本發(fā)明屬于瓊膠寡糖制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酶解瓊脂糖制備新瓊四糖的方法及其在腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

新瓊寡糖是由瓊脂糖(一種線性多糖，主要來源于江蘺、石花菜、紫菜等紅藻的細(xì)胞壁)降解而得，一般由2-10個單糖組成，以D-半乳糖為還原性末端，具有多種生理活性。新瓊寡糖的制備方法主要有酸解法和酶解法兩種，其中酸解法的應(yīng)用較多，但酸解法存在污染環(huán)境、產(chǎn)物復(fù)雜和反應(yīng)劇烈的缺點，制約了這種方法的大規(guī)模應(yīng)用。酶解法具有酶解過程溫和、環(huán)境友好和產(chǎn)物純度較高等優(yōu)點，為新瓊寡糖的制備開辟了新的方向。

雖然與酸解法相比酶解法具有諸多優(yōu)點，但作為被酶解的底物，瓊脂糖分子量大、碳鏈長度長、溶液黏度高，一定程度上限制了酶與底物的接觸速率，進(jìn)而影響酶解過程的效率。因此，如何提高瓊脂糖的酶解效率是酶解法制備新瓊寡糖的關(guān)鍵技術(shù)。同時，新瓊寡糖的生理活性與其聚合度有很大相關(guān)性，現(xiàn)有的報道都集中于新瓊寡糖混糖的制備和生理活性研究，缺乏單一聚合度新瓊寡糖的制備和功能活性研究。如何制備高純度的單一聚合度新瓊寡糖，并研究其生理活性，對于新瓊寡糖的開發(fā)應(yīng)用具有重要的理論價值和推動作用。、

專利CN201410148086公開了一種降解瓊脂糖生成新瓊四糖的β-瓊膠酶，該β-瓊膠酶為AgWH50B，該β-瓊膠酶單獨轉(zhuǎn)化作用時間較長，轉(zhuǎn)化率低，制備的產(chǎn)品純度不高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種酶解法高效制備新瓊四糖的方法及新瓊四糖的應(yīng)用，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。

一種新瓊四糖的制備方法，按照如下步驟進(jìn)行：

(1)配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3-0.7％的瓊脂糖溶液；

(2)按重量比(0.2-1):100分別加入β-瓊膠酶AgWH50B酶液和β-瓊膠酶AgOGA118酶液，35-45℃溫育6-10h，得到酶解液；

(3)將酶解液于55-65℃減壓濃縮，加入2-5倍體積無水乙醇，于8000-10000rpm，0-8℃低溫離心10-20min，收集上清；

(4)于55-65℃減壓濃縮上清，上清經(jīng)0.35-0.55μm膜過濾后，過分子篩純化，冷凍干燥純化后樣品，得到新瓊四糖純品。

步驟(1)中采用pH 7.0的緩沖液配置瓊脂糖溶液。

所述分子篩為Bio-Gel P2柱。

步驟(4)過分子篩純化后，經(jīng)過TLC(薄層色譜)檢測，純度達(dá)到90％再進(jìn)行冷凍干燥純化。

上述制備的新瓊四糖在恢復(fù)哺乳動物腸道菌群結(jié)構(gòu)及腸道有益菌增殖方面的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，所述新瓊四糖在恢復(fù)哺乳動物腸道菌群結(jié)構(gòu)及腸道有益菌增殖方面的應(yīng)用，其所述新瓊四糖促進(jìn)腸道中雙歧桿菌，乳桿菌，厚壁菌和擬桿菌的增殖。

進(jìn)一步的，所述新瓊四糖在恢復(fù)哺乳動物腸道菌群結(jié)構(gòu)及腸道有益菌增殖方面的應(yīng)用，其所述新瓊四糖可改善小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明利用β-瓊膠酶AgWH50B和β-瓊膠酶AgOGA118的協(xié)同酶解作用，水解瓊脂糖制備新瓊四糖，酶解效率好、產(chǎn)物純度高。同時，通過小鼠腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)作用研究發(fā)現(xiàn)，與新瓊混糖相比，新瓊四糖的腸道微生物調(diào)節(jié)和恢復(fù)能力最強。本發(fā)明可實現(xiàn)高純度新瓊四糖的高效制備，且制備的新瓊四糖具有很好的腸道菌群調(diào)節(jié)能力，為以新瓊四糖為原料開發(fā)功能性食品和保健品提供了理論和技術(shù)支持，具有良好的應(yīng)用潛力和前景。

附圖說明

圖1酶解產(chǎn)物新瓊四糖的TLC分析。

圖2各實驗組小鼠糞便總菌數(shù)量圖。

圖3各實驗組小鼠糞便雙歧桿菌數(shù)量圖。

圖4各實驗組小鼠糞便乳桿菌數(shù)量圖。

圖5各實驗組小鼠糞便厚壁菌數(shù)量圖。

圖6各實驗組小鼠糞便擬桿菌數(shù)量圖。

圖7小鼠腸道菌群DGGE電泳圖。

圖8 DGGE電泳圖譜虛擬圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

以下實施例利用兩種β-瓊膠酶協(xié)同催化瓊脂糖制備新瓊四糖，并對新瓊四糖純品的腸道菌群調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了評價。實施例中使用的β-瓊膠酶AgWH50B和β-瓊膠酶AgOGA118基因可以從淡黃色噬瓊膠菌WH0801(NRRL B-59247(T)或CGMCC 1.10131(T))中克隆得到，也可以根據(jù)編碼兩種酶基因的核酸序列通過基因合成獲得。

實施例1：AgWH50B酶液的制備

根據(jù)AgWH50B序列使用引物5’-CCGGAATTCATGACATTTACTAAAAGC-3’和5’-CGAGCTCTTTTTTTTGTAACGCAG-3’，以淡黃色噬瓊膠菌WH0801為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的AgWH50B基因連接至pET21a載體，構(gòu)建AgWH50B表達(dá)載體pET50B。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組大腸桿菌PET50B/BL21。將重組大腸桿菌在5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中20℃培養(yǎng)36h，培養(yǎng)完畢離心收集菌體。利用pH 7.0緩沖液重懸菌體，超聲破碎，離心取上清，得到AgWH50B酶液。

實施例2：AgOGA118酶液的制備

根據(jù)AgOGA118序列使用引物5’-CGGAATTCATGTTAAAGCGCCACC-3’和5’-CCCTCGAGTTGGCAAGTATAACCTGAC-3’，以淡黃色噬瓊膠菌WH0801為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的AgOGA118基因連接至pET21a載體，構(gòu)建AgOGA118表達(dá)載體pET118。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組大腸桿菌PET118/BL21。將重組大腸桿菌在5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中20℃培養(yǎng)36h，培養(yǎng)完畢離心收集菌體。利用pH 7.0緩沖液重懸菌體，超聲破碎，離心取上清，得到AgOGA118酶液。

實施例3：AgWH50B酶解瓊脂糖

使用pH 7.0的緩沖液配置0.5％的瓊脂糖溶液，按重量比1:100加入AgWH50B酶液，混合均勻后于40℃溫育8h進(jìn)行酶解反應(yīng)。酶解結(jié)束后將酶解液于60℃減壓濃縮，濃縮液加入3倍體積無水乙醇，于9000rpm，4℃低溫離心15min，收集上清。于60℃減壓濃縮上清，上清經(jīng)0.45μm膜過濾后，過Bio-Gel P2柱純化，TLC檢測，冷凍干燥純化后樣品，得到新瓊四糖純品。經(jīng)計算所得新瓊四糖純度為96％，底物轉(zhuǎn)化率為52％。

實施例4：AgWH50B酶解瓊脂糖

使用pH 7.0的緩沖液配置0.5％的瓊脂糖溶液，按重量比1:100加入AgWH50B酶液，按重量比1:1000加入黑曜石粉末，混合均勻后于40℃溫育8h進(jìn)行酶解反應(yīng)。酶解結(jié)束后將酶解液于60℃減壓濃縮，濃縮液加入3倍體積無水乙醇，于9000rpm，4℃低溫離心15min，收集上清。于60℃減壓濃縮上清，上清經(jīng)0.45μm膜過濾后，過Bio-Gel P2柱純化，TLC檢測，冷凍干燥純化后樣品，得到新瓊四糖純品。經(jīng)計算所得新瓊四糖純度為97％，底物轉(zhuǎn)化率為88％。

實施例5：AgWH50B酶解瓊脂糖

使用pH 7.0的緩沖液配置0.5％的瓊脂糖溶液，按重量比1:100加入AgWH50B酶液，混合均勻后于40℃溫育24h進(jìn)行酶解反應(yīng)。酶解結(jié)束后將酶解液于60℃減壓濃縮，濃縮液加入3倍體積無水乙醇，于9000rpm，4℃低溫離心15min，收集上清。于60℃減壓濃縮上清，上清經(jīng)0.45μm膜過濾后，過Bio-Gel P2柱純化，TLC檢測，冷凍干燥純化后樣品，得到新瓊四糖純品。經(jīng)計算所得新瓊四糖純度為96％，底物轉(zhuǎn)化率為71％。

實施例6：AgWH50B酶解瓊脂糖

使用pH 7.0的緩沖液配置0.5％的瓊脂糖溶液，按重量比1:100加入AgWH50B酶液，按重量比1:1000加入黑曜石粉末，混合均勻后于40℃溫育24h進(jìn)行酶解反應(yīng)。酶解結(jié)束后將酶解液于60℃減壓濃縮，濃縮液加入3倍體積無水乙醇，于9000rpm，4℃低溫離心15min，收集上清。于60℃減壓濃縮上清，上清經(jīng)0.45μm膜過濾后，過Bio-Gel P2柱純化，TLC檢測，冷凍干燥純化后樣品，得到新瓊四糖純品。經(jīng)計算所得新瓊四糖純度為96％，底物轉(zhuǎn)化率為91％。

實施例7：AgOGA118酶解瓊脂糖

使用pH 7.0的緩沖液配置0.5％的瓊脂糖溶液，按重量比1:100加入AgOGA118酶液，混合均勻后于40℃溫育8h進(jìn)行酶解反應(yīng)。酶解結(jié)束后將酶解液于60℃減壓濃縮，濃縮液加入3倍體積無水乙醇，于9000rpm，4℃低溫離心15min，收集上清。于60℃減壓濃縮上清，上清經(jīng)0.45μm膜過濾后，過Bio-Gel P2柱純化，TLC檢測，冷凍干燥純化后樣品，得到新瓊八糖和新瓊十糖混糖。

實施例8：AgOGA118酶解瓊脂糖

使用pH 7.0的緩沖液配置0.5％的瓊脂糖溶液，按重量比1:100加入AgOGA118酶液，按重量比1:1000加入黑曜石粉末，混合均勻后于40℃溫育8h進(jìn)行酶解反應(yīng)。酶解結(jié)束后將酶解液于60℃減壓濃縮，濃縮液加入3倍體積無水乙醇，于9000rpm，4℃低溫離心15min，收集上清。于60℃減壓濃縮上清，上清經(jīng)0.45μm膜過濾后，過Bio-Gel P2柱純化，TLC檢測，冷凍干燥純化后樣品，得到新瓊四糖純品。經(jīng)計算所得新瓊四糖純度為91％，底物轉(zhuǎn)化率為80％。

實施例9：AgWH50B與AgOGA118協(xié)同酶解瓊脂糖

使用pH 7.0的緩沖液配置0.5％的瓊脂糖溶液，按重量比0.5:100分別加入AgWH50B與AgOGA118酶液，混合均勻后于40℃溫育8h進(jìn)行酶解反應(yīng)。酶解結(jié)束后將酶解液于60℃減壓濃縮，濃縮液加入3倍體積無水乙醇，于9000rpm，4℃低溫離心15min，收集上清。于60℃減壓濃縮上清，上清經(jīng)0.45μm膜過濾后，過Bio-Gel P2柱純化，TLC檢測，冷凍干燥純化后樣品，得到新瓊四糖純品，樣品的TLC檢測結(jié)果如圖1所示，經(jīng)計算所得新瓊四糖純度為96％，底物轉(zhuǎn)化率為93％。

實施例10：AgWH50B與AgOGA118協(xié)同酶解瓊脂糖

使用pH 7.0的緩沖液配置0.5％的瓊脂糖溶液，按重量比0.5:100分別加入AgWH50B與AgOGA118酶液，按重量比1:1000加入黑曜石粉末，混合均勻后于40℃溫育8h進(jìn)行酶解反應(yīng)。酶解結(jié)束后將酶解液于60℃減壓濃縮，濃縮液加入3倍體積無水乙醇，于9000rpm，4℃低溫離心15min，收集上清。于60℃減壓濃縮上清，上清經(jīng)0.45μm膜過濾后，過Bio-Gel P2柱純化，TLC檢測，冷凍干燥純化后樣品，得到新瓊四糖純品，經(jīng)計算所得新瓊四糖純度為98％，底物轉(zhuǎn)化率為99％。

實施例11：AgWH50B與AgOGA118協(xié)同酶解瓊脂糖

使用pH 7.0的緩沖液配置0.5％的瓊脂糖溶液，按重量比0.5:100分別加入AgWH50B與AgOGA118酶液，按重量比1:1000加入馬唐提取物，混合均勻后于40℃溫育8h進(jìn)行酶解反應(yīng)。酶解結(jié)束后將酶解液于60℃減壓濃縮，濃縮液加入3倍體積無水乙醇，于9000rpm，4℃低溫離心15min，收集上清。于60℃減壓濃縮上清，上清經(jīng)0.45μm膜過濾后，過Bio-Gel P2柱純化，TLC檢測，冷凍干燥純化后樣品，得到新瓊四糖純品，經(jīng)計算所得新瓊四糖純度為98％，底物轉(zhuǎn)化率為99％。

上述馬唐提取物的提取方法為：將馬唐的莖葉曬干，磨成粉末，加3-5倍重量份數(shù)的70％乙醇溶液回流提取3次，合并濾液蒸干制成。

實施例12：小鼠腸道微生物調(diào)節(jié)實驗分組

將購買的Balb/c實驗小鼠暫養(yǎng)一周，以適應(yīng)新環(huán)境。在保持各組小鼠平均體重相近的前提下，隨機(jī)將40只小鼠分為5組：正常組(NC)、自然恢復(fù)組(NR)、陽性對照組(FOS)、混糖組(NAOS)和四糖組(NAT)。其中，建模完成以后，陽性對照組給予低聚果糖灌胃，混糖組給予新瓊八糖和新瓊十糖混合物灌胃，四糖組給予新瓊四糖灌胃，正常組與自然恢復(fù)組給予等量生理鹽水灌胃。小鼠被放置于動物房的小鼠籠內(nèi)飼養(yǎng)，動物房室溫介于20至25℃，每天提供12h光照，使用棒狀飼料投喂，飲用水為蒸餾水。

實施例13：小鼠腸道微生態(tài)失調(diào)模型

適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，對除正常組(NC)以外的剩余四組進(jìn)行頭孢曲松鈉灌胃操作，頭孢曲松鈉濃度為125mg/mL，每只小鼠灌胃量為0.2mL/每次，每次灌胃操作間隔至少6h。正常組進(jìn)行等量生理鹽水灌胃，每天灌胃2次，持續(xù)8天，以構(gòu)建小鼠腸道菌群失調(diào)模型。

實施例14：新瓊四糖調(diào)節(jié)腸道菌群作用檢測樣品制備

建模成功后，開始使用新瓊四糖、新瓊混糖、低聚果糖等進(jìn)行灌胃。其中，正常組(NC)和自然恢復(fù)組(NR)灌胃試劑為生理鹽水，陽性對照組(FOS)灌胃試劑為低聚果糖(灌胃劑量為150mg/kg)，混糖組(NAOS)給予新瓊八糖和新瓊十糖的混合試劑(灌胃劑量為150mg/kg)，四糖組給予新瓊四糖灌胃(灌胃劑量為150mg/kg)。每天進(jìn)行灌胃操作1次，持續(xù)14天。在14天時準(zhǔn)確稱取0.1g小鼠糞便，加入1mL 0.01mol/L PBS，用移液器無菌槍頭搗碎后漩渦震蕩混勻?；靹蚝髽悠酚谑覝叵逻M(jìn)行離心，條件為1500rpm、5min。收集上清液，進(jìn)行高速離心，條件為室溫10000rpm離心3min，收集菌體沉淀，盡量棄去上清。取沉淀用1mL 0.01mol/L PBS溶液洗滌2次，1mL無菌水洗滌1次，室溫下再次進(jìn)行離心(10000rpm、3min)，棄上清液，獲得最終菌體沉淀。

實施例15：新瓊四糖調(diào)節(jié)腸道菌群作用的RT-PCR分析

提取菌體沉淀中的DNA，根據(jù)腸道微生物的特征菌群雙歧桿菌、乳桿菌、厚壁菌和擬桿菌DNA特征序列設(shè)計引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。同時，使用DGGE方法分析常見腸道益生菌種類的變化。其中各實驗組腸道微生物的特征菌群變化和總菌數(shù)變化結(jié)果如圖2-圖6所示。根據(jù)檢測結(jié)果可知，在總菌數(shù)方面，各實驗組較自然恢復(fù)組，總菌數(shù)均有明顯提升，其中低聚果糖及新瓊四糖效果最為顯著。證明新瓊寡糖對腸道益生菌有增殖作用，其中新瓊四糖增殖效果優(yōu)于新瓊混糖。在益生菌量檢測方面，新瓊四糖對雙歧桿菌、乳桿菌、厚壁菌和擬桿菌的增殖都很好的促進(jìn)作用，且新瓊四糖的促進(jìn)效果優(yōu)于新瓊混糖。

實施例16：新瓊四糖調(diào)節(jié)腸道菌群作用的DGGE分析

提取菌體沉淀中的DNA，使用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的基因片段，并進(jìn)行電泳確定擴(kuò)增成功后用于DGGE分析，分析結(jié)果如圖7和圖8所示。與正常組相比，各組菌群條帶均發(fā)生一定的位移。而與模型組相比，混糖組和四糖組條帶數(shù)量與組成也有一定的差異，但仍與模型組比較相似，其中四糖組有向正常組恢復(fù)的趨勢。以上結(jié)果提示，添加低聚果糖、新瓊寡糖尤其是新瓊四糖可以在一定程度上改善小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明可以通過酶解法高效制備新瓊四糖，且制備的新瓊四糖具有較好的調(diào)節(jié)腸道菌群作用，這些特點使本專利技術(shù)及產(chǎn)品在功能食品和保健品領(lǐng)域具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。