1.一種快速鑒別豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株的HRM引物,其核苷酸序列如下所示:
引物P1: CGGTTCTTTTCAAAATTTAATG(SEQ ID NO:1);
引物P2: ATACCATGAACGCCACTA(SEQ ID NO:2)。
2.一種快速鑒別豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株的HRM檢測試劑盒,其特征在于:該試劑盒含有權(quán)利要求1所述的引物。
3.一種快速鑒別豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株的HRM檢測方法,其特征在于,包括以下步驟:
1)從樣品中提取病毒核酸;
2)以核酸為模板,利用權(quán)利要求1所述的引物對P1和P2以及熒光飽和染料,進行RT-PCR擴增反應(yīng)獲得擴增產(chǎn)物;
3)對擴增產(chǎn)物進行HRM分析,確定病毒類型;
上述方法用于非疾病的診斷和治療。
4.根據(jù)權(quán)利要求3 所述的方法,其特征在于,步驟2)中RT-PCR擴增的反應(yīng)體系為:
5×buffer 4μL
dNTP 0.8μL
引物P1 0.5μL
引物P2 0.5μL
酶 0.8μL
模板 1μL
LC green 染料 1μL
ddH2O 11.4μL
Total 20μL。
5.根據(jù)權(quán)利要求3 或4 所述的方法,其特征在于,步驟2)中RT-PCR擴增反應(yīng)程序如下:94℃預(yù)變性3 min ;94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸35s ;循環(huán)35 次;72℃終延伸5min 。
6.根據(jù)權(quán)利要求3 所述的方法,其特征在于:步驟3)HRM分析過程中,80℃到90℃以每0.2℃/步的升溫速率進行熔解曲線分析。
7.根據(jù)權(quán)利要求3 所述的方法,其特征在于:步驟3)中HRM分析的具體分析過程為:在80~90℃熔解溫度范圍內(nèi),若待檢測樣品熔解曲線在83~83.5℃出現(xiàn)熔解峰時,判定該樣品為豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株;若待檢測樣品熔解曲線在84.25~84.75℃出現(xiàn)熔解峰時,判定為豬流行性腹瀉病毒變異株。