技術(shù)特征：

1.一種DLO Hi-C染色體構(gòu)象捕獲方法，其特征在于：

1)將目的細(xì)胞離心，然后用EGS和甲醛水溶液對目的細(xì)胞進行雙交聯(lián)，終止交聯(lián)反應(yīng)，離心分離溶解得到兩管細(xì)胞；

2)分別對步驟1)得到兩管細(xì)胞進行裂解，提取得到基因組-蛋白復(fù)合物A和基因組-蛋白復(fù)合物B；

3)選取一種限制性內(nèi)切酶分別對兩管基因組-蛋白復(fù)合物A和基因組-蛋白復(fù)合物B進行酶切消化，得到酶切產(chǎn)物A和酶切產(chǎn)物B；

4)將酶切產(chǎn)物A和酶切產(chǎn)物B與對應(yīng)的雙鏈核苷酸序列LinkerA和雙鏈核苷酸序列LinkerB連接，將LinkerA和LinkeB分別連到酶切產(chǎn)物A和酶切產(chǎn)物B的-內(nèi)切酶粘性末端上；離心分離得到酶連產(chǎn)物A和酶連產(chǎn)物B；其中，雙鏈核苷酸序列LinkerA和雙鏈核苷酸序列LinkerB上均含有內(nèi)切酶酶切位點，且內(nèi)切酶酶切位點的識別位點和切割位點不在同一位點上；

5)將酶連產(chǎn)物A和酶連產(chǎn)物B離心沉淀混合懸浮于500μl的ddH₂O中，來回吹打溶解，得到DNA-蛋白復(fù)合物；

6)向DNA-蛋白復(fù)合物中加入T4DNA ligase buffer、Triton X-100、低熔點瓊脂糖和T4DNA連接酶，待管內(nèi)瓊脂糖凝固后酶連反應(yīng)8～10h，酶連反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于水浴鍋中將低熔點瓊脂糖融化，再加入瓊脂糖酶消化瓊脂糖；濃縮至1ml，再加入SDS水溶液和蛋白酶K消化蛋白解交聯(lián)，消化結(jié)束后酚仿抽提DNA，將提取的DNA溶于ddH₂O中，測定濃度，得到的DNA即為DLO Hi-C總DNA；

7)將DLO Hi-C總DNA用識別位點和切割位點不在同一位點的內(nèi)切酶進行酶切；酶切反應(yīng)結(jié)束后，點樣于非變性page膠中跑膠分離酶切釋放出來長度為70～90bp的DLO Hi-C DNA fragment；切膠回收得到跑膠結(jié)束后用gel-red染色，并在紫外下切膠回收長度為70～90bp的DLO Hi-C DNA fragment；

8)在DLO Hi-C DNA fragment片段上連接高通量測序的測序接頭，得到DLO Hi-C PCR模板；

9)根據(jù)DLO Hi-C PCR模板設(shè)計高通量測序引物對，擴增回收即得到DLO Hi-C library；

10)將DLO Hi-C library進行高通量測序，分析目的細(xì)胞中基因組的三維結(jié)果。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述DLO Hi-C染色體構(gòu)象捕獲方法，其特征在于：所述步驟1)中，甲醛水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1～3％，所述終止劑為甘氨酸，所述溶解所用的溶劑為1×的NEBuffer2.1，兩管細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目均為3×10⁶～8×10⁶個。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述DLO Hi-C染色體構(gòu)象捕獲方法，其特征在于：所述步驟2)中，加入終濃度為1％的SDS，室溫裂解細(xì)胞及細(xì)胞核20min，待溶液變粘稠后，加入1×NEBuffer2.1致終體積為500μl，混合均勻，再加入終濃度為2％的Triton X-100中和SDS；

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述DLO Hi-C染色體構(gòu)象捕獲方法，其特征在于：所述步驟3)中，限制性內(nèi)切酶為NotI、HindIII、BgII、ClaI、NheI、NdeI、MspI、MboI和XbaI中任意一種；酶切體系為：

基因組-蛋白復(fù)合物A或基因組-蛋白復(fù)合物B100-200μl酶切Buffer50μl限制性內(nèi)切酶(NEB 100U/μl)15μl水補充至500μl

酶切條件為，震蕩酶切6-8h。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述DLO Hi-C染色體構(gòu)象捕獲方法，其特征在于：所述步驟4)中，所述雙鏈核苷酸序列Linker A和雙鏈核苷酸序列Linker B上均含有內(nèi)切酶酶切位點為MmeI、Ecop15i、BseRI、BpuEI、BpmI、BsgI、EciI和NmeAIII中任意一種。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述DLO Hi-C染色體構(gòu)象捕獲方法，其特征在于：所述步驟4)中，所述雙鏈核苷酸序列LinkerA和雙鏈核苷酸序列LinkerB如下所述：

酶連體系如下：

酶切產(chǎn)物A/酶切產(chǎn)物B500μl酶切Buffer50μlDTT(1M)1.5μlATP(100mM)10μl限制性內(nèi)切酶(NEB 100U/μl)10μlT7DNA連接酶5μlLinkerA/LinkerB(800ng/μl)200μlddH₂O補充至1ml合計1ml

酶連反應(yīng)如下：20℃1.5h。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述DLO Hi-C染色體構(gòu)象捕獲方法，其特征在于：所述步驟5)中，SDS水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％，DNA-蛋白復(fù)合物中SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述DLO Hi-C染色體構(gòu)象捕獲方法，其特征在于：所述步驟6)中，

酶連體系如下：

將上述含有酶切體系的離心管置于冰上20ml，待管內(nèi)瓊脂糖凝固后，將離心管置于20℃酶連反應(yīng)8-10h。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述DLO Hi-C染色體構(gòu)象捕獲方法，其特征在于：所述步驟8)中，高通量測序的測序接頭命名為Illumina sequence adapter，其序列為：

PE-adaPter1

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNN

TGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGA

PE-adapter2

GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

NNCTAGCCTTCTCGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTG

連接體系如下：

置于16℃酶連反應(yīng)2～3h。