本發(fā)明涉及一種用于卡拉白魚養(yǎng)殖的復合微生態(tài)制劑的制備，具體是由啤酒酵母、凝結芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌制成復合微生態(tài)制劑，以及將其應用于卡拉白魚的養(yǎng)殖。

背景技術：

卡拉白魚(Chalcalburnus chalcoides Aralensis)主要分布于黑海、咸海和里海水域以及與之相連的水系，隸屬于鯉科、雅羅魚亞科、卡拉白魚屬，在國外為瀕危野生種，2001年引入我國?？ɡ佐~具有耐鹽堿、適應性強、食性廣、味道鮮美等優(yōu)點，是一種有較高營養(yǎng)價值的小型經濟魚類，有很好的市場前景。

近年來，水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展越來越迅速，集約化高密度養(yǎng)殖的發(fā)展導致水體的生態(tài)環(huán)境遭到破壞，水產動物病害以及水產動物間的病原體交叉感染愈演愈烈。而目前控制病害的主要手段依然是使用抗生素類藥物，長期大量使用抗生素類藥物不僅會導致水產動物免疫力下降，增加病原菌耐藥性，破壞養(yǎng)殖水體的正常的微生態(tài)環(huán)境，以及引發(fā)二次感染或繼發(fā)性感染，還會造成抗生素在魚體中殘留、富集，進而對人類健康構成威脅。正是因為抗生素類藥物的這些危害，目前世界各國陸續(xù)禁用或者限制了抗生素類藥物的使用。未來有望徹底禁止抗生素類藥物在水產養(yǎng)殖業(yè)中的大量使用，由此催生出了無殘留、無毒副作用、綠色安全的微生態(tài)制劑飼料添加劑。

微生態(tài)制劑是一種通過改善動物周圍的或與其相關的微生物群落結構，以此增加飼料的利用率，增強動物對疾病的應答能力以及改善其周圍環(huán)境的活菌制劑。作為抗生素的替代品，微生態(tài)制劑的安全范圍比較大，在養(yǎng)殖動物中長期使用不會產生毒副作用和抗藥性。目前市場上有多種多樣的微生態(tài)制劑，但它們作為飼料添加劑還達不到人們的預期效果，這是由于不同種類的養(yǎng)殖動物所需要益生菌的種類、數(shù)量和配比各不相同，導致它們在養(yǎng)殖動物體內不能很好地協(xié)同作用，從而影響了其作為飼料添加劑應有的效果。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要是提供一種由特定配比的三種微生物活菌體所組成的復合微生態(tài)制劑及其制備方法，并將該微生態(tài)制劑應用于一齡卡拉白魚的養(yǎng)殖中，可促進卡拉白魚的生長，凈化養(yǎng)殖水體的水質。

本發(fā)明以養(yǎng)殖池塘底泥為樣品，在實驗室進行處理后，運用平板涂布法，將稀釋后的樣品涂布相應的分離培養(yǎng)基平板，然后把涂布后的分離培養(yǎng)基放置于相應溫度的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)一段時間后根據(jù)各個目的菌株的形態(tài)特征挑取相應的菌株，在培養(yǎng)基平板上進行劃線純化。待得到純菌株后根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》第八版、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《真菌鑒定手冊》進行生理生化特征鑒定，以及根據(jù)16S rDNA基因或ITS區(qū)基因進行分子鑒定以確定目標菌株。

本發(fā)明所分離純化的啤酒酵母菌、凝結芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌已證明無毒性，所分離菌株經過發(fā)酵之后，進行菌落計數(shù)，啤酒酵母菌的活菌數(shù)大于3.5×10⁹cfu/mL，凝結芽孢桿菌活菌數(shù)大于8.3×10⁹cfu/mL ，沼澤紅假單胞菌活菌數(shù)大于1.7×10⁹cfu/mL，將其按特定比例混合后即可用于卡拉白魚養(yǎng)殖中。

本發(fā)明的技術解決方案

一種卡拉白魚養(yǎng)殖用復合微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于包括以下制備步驟：

一、啤酒酵母菌的分離純化和鑒定

1. 啤酒酵母菌的分離純化

a．采取池塘底泥，放置于無菌離心管中，帶回實驗室4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

b．取10g采取的樣品放入裝有90mL無菌水的錐形瓶中，振蕩混勻，用無菌水將樣品溶液進行梯度稀釋，即在無菌條件下用吸管吸取1mL樣品溶液，加入到裝有9mL無菌水的離心管中，充分混勻，將樣品稀釋為10^-1，然后吸取1mL稀釋的樣品加入到另一裝有9mL無菌水的離心管中，稀釋成10^-2，按此種方法依次稀釋至10^-6；

c．取稀釋濃度為10^-4、10^-5和10^-6的樣品溶液涂布PDA培養(yǎng)基平板，倒置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~5天。待菌落長出后，挑選個體較大，表面光滑濕潤，呈凸起狀，中間略有凹陷的單菌落，在PDA培養(yǎng)基平板上反復劃線純化，直至得到純培養(yǎng)物，保存于甘油管和牛奶管；

2. 菌株的生理生化鑒定

根據(jù)《真菌鑒定手冊》進行菌株的生理生化性質測定，將鑒定結果與《真菌鑒定手冊》上所述啤酒酵母菌的生理生化特征相對照；

3. ITS區(qū)基因序列鑒定

用機械破碎法提取菌株基因組DNA，以真菌通用引物ITS1和ITS4為引物，基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到500~600bp的特異性條帶，將擴增的PCR產物送去生工進行DNA測序，將所得到的序列導入NCBI中的BLAST軟件或EzTaxon server進行序列比對。

二、凝結芽孢桿菌的分離純化和鑒定

1. 凝結芽孢桿菌的分離純化

a．采取池塘底泥，放置于無菌離心管中，帶回實驗室4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

b．取采集的樣品10g，放入已滅菌的裝有90ml蒸餾水和小玻璃珠的250mL三角瓶中，振蕩混勻后將三角瓶放置于80℃水浴鍋中，加熱20分鐘后靜置冷卻至室溫，用無菌水將冷卻后的樣品溶液進行梯度稀釋至10^-7；

c．取稀釋濃度為10^-5、10^-6、10^-7的樣品溶液涂布MRS固體培養(yǎng)基平板，倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，待菌落長出后，挑取菌體淡黃色，不透明，呈圓形、凸起、扁平狀的單菌落利用MRS培養(yǎng)基進行純化，將純培養(yǎng)物以點接法接種于含溴甲酚紫指示劑的YPD培養(yǎng)基，篩選其中的具有產酸能力的芽孢桿菌，37℃培養(yǎng)兩天后選取其中一株產生透明圈較大的菌株，保存于甘油管和牛奶管中；

2. 菌株的生理生化鑒定

根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對挑選的菌株進行生理生化特征鑒定，將生理生化鑒定結果與《伯杰細菌鑒定手冊》第八版上關于芽孢桿菌屬的描述相對照；

3. 16S rDNA序列鑒定

使用酶解法和SDS-高鹽法相結合提取菌株的基因組DNA序列，以細菌和放線菌的通用引物PA、PB為引物，基因組DNA為模板，擴增16SrDNA片段，得到1400~1500bp的特異性片段，將擴增的PCR產物送去生工進行DNA測序，將所得到的序列導入NCBI中的BLAST軟件或EzTaxon server進行序列比對。

三、沼澤紅假單胞菌的分離純化和鑒定

1. 沼澤紅假單胞菌的分離純化

a．采取池塘底泥，放置于無菌離心管中，帶回實驗室4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

b．取采集的底泥樣品20g，放入滅菌的500ml錐形瓶中，添加富集培養(yǎng)基至離瓶口2~3cm，然后將錐形瓶用橡膠塞和塑料膜密封營造厭氧環(huán)境，再將其放置于裝有60W白熾燈的不透明紙箱中，調節(jié)距離，使培養(yǎng)基接受的光照強度為2000~4000lx，溫度為30℃，在此條件下培養(yǎng)一周，取富集液按20%濃度再連續(xù)轉接富集兩次；

c．取步驟b富集三次后的富集液進行梯度稀釋至10^-8；

d．取10^-6、10^-7和10^-8稀釋液涂布光合細菌分離培養(yǎng)基平板，以無菌瓊脂溶液覆蓋到涂布后的分離培養(yǎng)基上，制造厭氧環(huán)境，然后將覆蓋瓊脂后的平板放置于光照強度為2000~4000lx，溫度為30℃的環(huán)境下培養(yǎng)一周，待菌落長出后，挑選淺紅色、光滑濕潤、邊緣整齊、中間有隆起的菌落，在分離培養(yǎng)基平板上劃線純化，直至得到純培養(yǎng)物，保存于甘油管和牛奶管。

2. 菌株的生理生化鑒定

根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對所分離菌株進行生理生化特征鑒定，生理生化鑒定結果與《伯杰細菌鑒定手冊》第八版上關于光合細菌的描述相對照；

3. 16SrDNA序列鑒定

采用酶解法和SDS-高鹽法相結合提取菌株的基因組DNA序列，以細菌和放線菌的通用引物PA、PB為引物，基因組DNA為模板，擴增16SrDNA片段，得到1400~1500bp的特異性片段。將擴增的PCR產物送去生工進行DNA序列的測定，將所得到的序列導入NCBI中的BLAST軟件或EzTaxon server進行序列比對。

四、復合微生態(tài)制劑發(fā)酵液的制備

1．啤酒酵母菌發(fā)酵液的制備

a．菌種活化：將保存的啤酒酵母菌菌種劃線接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)3天，在平板上形成啤酒酵母菌單菌落。

b．一級種子液制備：制備100mL PDA液體培養(yǎng)基，裝入300mL錐形瓶中，滅菌；挑取步驟a活化的啤酒酵母菌單菌落接種于PDA液體培養(yǎng)基中，放入28℃搖床中，180rpm培養(yǎng)3天，即為一級種子液。

c．發(fā)酵液的制備：制備500mL PDA液體培養(yǎng)基，裝入1L錐形瓶中，滅菌；吸取10mL步驟b培養(yǎng)的啤酒酵母菌一級種子液，轉接到500mL PDA液體培養(yǎng)基中，放入28℃搖床中，180rpm培養(yǎng)3~5天，制得啤酒酵母菌發(fā)酵液，啤酒酵母菌發(fā)酵液中活菌數(shù)達到10⁹cfu/mL以上。

2．凝結芽孢桿菌發(fā)酵液的制備

a．菌種活化：將保存的凝結芽孢桿菌菌種劃線接種于MRS培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)2天，在平板上形成凝結芽孢桿菌單菌落。

b．一級種子液制備：制備100mL MRS液體培養(yǎng)基，裝入300mL錐形瓶中，滅菌；挑取步驟a活化的凝結芽孢桿菌單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，放入37℃搖床中，180rpm培養(yǎng)2天，即為一級種子液。

c．發(fā)酵液的制備：制備500mL MRS液體培養(yǎng)基，裝入1L錐形瓶中，滅菌；吸取10mL步驟b培養(yǎng)的凝結芽孢桿菌一級種子液，轉接到制備的500mL MRS液體培養(yǎng)基中，放入37℃搖床中，180rpm培養(yǎng)2~3天，制得凝結芽孢桿菌發(fā)酵液，凝結芽孢桿菌發(fā)酵液中活菌數(shù)達到10⁹cfu/mL以上。

3．沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液的制備

a．菌種活化：將保存的沼澤紅假單胞菌菌種劃線接種于光合細菌分離培養(yǎng)基平板上，上層覆蓋瓊脂，放置于光照強度2000~4000lx，溫度30℃的環(huán)境下培養(yǎng)一周，在平板上形成凝結芽孢桿菌單菌落。

b．一級種子液制備：制備400mL 光合細菌液體培養(yǎng)基，高壓滅菌后裝入300mL無菌錐形瓶中，使培養(yǎng)基離錐形瓶口大約2~3cm，用橡膠塞和塑料膜密封；挑取步驟a活化的沼澤紅假單胞菌單菌落接種于光合細菌液體培養(yǎng)基中，放置于光照強度2000~4000lx，溫度30℃的環(huán)境下培養(yǎng)一周，即為一級種子液。

c．發(fā)酵液的制備：制備1.2L 光合細菌液體培養(yǎng)基，高壓滅菌后裝入1L無菌錐形瓶中，使培養(yǎng)基離錐形瓶口大約2~3cm，用橡膠塞和塑料膜密封；吸取50mL步驟b培養(yǎng)的沼澤紅假單胞菌一級種子液，轉接到制備的光合細菌液體培養(yǎng)基中，放置于光照強度2000~4000lx，溫度30℃的環(huán)境下培養(yǎng)7~10天，制得沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液，沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液中活菌數(shù)達到10⁹cfu/mL以上。

4．微生態(tài)制劑發(fā)酵液的制備：將所述啤酒酵母菌發(fā)酵液、凝結芽孢桿菌發(fā)酵液、沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液按照體積比1:0.7~1:3.5~4.5混合，即得到所述微生態(tài)制劑，確保其中啤酒酵母菌活菌數(shù)占總菌數(shù)的百分比為20%~30%，凝結芽孢桿菌活菌數(shù)占總菌數(shù)的百分比為30%~40%，沼澤紅假單胞菌占總菌數(shù)百分比為30%~40%。

一種卡拉白魚養(yǎng)殖用復合微生態(tài)制劑的應用，其特征在于：

將1齡卡拉白魚150~200尾置于長4~6m，寬4~6m，深2~2.5m的水泥池中，采取常規(guī)飼料喂養(yǎng)，每天9:00、13:00和18:00向水泥池中各投喂一次飼料，喂養(yǎng)時間為30天，所述飼料中添加復合微生態(tài)制劑發(fā)酵液，每100kg飼料用噴霧器噴灑1~1.5L復合微生態(tài)制劑發(fā)酵液。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過將啤酒酵母菌、凝結芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌按特定比例混合而制成，將其用于卡拉白魚成魚養(yǎng)殖，既能分解養(yǎng)殖水體中的殘餌和動物排泄物，降低水體的氨氮、亞硝態(tài)氮和COD_Mn的含量，增加溶氧量，達到凈化水質的效果；又能改善養(yǎng)殖卡拉白魚腸道微生物菌群，進而增強魚體內消化酶的活性，提高飼料利用率，促進生長。

具體實施方式

以下結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。

實施例

一：啤酒酵母菌的分離純化和鑒定

1．啤酒酵母菌的分離純化

a．采取池塘底泥，放置于無菌離心管中，帶回實驗室4℃保存?zhèn)溆?

b．取10g采取的樣品放入裝有90mL無菌水的錐形瓶中，振蕩混勻，用無菌水將樣品溶液進行梯度稀釋至10^-6；

c．取稀釋濃度為10^-4、10^-5和10^-6樣品溶液涂布PDA培養(yǎng)基平板， 28℃培養(yǎng)3~5天，挑選體積較大，表面光滑濕潤，呈凸起狀，中間略有凹陷的單菌落，在PDA培養(yǎng)基平板上反復劃線純化，直至得到純培養(yǎng)物，保存于甘油管和牛奶管；

2．菌株的生理生化鑒定

根據(jù)《真菌鑒定手冊》進行菌株的生理生化性質測定，結果如表1所示。

注：“+”表示可利用，“—”表示不可利用。

3.ITS區(qū)基因序列鑒定

用機械破碎法提取菌株基因組DNA，以真菌通用引物ITS1和ITS4為引物，基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到600bp左右的特異性條帶，將擴增的PCR產物送去生工進行DNA測序。將所得序列導入NCBI中的BLAST軟件或EzTaxon server進行序列比對，結果顯示菌株與Saccharomyces cerevisiae Hansen的序列相似性達到100%，根據(jù)菌株的生理生化鑒定結果以及ITS區(qū)基因測序結果可以判定所分離菌株即是啤酒酵母菌。

二：凝結芽孢桿菌的分離純化和鑒定

1. 凝結芽孢桿菌的分離純化

a．取采集的樣品10g，放入已滅菌的裝有90ml蒸餾水和小玻璃珠的250mL三角瓶中，振蕩混勻后將三角瓶放置于80℃水浴鍋中，加熱20分鐘后靜置冷卻，用無菌水將樣品溶液梯度稀釋至10^-7；

b．取稀釋濃度為10^-5、10^-6和10^-7的樣品溶液涂布MRS培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)1~2天，挑取淡黃色、不透明，表面呈圓形、凸起、扁平狀的單菌落進行純化，將純培養(yǎng)物以點接法接種于含溴甲酚紫指示劑的YPD培養(yǎng)基，篩選其中的具有產酸能力的芽孢桿菌，37℃培養(yǎng)1~2天后選取其中一株產生透明圈較大的菌株保存于甘油管和牛奶管。

2. 菌株的生理生化鑒定

根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對挑選的菌株進行生理生化特征鑒定，結果如表2所示，將生理生化鑒定結果與《伯杰細菌鑒定手冊》第八版上關于芽孢桿菌屬的描述相對照，以及參照其可產酸的特性，可以初步判定所分離純化的菌株是凝結芽孢桿菌。

3.16S rDNA序列鑒定

使用酶解法和SDS-高鹽法相結合提取菌株的基因組DNA序列，以細菌和放線菌的通用引物PA、PB為引物，基因組DNA為模板，擴增16S rDNA片段，得到1500bp左右的特異性片段。將所得序列導入NCBI中的BLAST軟件或EzTaxon server進行序列比對，結果與Bacillus coagulans的序列相似性達到99%，因此結合菌落形態(tài)、生理生化特征以及16S rDNA序列比對結果，可以確定所驗證的菌株為凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。

注：“+”表示陽性，“－”表示陰性。

三： 沼澤紅假單胞菌的分離純化和鑒定

1. 沼澤紅假單胞菌的分離純化

a．取采取的底泥樣品20g，放入滅菌的500ml錐形瓶中，添加富集培養(yǎng)基至離瓶口2~3cm，用橡膠塞和塑料膜將錐形瓶密封以營造厭氧環(huán)境；將裝有樣品的富集培養(yǎng)基放置于光照強度為2000~4000lx、溫度為30℃的環(huán)境中培養(yǎng)一周。取富集液按20%濃度再轉接富集兩次。然后取富集三次后的富集液進行梯度稀釋至10^-8；

b．取10^-6、10^-7和10^-8稀釋液涂布光合細菌分離培養(yǎng)基平板，上層覆蓋瓊脂，然后將其放置于光照強度2000~4000lx、溫度30℃的環(huán)境下培養(yǎng)一周。待菌落長出后，挑選淺紅色、光滑濕潤、邊緣整齊、中間有隆起的菌落，在分離培養(yǎng)基平板上劃線純化，直至得到純培養(yǎng)物，保存于甘油管和牛奶管。

2. 菌株的生理生化鑒定

根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對所分離菌株進行生理生化特征鑒定，結果如表3所示。

注：“+”表示陽性，“－”表示陰性。

將生理生化鑒定結果與《伯杰細菌鑒定手冊》第八版上關于光合細菌的描述相對照，所分離菌株符合沼澤紅假單胞菌的特征。

3 .16SrDNA序列鑒定

提取所分離菌株的基因組DNA，以通用引物PA、PB為引物，基因組DNA為模板，擴增16SrDNA片段，得到1500bp左右的特異性片段。將擴增的PCR產物送去生工進行DNA序列的測定，將所得到的序列導入NCBI中的BLAST軟件或EzTaxon server進行序列比對，結果顯示目標菌與Rhodopseudomonas palustris的相似性為100%。結合所分離菌株的生理生化特征、菌落形態(tài)以及16S rDNA序列比對結果，可以確定所分離菌株為沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）。

四：復合微生態(tài)制劑發(fā)酵液的制備

1．啤酒酵母菌發(fā)酵液的制備

a．菌種活化：將保存的啤酒酵母菌菌種劃線接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)3天，在平板上形成啤酒酵母菌單菌落。

b．一級種子液制備：制備100mL PDA液體培養(yǎng)基，裝入300mL錐形瓶中，滅菌；挑取步驟a活化的啤酒酵母菌單菌落接種于PDA液體培養(yǎng)基中，放入28℃搖床中，180rpm培養(yǎng)3天，即為一級種子液。

c．發(fā)酵液的制備：制備500mL PDA液體培養(yǎng)基，裝入1L錐形瓶中，滅菌；吸取10mL步驟b培養(yǎng)的啤酒酵母菌一級種子液，轉接到制備的500mL PDA液體培養(yǎng)基中，放入28℃搖床中，180rpm培養(yǎng)3~5天，使發(fā)酵液中活菌數(shù)達到10⁹cfu/mL以上。

2．凝結芽孢桿菌發(fā)酵液的制備

a．菌種活化：將保存的凝結芽孢桿菌菌種劃線接種于MRS培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)2天，在平板上形成凝結芽孢桿菌單菌落。

b．一級種子液制備：制備100mL MRS液體培養(yǎng)基，裝入300mL錐形瓶中，滅菌；挑取步驟a活化的凝結芽孢桿菌單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，放入37℃搖床中，180rpm培養(yǎng)2天，即為一級種子液。

c．發(fā)酵液的制備：制備500mL MRS液體培養(yǎng)基，裝入1L錐形瓶中，滅菌；吸取10mL步驟b培養(yǎng)的凝結芽孢桿菌一級種子液，轉接到制備的500mL MRS液體培養(yǎng)基中，放入37℃搖床中，180rpm培養(yǎng)2~3天，使發(fā)酵液中活菌數(shù)達到10⁹cfu/mL以上。

3．沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液的制備

a．菌種活化：將保存的沼澤紅假單胞菌菌種劃線接種于光合細菌分離培養(yǎng)基平板上，上層覆蓋瓊脂，放置于光照強度2000~4000lx，溫度30℃的環(huán)境下培養(yǎng)一周，在平板上形成凝結芽孢桿菌單菌落。

b．一級種子液制備：制備400mL 光合細菌液體培養(yǎng)基，高壓滅菌后裝入300mL無菌錐形瓶中，使培養(yǎng)基離錐形瓶口大約2~3cm，用橡膠塞和塑料膜密封；挑取步驟a活化的沼澤紅假單胞菌單菌落接種于光合細菌液體培養(yǎng)基中，放置于光照強度2000~4000lx，溫度30℃的環(huán)境下培養(yǎng)一周，即為一級種子液。

c．發(fā)酵液的制備：制備1.2L 光合細菌液體培養(yǎng)基，高壓滅菌后裝入1L無菌錐形瓶中，使培養(yǎng)基離錐形瓶口大約2~3cm，用橡膠塞和塑料膜密封；吸取50mL步驟b培養(yǎng)的沼澤紅假單胞菌一級種子液，轉接到制備的光合細菌液體培養(yǎng)基中，放置于光照強度2000~4000lx，溫度30℃的環(huán)境下培養(yǎng)7~10天，使發(fā)酵液中活菌數(shù)達到10⁹cfu/mL以上。

4．微生態(tài)制劑發(fā)酵液的制備：所述啤酒酵母菌發(fā)酵液的活菌數(shù)大于3.5×10⁹cfu/mL；所述凝結芽孢桿菌發(fā)酵液活菌數(shù)大于8.3×10⁹cfu/mL；所述沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液活菌數(shù)大于1.7×10⁹cfu/mL；將所述啤酒酵母菌發(fā)酵液、凝結芽孢桿菌發(fā)酵液、和沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液按照體積比1:0.7~1:3.5~4.5混合，即得到所述微生態(tài)制劑，其中啤酒酵母菌活菌數(shù)占總菌數(shù)的百分比為20%~30%，凝結芽孢桿菌活菌數(shù)占總菌數(shù)的百分比為30%~40%，沼澤紅假單胞菌占總菌數(shù)百分比為30%~40%。

五：一種卡拉白魚養(yǎng)殖用復合微生態(tài)制劑的應用

養(yǎng)殖試驗在6m×6m×2m的水泥池中進行，試驗分為兩組，即試驗組和對照組，每組3個重復，每個水泥池放1齡卡拉白魚200尾，水深1.5m，卡拉白魚體重為（6.20±1.47）g、體長為（8.80±0.53）cm，試驗時間為30天，試驗采取常規(guī)飼料喂養(yǎng)，每天9:00、13:00和18:00各投喂一次，對照組飼料中不添加復合微生態(tài)制劑發(fā)酵液，試驗組飼料中每100kg飼料用噴霧器噴灑1L復合微生態(tài)制劑發(fā)酵液。

1．測定微生態(tài)制劑對水質的影響

氨氮采用納氏試劑法；亞硝態(tài)氮采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法測定；DO值采用溶解氧儀測定；化學需氧量（COD_Mn）采用高錳酸鉀法測定，所有指標每隔5天測量一次并記錄。結果如圖1~4所示。

從圖1至圖4可以看出，對照組水體中氨氮和亞硝態(tài)氮的含量隨養(yǎng)殖的進行上升明顯，溶解氧則有下降的趨勢，COD_Mn的含量有下降趨勢，但不明顯；試驗組水體中氨氮、亞硝態(tài)氮和COD_Mn的含量隨養(yǎng)殖的進行，有明顯的下降趨勢，尤其是氨氮和亞硝態(tài)氮，下降的趨勢非常明顯；溶解氧則一直在增加，但趨勢不是很明顯。因此本微生態(tài)制劑有明顯的改善水質的作用。

2．測定微生態(tài)制劑對卡拉白魚生長性能的影響

養(yǎng)殖試驗選擇體重為（6.20±1.47）g、體長為（8.80±0.53）cm的1齡卡拉白魚，經過30天的試驗后測量其體重和體長，計算體重增長率和體長增長率，結果如表4所示。

由表4可看出，試驗結束后試驗組卡拉白魚的長勢明顯高于對照組，無論體重增長率還是體長增長率都明顯比對照組要高，結果具有顯著性差異（P<0.05），因此本發(fā)明的復合微生態(tài)制劑具有促進卡拉白魚成魚生長的作用。

本發(fā)明通過將啤酒酵母菌、凝結芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌按特定比例混合而制成，將其用于卡拉白魚成魚養(yǎng)殖，既能分解養(yǎng)殖水體中的殘餌和動物排泄物，降低水體的氨氮、亞硝態(tài)氮和COD_Mn的含量，增加溶氧量，達到凈化水質的效果；又能改善養(yǎng)殖卡拉白魚腸道微生物菌群，進而增強魚體內消化酶的活性，提高飼料利用率，促進生長。