本發(fā)明屬于三色堇分子育種
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體涉及三色堇種子浸泡法直接導(dǎo)入外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
：：三色堇(Viola×wittrockiana)，屬于堇菜科(Violaceae)堇菜屬(Viola)。其花型可愛多變，花色艷麗，品種豐富，花期較長，具有“花壇皇后”的美譽，是冬春花壇、花境、盆花及圖案等的首選材料之一；同時，由于其耐寒性較強，可以通過調(diào)節(jié)播種期來調(diào)控三色堇的盛花期，使其在元旦前后開花，因此，有廣泛的應(yīng)用價值。自1983年第一例轉(zhuǎn)基因植物問世以來，轉(zhuǎn)基因植物研究已在培育抗病植物、抗蟲植物、提高作物品質(zhì)及產(chǎn)量、提高作物抗逆性等方面發(fā)揮了巨大的作用。然而目前由于受植物轉(zhuǎn)基因方法、受體材料等的限制，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行植物品質(zhì)改良受到了一定限制，尤其是對三色堇。近年來，三色堇性狀的改良及新品種的繁育都依靠傳統(tǒng)的雜交育種(王健和包滿珠2007；杜曉華等2010；李清斌等2014；楊迪等2015)，無法通過轉(zhuǎn)基因的手段進(jìn)行改良，因其再生研究歷經(jīng)多年的努力，仍未獲得突破性進(jìn)展，尚無成熟的再生體系。前人以三色堇的根、下胚軸和子葉片段分別作為外植體誘導(dǎo)出愈傷組織，但由子葉片段得到的愈傷逐漸轉(zhuǎn)變成綠色玻璃化結(jié)構(gòu)，不能繼續(xù)生長，最后枯萎；根和下胚軸誘導(dǎo)出的愈傷無法得到不定芽(BabberandKulbhushan1991)。盧興霞(2006)以三色堇花藥作為外植體誘導(dǎo)出愈傷，但是愈傷組織極易生根，無法誘導(dǎo)出芽。劉霞(2007)用六種不同的三色堇器官作為外植體誘導(dǎo)再生，只有頂芽較易存活和增殖。有報道以三色堇的葉柄為外植體初步建立了再生體系：方法是通過葉柄首先誘導(dǎo)出愈傷，依次在兩種繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，然后在分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化不定芽，分化出的不定芽在增殖培養(yǎng)基上壯芽和擴(kuò)增，最后誘導(dǎo)生根(WangandBao2007)。但這一方案步驟復(fù)雜，費時費力，難以重復(fù)。張其生(2009)初步建立了三色堇的快繁體系，并在Wang的基礎(chǔ)上研究建立了以三色堇無菌苗節(jié)間莖段和葉柄為外植體的再生體系，也嘗試過葉片，但沒有成功。由于三色堇的節(jié)間莖段和葉柄增殖困難，且易產(chǎn)生玻璃化苗，仍然難以應(yīng)用。李春燕(2011)在前人的基礎(chǔ)上試圖解決三色堇再生過程中增殖困難和玻璃化問題，通過改良培養(yǎng)基后再生率有所提高，但三色堇的增值材料玻璃化更為嚴(yán)重，需多次繼代去除玻璃化，但多次繼代極大影響了無菌苗的再生能力，所以解決問題效果不理想。另外李春燕還嘗試用葉片、葉柄和節(jié)間莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，但無法誘導(dǎo)出綠色愈傷組織，轉(zhuǎn)化效果不理想。至此，三色堇這種再生頑拗種的高效再生體系仍然無法建立。至今三色堇無論采用什么材料，無論基于直接還是間接再生的遺傳轉(zhuǎn)化，都沒有轉(zhuǎn)化成功的案例，所以沒有成功建立三色堇遺傳轉(zhuǎn)化體系的報道。此外，到目前為止尚未檢索到有關(guān)三色堇轉(zhuǎn)基因的方法的報道，特別是沒有檢索到有關(guān)利用三色堇種子浸泡法直接導(dǎo)入外源基因轉(zhuǎn)化三色堇獲得新植物的方法的報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種三色堇種子浸泡法直接導(dǎo)入外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：一種三色堇種子浸泡法直接導(dǎo)入外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化方法，采用已露白的三色堇種子作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，經(jīng)根癌農(nóng)桿菌浸泡介導(dǎo)目的基因?qū)胧荏w，利用卡那霉素作為選擇劑對轉(zhuǎn)化后的植株進(jìn)行篩選，通過載體上的35S啟動子和目的基因設(shè)計特異引物進(jìn)行PCR檢測，同時對陽性植株進(jìn)行表型觀測，篩選得到轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的具體步驟如下所述：一種三色堇種子浸泡法直接導(dǎo)入外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化方法，采用已露白的三色堇種子作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，經(jīng)根癌農(nóng)桿菌浸泡介導(dǎo)目的基因?qū)胧荏w，利用卡那霉素作為選擇劑對轉(zhuǎn)化后的植株進(jìn)行篩選，通過載體上的35S啟動子和目的基因設(shè)計特異引物進(jìn)行PCR檢測，同時對陽性植株進(jìn)行表型觀測，篩選得到轉(zhuǎn)基因植株，具體步驟如下所述：(1)構(gòu)建含有目的基因的重組質(zhì)粒并導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌，其中：重組質(zhì)粒含NPTⅡ基因，具備卡那霉素抗性，目的基因由35S啟動子驅(qū)動(詳見實施例1)。(2)將55±5粒三色堇種子裝入離心管，加入適量蒸餾水，將種子振蕩至管底，將離心管置于40℃水浴15min后自然冷卻，黑暗下靜置23h后棄管內(nèi)蒸餾水，加入80mg/L赤霉素(GA3)溶液，振蕩使種子與溶液充分接觸，黑暗靜置1h后棄管內(nèi)溶液，將種子倒在雙層紗布上，用蒸餾水沖洗下，同時搓去種子表面膠質(zhì)，再將種子用雙層無菌紗布包裹，置于10％H2O2振蕩消毒15min，洗凈后將種子平鋪于內(nèi)墊濕潤雙層紗布的培養(yǎng)皿中，28℃下暗培養(yǎng)，每隔24h觀察種子狀態(tài)，添加適量蒸餾水保持濕潤。當(dāng)種子萌發(fā)使褐色的種皮破裂露白，胚根伸長至2～4mm，即得到露白的三色堇種子。(3)將已露白的三色堇種子浸入含有目的基因的重組根癌農(nóng)桿菌菌液中，具體步驟：離心管中預(yù)先加入重組農(nóng)桿菌菌液，將三色堇種子從培養(yǎng)皿中移到1.5mL離心管中，使農(nóng)桿菌菌液剛剛浸沒所有種子，輕微振蕩離心管，然后傾斜，使種子受到農(nóng)桿菌浸泡的同時能進(jìn)行呼吸作用；浸泡后用蒸餾水清洗種子4～5次，繼續(xù)平鋪于培養(yǎng)皿中暗培養(yǎng)；所述重組根癌農(nóng)桿菌菌液OD600為0.4；所述的重組根癌農(nóng)桿菌菌液中浸泡1.5h；所述農(nóng)桿菌菌液中卡那霉素的濃度為100mg/L；(4)將步驟(3)中暗培的露白種子于子葉脫離種皮后置于光照強度2000lx下培養(yǎng)，子葉變綠后移至花盆中，至真葉長出4-5片時可進(jìn)行抗性篩選；(5)用卡那霉素進(jìn)行抗性篩選：將步驟(4)中的幼苗用350mg/L卡那霉素進(jìn)行噴施，獲得抗性苗；(6)通過載體上的35S啟動子和目的基因設(shè)計特異引物，對步驟(5)獲得的抗性苗進(jìn)行PCR檢測，獲得陽性植株(詳見實施例1)。(7)對步驟(6)中的陽性植株進(jìn)行表型觀測，與對照(野生型擬南芥植株)進(jìn)行比較，獲得表型發(fā)生明顯改變的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的有益效果如下：(1)本發(fā)明克服了三色堇再生頑拗的局限性，避免了常規(guī)遺傳轉(zhuǎn)化基于再生體系所需的組織培養(yǎng)等程序，直接通過種子浸泡法轉(zhuǎn)化外源基因，為定向改良三色堇的性狀提供了新的育種方法。(2)本發(fā)明轉(zhuǎn)化三色堇的方法不經(jīng)過再生培養(yǎng)階段，大大簡化了實驗操作，降低了轉(zhuǎn)化成本。(3)本發(fā)明轉(zhuǎn)化周期短，露白種子浸泡后長出子葉即可移栽上盆，僅需15天左右。附圖說明序列表SEQIDNO：1是本發(fā)明涉及的AtWUS基因全長序列(AtWUS轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)的是全長)。序列表SEQIDNO：2是本發(fā)明涉及的驅(qū)動AtWUS基因表達(dá)的35S啟動子序列。序列表SEQIDNO：3是本發(fā)明涉及的轉(zhuǎn)基因抗性植株P(guān)CR檢測35S啟動子特異片段。序列表SEQIDNO：4是本發(fā)明涉及的轉(zhuǎn)基因抗性植株P(guān)CR檢測AtWUS基因特異片段。圖1：擬南芥AtWUS基因克隆PCR檢測結(jié)果。附圖標(biāo)記說明：泳道M：DNAMarker；泳道1-2。圖2：本發(fā)明所用載體質(zhì)粒pCAMBIA2300s圖譜。圖3：本發(fā)明構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCAMBIA2300s-35S-AtWUS圖譜。圖4：本發(fā)明構(gòu)建的重組載體質(zhì)粒pCAMBIA2300s-35S-AtWUS雙酶切檢測圖。圖5：三色堇露白種子的生長狀態(tài)。圖6：利用卡那霉素(350mg/L)抗性篩選10天后三色堇野生型(非轉(zhuǎn)基因)生長狀況。圖7：三色堇轉(zhuǎn)AtWUS基因抗性苗PCR陽性檢測。附圖標(biāo)記說明：泳道M：DNAMarker；1-21對應(yīng)抗性苗株系編號；CK為野生型植株對照；D為陰性水對照；P為陽性質(zhì)粒對照。圖8：三色堇轉(zhuǎn)基因植株葉片誘導(dǎo)10天的愈傷組織生長情況。附圖標(biāo)記說明：圖8中的A圖是葉盤法接種誘導(dǎo)三色堇葉片再生；圖8中的B圖是經(jīng)過誘導(dǎo)的野生型三色堇葉片，無明顯愈傷組織形成，圖8中的C圖是經(jīng)過誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因三色堇葉片，可見愈傷組織形成。圖9：AtWUS農(nóng)桿菌種子浸泡法侵染時間對三色堇轉(zhuǎn)化陽性率的影響。具體實施方式以下實施例進(jìn)一步定義本發(fā)明。根據(jù)以上的描述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件?，F(xiàn)將本發(fā)明應(yīng)用的化學(xué)或生物化學(xué)物質(zhì)的縮略表列于表1。表1本發(fā)明應(yīng)用的化學(xué)或生物化學(xué)物質(zhì)的縮略表實施例1農(nóng)桿菌介導(dǎo)的三色堇種子浸泡法直接轉(zhuǎn)化AtWUS基因1)含有目的基因的重組根癌農(nóng)桿菌的構(gòu)建(1)AtWUS基因克隆登陸NCBI查詢擬南芥WUSCHEL(AtWUS)基因CDS序列(登陸號為NM_127349.3，長度為879bp)設(shè)計特異引物對，上游引物(PrimerF1)為：ATGGAGCCGCCACAGCAT，下游引物(PrimerR1)為：CTAGTTCAGACGTAGCTC。用擬南芥頂芽提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，將稀釋后的cDNA作為模板(TemplateDNA)，用上述特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系為：PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min，94℃30s，64℃30s，72℃1min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增得到AtWUS基因特異DNA片段，長度為879bp(見序列表SEQIDNO:1)。(2)AtWUS表達(dá)載體的構(gòu)建上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，與pMD18-T載體連接，16℃過夜。連接片段熱激大腸桿菌，將菌液均勻地涂在含有100mg/L氨芐霉素的培養(yǎng)皿上，37℃培養(yǎng)12h，將單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，挑選條帶明亮整齊的單菌落，于37℃添加100mg/L氨芐霉素的液體LB(0.1％NaCL+0.05％酵母提取物+0.1％蛋白胨)，搖菌送武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測序，將測序正確的菌落搖菌提取質(zhì)粒。對比pMD18-T載體(購自寶生物工程大量有限公司)和pCAMBIA-2300s表達(dá)載體(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院包滿珠教授惠贈，見圖2)，選取合適的SalⅠ和SacⅠ兩個酶切位點進(jìn)行酶切：酶切反應(yīng)體系為：酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，將AtWUS和pCAMBIA2300s(見圖2)進(jìn)行連接，16℃過夜。連接產(chǎn)物熱激大腸桿菌，將單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取條帶正確的單菌落搖菌送武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測序，測序正確的單菌落搖菌，用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(購自天根生化科技有限公司)提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒酶切，體系同上，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，質(zhì)粒酶切片段大小正確的pCAMBIA2300s-35S-AtWUS載體(見圖3)即構(gòu)建成功。按菌液700μL，50％甘油300μL保存菌液，-80℃保存?zhèn)溆谩?3)AtWUS表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌載體構(gòu)建過程中已獲得含有pCAMBIA2300s-35S-AtWUS載體的大腸桿菌。將載體質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105(農(nóng)桿菌EHA105菌株為常用菌株，轉(zhuǎn)化方法參照Mahmood等(MahmoodT,ZarT,SaqlanNaqviS(2008)MultiplepulsesimproveelectroporationefficiencyinAgrobacteriumtumefaciens.ElectronJBiotechnol11:145–148)報道的方法，具體步驟如下：①電轉(zhuǎn)杯先后用75％乙醇和無水乙醇各潤洗3次，晾干后冰浴20min；②從-70℃冰箱內(nèi)取出一管農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍；③加入1μL質(zhì)粒于凍融的農(nóng)桿菌感受態(tài)中，輕輕吸打混勻，冰浴30min；④準(zhǔn)備好電轉(zhuǎn)儀，電壓為1800V，將混合液轉(zhuǎn)移至電擊杯中，快速連續(xù)按兩下啟動鍵，聽到“滴”聲后取出；⑤迅速取出電轉(zhuǎn)杯，加入400μL液體LB，吸打混勻后轉(zhuǎn)入到無菌的1.5mL離心管中，28℃，200r/min培養(yǎng)lh；⑥取60μL的轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布在含100mg/L卡那霉素的固體LB培養(yǎng)皿上，倒置，28℃恒溫培養(yǎng)8-12h；⑦用牙簽挑取培養(yǎng)皿上長得大而圓的單菌落轉(zhuǎn)入另一相同抗性的培養(yǎng)皿中作一備份，同時進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增檢測。⑧挑選條帶明亮的單菌落于液體LB培養(yǎng)基上，于28℃搖菌至OD600為0.4，然后按菌液700μL，50％濃度的甘油300μL的比例于-80℃下保存菌液。2)種子的露白處理將55±5粒三色堇種子裝入離心管，加入適量蒸餾水，將種子振蕩至管底，將離心管置于40℃水浴15min后自然冷卻，黑暗下靜置23h后棄管內(nèi)蒸餾水，加入80mg/L赤霉素(GA3)溶液，振蕩使種子與溶液充分接觸，黑暗靜置1h后棄管內(nèi)溶液，將種子倒在雙層紗布上，用蒸餾水沖洗下，同時搓去種子表面膠質(zhì)，再將種子用雙層無菌紗布包裹，置于10％H2O2振蕩消毒15min，洗凈后將種子平鋪于內(nèi)墊濕潤雙層紗布的培養(yǎng)皿中，28℃下暗培養(yǎng)，每隔24h觀察種子狀態(tài)，添加適量蒸餾水保持濕潤，共重復(fù)三次。當(dāng)種子萌發(fā)使褐色的種皮破裂露白，胚根伸長至2～4mm，即得到露白的三色堇種子。3)浸種侵染處理將步驟2)中露白種子置于1)中的農(nóng)桿菌菌液中浸泡1.5h，具體步驟：將三色堇種子從培養(yǎng)皿中移到1.5ml離心管中，加入農(nóng)桿菌菌液至剛剛浸沒所有種子，輕微振蕩離心管，然后傾斜，使種子受到農(nóng)桿菌浸泡的同時能進(jìn)行呼吸作用；浸泡后用蒸餾水清洗種子4～5次，繼續(xù)平鋪于培養(yǎng)皿中暗培養(yǎng)；所述農(nóng)桿菌菌液中卡那霉素的濃度為100mg/L。4)幼苗移栽上盆待子葉脫離種皮后置于光下，子葉變綠后移栽入直徑8cm的花盆中，每盆24棵萌發(fā)的幼苗，置于每天光照14h、光強2000Lx的光照培養(yǎng)箱。5)卡那霉素篩選抗性苗當(dāng)幼苗真葉長出4-5片時用350mg/L卡那霉素溶液進(jìn)行噴施，待野生型(非轉(zhuǎn)基因)幼苗95％以上頂芽都黃化之后，去掉處理的黃化苗，留下抗性苗。6)PCR分子檢測(1)DNA提取選取抗性苗頂部除頂芽外的幼嫩葉片進(jìn)行采樣，提取葉片總DNA，方法參照Chen和Ronald(ChenDH,RonaldPC(1999)ArapidDNAminipreparationmethodsuitableforAFLPandotherPCRapplications.PlantMolBiolRep17:53-57)，使用NanoDrop2000C微量紫外分光光度計檢測濃度，將DNA濃度調(diào)整到100～150ng/μL的范圍內(nèi)。(2)特異引物設(shè)計以重組質(zhì)粒上位于AtWUS上游的啟動子35S的序列(見序列表SEQIDNO:2，長度為866bp)和AtWUS基因序列(見序列表SEQIDNO:1，長度為879bp)為模板，上游引物PrimerF2為：5’-TCCAGTATGGACGATTCAAGG-3’，下游引物PrimerR2為：5’-TGTTTGCCCATCCTCCAC-3’。(3)PCR擴(kuò)增除引物外，PCR反應(yīng)體系和條件均同上，每次檢測都設(shè)有陰性對照(即野生型非轉(zhuǎn)基因)、陽性對照(目的基因質(zhì)粒)和水。反應(yīng)完成后，取5μL反應(yīng)產(chǎn)物于1.0％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色5min，紫外燈下觀察結(jié)果，并用凝膠成像系統(tǒng)(GelLogic200ImagingSystem)拍照保存。PCR擴(kuò)增得到DNA片段包含35S特異片段(見序列表SEQIDNO:3，序列長度為631bp)和用于PCR檢測AtWUS基因的特異片段(見序列表SEQIDNO:4，長度為637bp)，共計1238bp(圖7)。7)轉(zhuǎn)基因植株表型鑒定目的基因AtWUS的功能是使周圍細(xì)胞保持干細(xì)胞的特性，提高分生組織活性。取上述轉(zhuǎn)基因三色堇陽性苗及野生型三色堇對照植株葉片與葉柄作為外植體，每個陽性苗3-4片葉片，葉片生長位置為由頂芽向下數(shù)4-10片，沿葉柄與莖連接處向葉片位移2-3mm切下葉片和葉柄，確保葉柄上沒有腋芽。采用75％酒精消毒35s、0.1％升汞消毒10min。用無菌水洗3-4次，每次3min。將消過毒的葉片在無菌濾紙上，沿葉片邊緣切下，葉柄和葉基部切下作為一個外植體，剩下的部分沿葉中脈二分之一處垂直方向切下，為另外兩個外植體。于附加0.01mg/LNAA和2.0mg/L6-BA的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)葉片再生，10d后可觀察到陽性植株葉盤邊緣有明顯愈傷組織的形成，而對照沒有，確定外源基因的導(dǎo)入促進(jìn)了三色堇愈傷組織的形成(圖8)。8)轉(zhuǎn)化結(jié)果本實施例共侵染三色堇種子170粒，得到轉(zhuǎn)化幼苗148株，移栽至花盆148株，成活148株；卡那霉素篩選148株，18株表現(xiàn)抗性；取18株抗性苗進(jìn)行PCR檢測，陽性苗11棵。移栽成活率＝移栽成活株數(shù)/移栽株數(shù)＝148/148＝100％陽性率＝PCR檢測陽性苗數(shù)目/抗性苗數(shù)目＝11/148＝7.43％轉(zhuǎn)化效率＝PCR檢測為陽性苗數(shù)/侵染種子數(shù)＝11/170＝6.47％本發(fā)明從浸種到上盆進(jìn)行常規(guī)栽培僅需15天，不經(jīng)過再生組織培養(yǎng)的過程，可直接移栽，成活率高。實施例2對比試驗實施例1)三色堇野生型幼苗對卡那霉素濃度的敏感性(1)試驗設(shè)計本實施例所用質(zhì)粒為pCAMBIA2300s，該質(zhì)粒攜帶有選擇標(biāo)記基因為NPTⅡ，對卡那霉素具有抗性。為確定適宜的卡那霉素篩選濃度，本試驗比較了三色堇在6個不同濃度卡那霉素處理后的黃花率和存活率。(2)幼苗培育取三色堇種子50-60粒裝入10mL離心管，加入適量蒸餾水，將種子振蕩至管底，離心管于40℃水浴15min后自然冷卻，黑暗靜置23h后棄管內(nèi)蒸餾水，加入適量80mg/LGA3溶液，振蕩后黑暗靜置1h，將種子置于雙層紗布，蒸餾水沖洗下搓去種子表面膠質(zhì)，將種子用雙層無菌紗布包裹，置于10％H2O2振蕩消毒15min，洗凈后將種子平鋪于鋪有濕潤雙層紗布的培養(yǎng)皿，室溫暗培，每隔24h觀察種子狀態(tài)，根據(jù)情況添加適量蒸餾水保持濕潤。待種子萌發(fā)真葉完全展開時，移入8cm直徑盆內(nèi)，每盆24棵萌發(fā)的幼苗，置于每天光照14h、光強2000Lx的光照培養(yǎng)箱。(3)試驗處理待幼苗長出4-5片真葉時，分別用0mg/L、150mg/L、250mg/L、350mg/L、450mg/L和550mg/L卡那霉素溶液噴施，每天每盆12±1mL，每個處理重復(fù)3盆。觀察三色堇幼苗生長情況，10-12d后統(tǒng)計黃化率，最后統(tǒng)計存活率，并進(jìn)一步進(jìn)行多重比較分析。(4)試驗結(jié)果結(jié)果表明(表2)，整體上卡那霉素的濃度與幼苗的黃花率和存活率呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系，卡那霉素濃度到達(dá)550mg/L時，幼苗全部死掉。為了讓抗生素既能抑制絕大多數(shù)非陽性植株的生長，又不會讓陽性植株死亡，本實施例采用350mg/L卡那霉素作為篩選抗性苗的核實濃度(保證幼苗的存活率控制在12.5％左右)結(jié)果見圖6。表2三色堇野生型幼苗各卡那霉素濃度篩選結(jié)果方差分析注：表2中數(shù)值＝平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，LSD測驗比較各處理間的差異，不同字母表示數(shù)據(jù)間差異顯著(P＝0.05)。2)農(nóng)桿菌侵染時間對AtWUS基因轉(zhuǎn)化三色堇的陽性率影響(1)試驗設(shè)計外源基因農(nóng)桿菌種子浸泡法轉(zhuǎn)化三色堇試驗中，AtWUS基因侵染時間設(shè)定了0.5h、1.0h和1.5h三個處理，每個處理55±5粒種子，重復(fù)三次。(2)侵染方法將保存在-80℃的重組AtWUS農(nóng)桿菌取出，取10μL于10mL已高壓滅菌的液體LB培養(yǎng)基中(含有100mg/L卡那霉素)，28℃，200r/min暗處理搖菌，待菌液OD值0.4時可進(jìn)行侵染。將種子暗培后種子萌發(fā)會使褐色的種皮破裂露白，胚根伸長，胚根長度在3±1mm時將種子從培養(yǎng)皿中移到1.5mL離心管中，離心管中加入適量體積的農(nóng)桿菌菌液，剛剛浸沒所有種子，輕微振蕩離心管，然后傾斜，使種子受到農(nóng)桿菌浸泡的同時能進(jìn)行呼吸作用。浸泡不同時間(0.5h、1.0h和1.5h)后用蒸餾水清洗種子4-5次，繼續(xù)平鋪于培養(yǎng)皿中暗培養(yǎng)。(3)抗性篩選真葉脫離種皮后移至光下，真葉變綠后移至8cm直徑花盆中，置于每天光照14h、光強2000Lx的光照培養(yǎng)箱。待幼苗長出4-5片真葉時，用350mg/L卡那霉素溶液噴施，每天每盆12±1mL，至對照(未侵染種子長出的植株)幼苗存活率至12.50％為止。(4)陽性鑒定以PrimerF2和PrimerR2為特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測獲得的抗性苗，根據(jù)條帶的長度判斷陽性株系，計算陽性率＝PCR檢測陽性苗數(shù)目/抗性苗數(shù)目。(5)比較結(jié)果結(jié)果表明：1.0h和1.5h條件下都獲得了陽性苗，且侵染時間越長陽性苗數(shù)目越多，其中侵染1.0h陽性率達(dá)2.78％；侵染1.5h陽性率達(dá)7.41％。方差分析表明，不同侵染時間下，AtWUS基因轉(zhuǎn)化三色堇的陽性率差異極顯著，多重比較表明1.5h時陽性率最高(圖9)。試驗發(fā)現(xiàn)，浸泡侵染時間越長，植株上盆后土壤返菌越嚴(yán)重，從而明顯影響生長勢，因此最終選定侵染時間為1.5h。3)質(zhì)粒介導(dǎo)的三色堇轉(zhuǎn)基因的效果(1)試驗設(shè)計比較大腸桿菌質(zhì)粒2種濃度和2種負(fù)壓條件下三色堇種子浸泡法轉(zhuǎn)基因的效率，共計4個處理，每個處理55±5粒種子，重復(fù)三次。(2)試驗處理將含有pCAMBIA2300s-35S-AtWUS載體的大腸桿菌質(zhì)粒，用TE緩沖液稀釋，濃度分別調(diào)整為200ng/μL和400ng/μL。露白三色堇種子的處理同實例1，在離心管中加入適量體積的不同濃度質(zhì)粒溶液，剛剛浸沒所有種子，輕微振蕩離心管，然后傾斜，使種子受到農(nóng)桿菌浸泡的同時能進(jìn)行呼吸作用。打開離心管蓋，放入真空箱，調(diào)整不同的負(fù)壓條件(-0.035MPa和-0.070Mpa)，處理6h后將種子用蒸餾水洗3-4次，繼續(xù)平鋪于培養(yǎng)皿中暗培養(yǎng)。真葉脫離種皮后移至光下，真葉變綠后移至8cm直徑花盆中。后續(xù)處理、檢測與實例1相同。(3)實驗結(jié)果結(jié)果表明，以上4種處理的外源基因質(zhì)粒種子浸泡法轉(zhuǎn)化三色堇獲得了抗性植株，但無陽性苗。而農(nóng)桿菌介導(dǎo)的種子浸泡法轉(zhuǎn)化三色堇陽性率最高平均值能達(dá)到7.41％。因此采用外源基因種子浸泡法，以農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)化介質(zhì)較好。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3