循環(huán)；72℃10min。步驟（2）的具體操作如下：取5μLPCR擴增產(chǎn)物，用2%的瓊脂糖凝膠，在電壓80-90V下電泳30分鐘，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照；若PCR擴增產(chǎn)物中含有275bp的DNA片段，則所述待測樣品中含有霍山石斛；若PCR擴增產(chǎn)物中未含有275bp的DNA片段，則所述待測樣品為非霍山石斛。一種用于霍山石斛與重唇石斛的比對鑒定的檢測試劑盒，將PCR反應(yīng)體系中的上游引物CP6s和下游引物CP6a分別單獨包裝；將除待測樣品的DNA、上游引物CP6s和下游引物CP6a外的其它物質(zhì)混合均勻單獨包裝；將以上分別單獨包裝的物質(zhì)放置于同一個試劑盒內(nèi)，組成一個檢測試劑盒。進一步限定的檢測試劑盒技術(shù)方案如下：根據(jù)進一步限定的比對鑒定操作技術(shù)方案所述的檢測試劑盒，在每次檢測時，需要從檢測試劑盒中取用不同的物質(zhì)，各種物質(zhì)所取的量必須滿足進一步限定的鑒定操作技術(shù)方案中PCR反應(yīng)體系中各物質(zhì)量的要求。實驗證明，采用本發(fā)明所提供的引物，通過快速PCR方法實現(xiàn)了霍山石斛與重唇石斛之間的快速、準確鑒別，實現(xiàn)藥材分子鑒別的現(xiàn)場運用提供技術(shù)支撐。附圖說明圖1為霍山石斛、重唇石斛及部分相似種的系統(tǒng)發(fā)育樹。其中，譜系分支節(jié)點上方為BI樹的后驗概率PP和MP樹的自舉支持度BS，在斜線的左邊為PP值，斜線的右邊為BS值。圖2為通用引物擴增凝膠電泳圖。M：DNA分子標準（DNAMarker，從上到下依次為2000、1000、750、500、250和100bp）；1：霍山石斛；2：重唇石斛；3：：空白對照。圖3為特異性PCR引物對SH-CP6（上下游引物分別為SH-CP6s和SH-CP6a）擴增凝膠電泳圖。M：DNA分子標準（DNAMarker，從上到下依次為2000、1000、750、500、250和100bp）；1：用特異性PCR引物對SH-CP6擴增1個霍山石斛樣本的結(jié)果；2：用特異性PCR引物對SH-CP6擴增1個重唇石斛的結(jié)果；3：空白對照。圖4為特異性PCR引物對SH-CP6（上下游引物分別為SH-CP6s和SH-CP6a）擴增凝膠電泳圖。M：DNA分子標準（DNAMarker，從上到下依次為2000、1000、750、500、250和100bp）；1到7：霍山石斛DNA模板濃度依次為143ng/μl、71ng/μl、36ng/μl、18ng/μl、9ng/μl、4ng/μl和2ng/μl；8到14：重唇石斛DNA模板濃度依次為143ng/μl、71ng/μl、36ng/μl、18ng/μl、9ng/μl、4ng/μl和2ng/μl。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、用于鑒定霍山石斛的試劑盒的制備及使用方法一、用于鑒定霍山石斛的引物對的設(shè)計與合成從GenBank查找或通過本研究進行測序獲得霍山石斛及混淆品的ITS序列，詳見下表1。其中，本研究測序所得單倍型序列（包括Hap5，Hap6和Hap7）詳見序列表中序列4至序列6所示。表1霍山石斛、重唇石斛及部分相似種的ITS序列編號樣品名稱樣品數(shù)量單倍型GenBank登錄號本研究所得序列編號1鐵皮石斛Dendrobiumcatenatum1Hap1KP7435432鐵皮石斛Dendrobiumcatenatum1Hap2KF1434393金釵石斛Dendrobiumnobile1Hap3EF6187324金釵石斛Dendrobiumnobile1Hap4JN3885795河南石斛Dendrobiumhenanense1Hap5IHN1H6河南石斛Dendrobiumhenanense6Hap6IHN1C;IHN1E;IHN1F;IHN1G;HNITS01;IHN1D7霍山石斛Dendrobiumhuoshanense3Hap7KF143476IHS1AIHS2D8霍山石斛Dendrobiumhuoshanense1Hap8JN3885679重唇石斛Dendrobiumhercoglossum1Hap9JN38857610重唇石斛Dendrobiumhercoglossum1Hap10EU84069311美花石斛Dendrobiumloddigesii1Hap11KF14348112美花石斛Dendrobiumloddigesii1Hap12HQ11422013菱唇石斛Dendrobiumleptocladum1Hap13AF52161214菱唇石斛Dendrobiumleptocladum1Hap14EU840697分別用貝葉斯法（Bayesianinference,BI）和簡約法（maximumparsimony,MP）進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建BI和MP兩種系統(tǒng)樹。構(gòu)建系統(tǒng)樹時，用人面石斛Dendrobiummacrophyllum的1條ITS序列（GenBank登錄號分別為AY239979）作為外群。其中BI樹用MrBayesversion3.1.2軟件構(gòu)建，MP樹用PAUP*version4.0beta10軟件構(gòu)建。構(gòu)建BI樹時，用MrModeltestversion2.3軟件根據(jù)AIC（AkaikeInformationCriterion）檢驗標準選擇數(shù)據(jù)的最適模型，所選最適模型是（GTR+G）。馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法（MarkovChainsMonteCarlo,MCMC）設(shè)置為四條鏈并運行1000000代。為了確定其收斂情況，MCMC分別運行兩次。每100代抽取一個樣本，共形成20002個樣本。經(jīng)過分析得知，整個運行在100000代后達到平穩(wěn)，這樣，總共剩余的樣本數(shù)為18002，用剩余樣本重建系統(tǒng)樹并估計其后驗概率值。構(gòu)建MP樹時，設(shè)置自舉重復(fù)次數(shù)bootstrapnreps為1000次，使用啟發(fā)式搜索分析自舉重復(fù)數(shù)據(jù)集，啟發(fā)式搜索設(shè)置為由隨機逐步添加法產(chǎn)生起始樹，重復(fù)10次，采用TBR分支交換。通過BI法和MP法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，2種方法構(gòu)建的系統(tǒng)樹主干一致（圖1）。圖1中各譜系分支的節(jié)點處標有BI樹的后驗概率（posteriorprobability,PP）值和MP樹的自舉支持度（Bootstrap,BS）。結(jié)果表明，霍山石斛所有序列的單倍型形成單系（PP=1.00,BS=96）。在確定霍山石斛為單系群的前提下，用軟件ClustalX1.81對表1中所有ITS序列進行對位排序和比較，找到差異片段，設(shè)計霍山石斛檢測特異性PCR引物，如下：SH-CP6s：5’-GCCCATAAATGGGTTTC-3’（序列1）；SH-CP6a：5’-GCACATCCGAGCCTTA-3’（序列2）。理論PCR產(chǎn)物長度為275bp（序列3）二、用于鑒定霍山石斛的試劑盒的組裝將PCR反應(yīng)體系中，將步驟一設(shè)計合成的上游引物CP6s和下游引物CP6a分別單獨包裝；將除待測樣品的DNA、上游引物CP6s和下游引物CP6a外的其它物質(zhì)混合均勻單獨包裝；將以上分別單獨包裝的物質(zhì)放置于同一個試劑盒內(nèi)，即得到本發(fā)明用于霍山石斛與重唇石斛的比對鑒定的檢測試劑盒。三、鑒定待測樣品中是否含有霍山石斛的方法采用步驟二的檢測試劑盒按照包括如下步驟的方法鑒定待測樣品中是否含有霍山石斛：1、PCR擴增從待測樣品中提取基因組DNA作為模板，采用步驟一設(shè)計合成的上游引物CP6s和下游引物CP6a按照如下進行PCR擴增：PCR反應(yīng)總體積25μL，包括以下試劑：0.5μL模板DNA，1.0μL10濃度pmol的上游引物CP6s（10pmol），1.0μL濃度pmol的下游引物CP6a（10pmol），2.5μL10×buffer緩沖液，1.5μL濃度為25mM的MgCl2水溶液，0.5μL濃度為10mM的dNTPs，0.5μLTaqDNA聚合酶（5U/μL），無菌雙蒸水補足至25μL。PCR反應(yīng)液配制完后，輕輕震蕩混勻，將PCR管放入PCR儀中，進行PCR擴增，具體反應(yīng)條件如下：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，45個循環(huán)；72℃10min。2、PCR產(chǎn)物檢測采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR產(chǎn)物，具體如下：取5μL擴增產(chǎn)物，采用2%的瓊脂糖凝膠，在電壓80-90V下電泳30分鐘，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。根據(jù)目的條帶的大小，按照如下方法確定待測樣品中是否含有霍山石斛：若獲得大小約為275bp的目的條帶（序列3），則所述待測樣品中含有霍山石斛；若沒有獲得大小為275bp的目的條帶（序列3），則所述待測樣品中不含有霍山石斛。實施例2、采用實施例1制備的試劑盒鑒定霍山石斛的特異性分析待測樣品：霍山石斛（采自于安徽）和重唇石斛（采自于廣西）。均符合中國植物志和相關(guān)文獻的鑒別特征描述。通過鑒定，各樣品的實物與名稱相符，質(zhì)量符合標準。一、從待測樣品中提取基因組DNA分別取約50mg干燥樣品（當(dāng)然也可采用100mg新鮮樣品進行基因組DNA提?。?，用CTAB法提取總DNA。具體如下：將無霉變的干燥藥材置于粉碎機中研磨粉碎，過40目篩。將粉末轉(zhuǎn)移到2.0mL的微量離心管中，加入900μL已滅菌的CTAB提取液（配方：2%(2g/100ml)CTAB，100mmol/LTris-HClpH=8.0，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl）、0.02gPVP40000、10μLβ-巰基乙醇充分振蕩混勻，65℃水浴1.5h-2h，期間輕搖2-3次。結(jié)束后取出冷卻至室溫，加入900μL氯仿-異戊醇（體積比24：1），充分振蕩混勻，12000g離心10min。取上清，加入等體積氯仿-異戊醇（體積比24：1），充分振蕩混勻，12000g離心10min。取上清，加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇溶液，-20℃放置0.5h以上。取出，12000g離心10min，棄上清，沉淀用70%（體積分數(shù)）乙醇洗滌兩次，37℃揮干乙醇，用適量滅菌水溶解，-20℃保存。用通用引物TY1s和TY1a檢測以上提取的霍山石斛和重唇石斛的基因組DNA質(zhì)量。TY1s：5’-GATGGATGAACCCTCAAATC-3’；TY1a：5’-GGCAGCCAACGAGAAGA-3’。反應(yīng)總體系為25μL，包括DNA模板0.5μL（5-50ng），上游引物TY1s1μL（10pmol），下游引物TY1a1μL（10pmol），10×PCRBuffer2.5μL，MgCl2（25mM）1.5μL，dNTPs（10mM）0.5μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，ddH2O補足至25μL。通用引物PCR反應(yīng)條件為：95℃5min、35個循環(huán)（每個循環(huán)包括95℃30s，55℃30s，72℃30s）、72℃10min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣品均能擴增出DNA條帶（圖2）。二、PCR擴增以步驟一從待測樣品中提取的基因組DNA為模板，采用實施例1步驟一設(shè)計的引物對（上游引物CP6s和下游引物CP6a）進行PCR擴增。具體的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實施例1步驟三1。實驗同時設(shè)置以雙蒸水為模板作為陰性對照。實驗重復(fù)三次。反應(yīng)結(jié)束后，按照實施例1中步驟三2的方法對待測樣品進行鑒定。結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出：利用本發(fā)明的引物對（上游引物CP6s和下游引物CP6a）對霍山石斛和重唇石斛進行檢測，霍山石斛能夠擴增出片段大小約為275bp的目的條帶。而重唇石斛未擴增出目的條帶。這表明該反應(yīng)體系能將霍山石斛與重唇石斛準確的鑒別出來。將大小約為275bp的目的條帶回收測序，其序列正為序列表中序列3。實施例3、采用實施例1制備的試劑盒鑒定霍山石斛的靈敏度分析待測樣品：霍山石斛（采自于安徽）。通過鑒定，樣品實物與名稱相符，質(zhì)量符合標準。一、從待測樣品中提取基因組DNA分別取約50mg干燥樣品（當(dāng)然也可采用100mg新鮮樣品進行基因組DNA提?。?，用CTAB法提取總DNA。具體操作參見實施例2步驟一。二、PCR擴增將步驟一從霍山石斛中提取的基因組DNA進行倍比稀釋，得到基因組DNA濃度分別為143ng/μl、71ng/μl、36ng/μl、18ng/μl、9ng/μl、4ng/μl和2ng/μl的系列稀釋液，以系列稀釋液分別為模板，采用實施例1步驟一設(shè)計的引物對（上游引物CP6s和下游引物CP6a）進行PCR擴增。具體的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實施例1步驟三1。實驗同時設(shè)置以雙蒸水為模板作為陰性對照。實驗重復(fù)三次。反應(yīng)結(jié)束后，按照實施例1中步驟三2的方法對待測樣品進行鑒定。結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出：利用本發(fā)明的引物對（上游引物CP6s和下游引物CP6a）對霍山石斛進行檢測，當(dāng)模板濃度為36ng/μl時仍能夠檢測到大小約為275bp清晰的目的條帶。將大小約為275bp的目的條帶回收測序，其序列正為序列表中序列3。當(dāng)前第1頁1 2 3