本發(fā)明屬于病毒檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種快速鑒別豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株的HRM檢測(cè)引物、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）為單股正鏈RNA病毒屬于冠狀病毒科的，是引起各種年齡豬發(fā)生流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea , PED)的病原。PED 臨床特征為發(fā)病豬嘔吐、腹瀉、脫水，對(duì)一周齡以內(nèi)仔豬的危害較大，可導(dǎo)致 100%發(fā)病率及 50%～100%致死率，PED 目前在包括中國(guó)在內(nèi)的全球多個(gè)國(guó)家流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。該疾病于1971年首次在英國(guó)被發(fā)，19 世紀(jì) 80 年代，亞洲也報(bào)道了 PED 的發(fā)生，并在亞洲持續(xù)流行。隨后由于PED弱毒疫苗和滅活疫苗的廣泛使用，PED的流行得到一定的控制。但自2010年起，中國(guó)主要養(yǎng)豬省份陸續(xù)暴發(fā)了PED。此次流行的PED主要侵害1周齡內(nèi)仔豬，造成感染仔豬嘔吐、腹瀉、繼而脫水和急性死亡。隨后日本、韓國(guó)、泰國(guó)等亞洲國(guó)家和德國(guó)、法國(guó)、瑞士、匈牙利及意大利等歐洲國(guó)家也相繼報(bào)道PED的發(fā)生。2013年4月，美國(guó)愛(ài)荷華州首次暴發(fā)了PED，而在之前美國(guó)并沒(méi)有發(fā)生過(guò)PED。自暴發(fā)后，很快傳遍美國(guó)各地，造成了仔豬的高死亡率及大量的經(jīng)濟(jì)損失，2014年7月，PED已經(jīng)在美國(guó)31

個(gè)州和加拿大部分地區(qū)暴發(fā)。PEDV CV777的基因組全序列是在2001年確定的，十年后，中國(guó)韓國(guó)相繼公布了許多PEDV全基因組序列。不同PEDV基因組全序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)自2010

年以后的流行毒株多個(gè)基因發(fā)生變異，表明此次世界范圍內(nèi)流行的PED是由PEDV變異株引起的。

由于能夠引起腹瀉的疾病有很多，臨床上很難直接診斷PED。容易造成誤診而造成防疫不當(dāng)。因此需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，才能判定是哪種病毒的侵染?，F(xiàn)PEDV的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括：病毒分離與鑒定、免疫電鏡、免疫熒光、病毒的中和試驗(yàn)、RT-PCR方法、ELISA方法等。但目前的診斷方法只能判斷出病原是否為PEDV，而無(wú)法鑒別診斷樣本中的PEDV是經(jīng)典毒株還是變異株。傳統(tǒng)的鑒別PEDV經(jīng)典毒株和變異株的方法是通過(guò)核酸測(cè)序，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。所以迫切需要一種既可檢測(cè)PDEV又能夠鑒別是經(jīng)典株還是變異株的快速檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速鑒別豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株的HRM檢測(cè)引物。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種快速鑒別豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株的HRM檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種快速鑒別豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株的HRM檢測(cè)方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種快速鑒別豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株的HRM引物，其核苷酸序列如下所示：

引物P1: CGGTTCTTTTCAAAATTTAATG（SEQ ID NO：1）；

引物P2: ATACCATGAACGCCACTA（SEQ ID NO：2）。

一種快速鑒別豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株的HRM檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有上述所述的引物。

一種快速鑒別豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株的HRM檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1）從樣品中提取病毒核酸；

2）以核酸為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)P1和P2以及熒光飽和染料，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

3）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析，確定病毒類型；

上述方法用于非疾病的診斷和治療。

進(jìn)一步的，步驟2）中RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：

5×buffer 4μL

dNTP 0.8μL

引物P1 0.5μL

引物P2 0.5μL

酶 0.8μL

模板 1μL

LC green 染料 1μL

ddH₂O 11.4μL

Total 20μL。

進(jìn)一步的，步驟2）中RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性3 min ；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸35s ；循環(huán)35 次；72℃終延伸5min 。

進(jìn)一步的，步驟3）HRM分析過(guò)程中，80℃到90℃以每0.2℃/步的升溫速率進(jìn)行熔解曲線分析。

進(jìn)一步的，步驟3）中HRM分析的具體分析過(guò)程為：在80~90℃熔解溫度范圍內(nèi)，若待檢測(cè)樣品熔解曲線在83~83.5℃出現(xiàn)熔解峰時(shí)，判定該樣品為豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株；若待檢測(cè)樣品熔解曲線在84.25~84.75℃出現(xiàn)熔解峰時(shí)，判定為豬流行性腹瀉病毒變異株。

本發(fā)明的有益效果是：

1）本發(fā)明首次建立了一種快速鑒別豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株的HRM檢測(cè)方法及引物，只需 PCR體系中加入熒光飽和染料進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)；檢測(cè)速度快，全部操作過(guò)程只需2小時(shí)；費(fèi)用低，不需要特異性探針，熒光飽和染料用量少，1個(gè)樣品的飽和染料成本為1元左右；可以簡(jiǎn)單、快速的實(shí)現(xiàn)高通量分析，適合于豬流行性腹瀉病毒篩查。

2）本發(fā)明的PCR-HRM 引物，對(duì)豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株均有很好的擴(kuò)增性， PCR擴(kuò)增效率高，檢測(cè)靈敏度高。

3）本發(fā)明的PCR-HRM 引物特異性好，能夠特異性擴(kuò)增豬流行性腹瀉病毒RNA而不擴(kuò)增豬常見(jiàn)的其他病毒性和細(xì)菌病原，保證了本方法的可靠性。

附圖說(shuō)明

圖1為豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株標(biāo)準(zhǔn)樣品HRM標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線；

圖2為豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株標(biāo)準(zhǔn)樣品HRM峰型化熔解曲線；

圖3為豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株臨床樣品HRM峰型化熔解曲線；

圖4為特異性試驗(yàn)?zāi)z電泳圖；

圖5為經(jīng)典株陽(yáng)性質(zhì)粒樣品的峰型化熔解曲線圖；

圖6為變異株陽(yáng)性質(zhì)粒樣品的峰型化熔解曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。

實(shí)施例1 HRM引物

本發(fā)明經(jīng)過(guò)對(duì)所設(shè)計(jì)的大量引物進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)引物對(duì)P1和P2區(qū)分豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株的效果最好，其堿基序列如下所示。

引物P1：CGGTTCTTTTCAAAATTTAATG（SEQ ID NO：1）；

引物P2：ATACCATGAACGCCACTA（SEQ ID NO：2）。

實(shí)施例2 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備及其PCR-HRM 分析

1）豬流行性腹瀉病毒RNA 的提?。?/p>

采用天根RNA提取試劑盒提取樣品中的豬流行性腹瀉病毒RNA，樣品可以是腸道、腸道內(nèi)容物、糞便、疫苗或細(xì)胞培養(yǎng)物。

2）陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

為了驗(yàn)證本發(fā)明方法可行性與可靠性，同時(shí)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品，為之后的臨床樣品檢測(cè)提供HRM 陽(yáng)性對(duì)照，本發(fā)明需優(yōu)先制備豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品。

分別取經(jīng)過(guò)測(cè)序確定為經(jīng)典株和變異株的質(zhì)粒DNA（質(zhì)粒濃度稀釋至10⁶copies/μL），作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品。

3）陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品的PCR-HRM操作

分別以上述獲得的豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株和變異株的陽(yáng)性質(zhì)粒樣品作為模板，以P1 和P2 為上下游引物在加有熒光飽和染料下的進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，其預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系為：

5×buffer 4μL

dNTP 0.8μL

引物P1 0.5μL

引物P2 0.5μL

酶 0.8μL

模板 1μL

LC green 染料 1μL

ddH2O 11.4μL

Total 20μL。

RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min ；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸35s ；循環(huán)35 次；72℃終延伸5min；HRM分析儀器熔解溫度設(shè)定是以每步升溫0.2℃的速率從80℃到90℃進(jìn)行熒光信號(hào)的收集。

4）陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品PCR-HRM 結(jié)果分析

HRM分析過(guò)程在Rotor-Gene Q 分析儀進(jìn)行，該儀器可以完成PCR-HRM分析全過(guò)程，也可以在普通PCR儀上完成PCR擴(kuò)增再將PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)移至Rotor-Gene Q中完成熔解分析。由于無(wú)需開(kāi)蓋，從而保證了PCR產(chǎn)物不受污染。豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株標(biāo)準(zhǔn)樣品HRM結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1為豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的HRM標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線圖，可見(jiàn)經(jīng)典株與變異株熔解曲線差異明顯。

圖2為豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的HRM峰型化熔解曲線圖，其中經(jīng)典株擴(kuò)增的熔解曲線在83-83.5℃出現(xiàn)熔解峰，變異株擴(kuò)增的熔解曲線在84.25~84.75℃出現(xiàn)熔解峰時(shí)，二者熔解峰區(qū)分明顯。

實(shí)施例 3 臨床樣品的PCR-HRM檢測(cè)

1）從樣本中提取病毒RNA ：方法同實(shí)施例2中 RNA 提取方法；

2）以提取的RNA 為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系為：

5×buffer 4μL

dNTP 0.8μL

引物P1 0.5μL

引物P2 0.5μL

酶 0.8μL

模板 1μL

LC green 染料 1μL

ddH₂O 11.4μL

Total 20μL

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min ；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸35s ；循環(huán)35 次；72℃終延伸5min ；HRM分析儀器熔解溫度設(shè)定是以每步升溫0.2℃的速率從80℃到90℃進(jìn)行熒光信號(hào)的收集。

3）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析，確定毒株類型

本發(fā)明對(duì)18份臨床樣本和疫苗株進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖3。

圖3為峰型熔解曲線圖，兩種毒株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物熔解峰值差異明顯。通過(guò)對(duì)圖形的分析，發(fā)現(xiàn)其中有7份樣本出現(xiàn)熔解峰在83-83.5℃，判定為豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株；另外11份樣本熔解峰在84.25-84.75℃，判斷為豬流行性腹瀉病毒變異株。

由于實(shí)際檢測(cè)中熔解曲線Tm受多方面因素的影響會(huì)有些變化，包括核酸片段本身、反應(yīng)試劑鹽離子濃度及飽和熒光染料濃度微弱變化，故介定一個(gè)寬的Tm范圍。

以本發(fā)明引物和方法，在99%置信區(qū)間內(nèi)，且在80-90℃熔解溫度范圍內(nèi)，若待檢測(cè)樣品熔解曲線在83-83.5℃出現(xiàn)熔解峰時(shí)，判定該樣品為豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株；若待檢測(cè)樣品熔解曲線在84.25-84.75℃出現(xiàn)熔解峰時(shí)，判定為豬流行性腹瀉病毒變異株。。

另外，對(duì)這18份樣品用針對(duì)保守基因的引物進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，做進(jìn)化分析，分析結(jié)果與本發(fā)明方法檢測(cè)的結(jié)果完全一致，說(shuō)明本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性高，可達(dá)100%。

實(shí)施例 4 特異性試驗(yàn)

選取豬易感的幾種RNA和DNA病毒進(jìn)行特異性檢測(cè)，選取的病毒有豬瘟病毒（CSFV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬德?tīng)査《荆―elta coronavirus）豬輪狀病毒（RV）、豬圓環(huán)病毒（PCV2）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥（PRRSV）、口蹄疫病毒（FMDV）。將非豬流行性腹瀉病毒樣本與陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品按照相同的加樣體系和PCR反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)，分析PCR產(chǎn)物熔解曲線結(jié)果。

特異性試驗(yàn)?zāi)z電泳圖結(jié)果如圖4所示。圖4表明除了陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照外，其他非豬流行性腹瀉病毒病原電泳圖中未出現(xiàn)目的條帶。非豬流行性腹瀉病毒病原的未能擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)依據(jù)保證了本發(fā)明所涉及的引物的特異性，進(jìn)一步也保證了本發(fā)明方法的可靠性。

實(shí)施例 5 靈敏性試驗(yàn)

方法：

用實(shí)施例2構(gòu)建好的豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株陽(yáng)性質(zhì)粒樣品進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，陽(yáng)性質(zhì)粒用滅菌雙蒸水作10倍倍比稀釋至10^-9，共9個(gè)稀釋度，并用滅菌雙蒸水作陰性對(duì)照。PCR-HRM的擴(kuò)增反應(yīng)：方法同實(shí)施例2的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。

敏感性試驗(yàn)PCR-HRM結(jié)果分析：

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Rotor-Gene Q分析儀進(jìn)行分析。結(jié)果如圖5和圖6。

圖5和圖6分別是經(jīng)典株與變異株陽(yáng)性質(zhì)粒樣品的峰型化熔解曲線圖，從圖中可以看出，經(jīng)典株陽(yáng)性質(zhì)粒從10^-1稀釋至10^-8均出現(xiàn)了特異性的熔解峰，變異株陽(yáng)性質(zhì)粒從10^-1稀釋至10^-9均出現(xiàn)了特異性的熔解峰。結(jié)果表明該方法的靈敏度高，對(duì)經(jīng)典株與變異株陽(yáng)性質(zhì)粒的最低檢測(cè)限分別為1.35x10³ copies/μL和192 copies/μL。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110> 廣州維佰生物科技有限公司

<120> 一種快速鑒別豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株的HRM檢測(cè)引物、試劑盒及

方法

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cggttctttt caaaatttaa tg 22

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

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