本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種從動(dòng)物肺中提取肝素鈉的方法及該肝素鈉。

背景技術(shù)：

肝素鈉（Heparin Sodium ）是肝素的鈉鹽形式產(chǎn)物。肝素廣泛存在于動(dòng)物體液以及肝、肺、小腸粘膜等組織中，在生物體內(nèi)一般肝素與蛋白質(zhì)結(jié)合形成蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物而存在。肝素具有多種生化和生理功能，用途非常廣泛，主要用于治療血管栓塞、爆發(fā)性流腦、敗血癥、腎炎、急性心肌梗塞、動(dòng)脈硬化等疾病，還具有澄清血漿脂質(zhì)，降低膽固醇等作用。

目前，肝素鈉粗品生產(chǎn)多以豬小腸粘膜為原料，采用酶解法或者鹽解法提取，這種制備方法易受原材料單一、豬小腸原料緊張、成本高等不利因素制約，難以滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的巨大需求。另一方面，我國(guó)是一個(gè)畜牧業(yè)生產(chǎn)大國(guó)，生豬、肉羊和肉牛生產(chǎn)總量位居世界前列，2015年生豬出欄數(shù)量超過7億頭，全年豬肺產(chǎn)量達(dá)到70萬(wàn)噸，肉羊出欄近3億只，全年羊肺產(chǎn)量達(dá)到15萬(wàn)噸，肉牛出欄近5000萬(wàn)頭，全年牛肺產(chǎn)量達(dá)到15萬(wàn)噸，因此有著豐富的動(dòng)物肺臟資源。然而由于各種原因，除有少量的豬肺和羊肺直接食用以及部分豬牛肺經(jīng)初級(jí)加工成飼料和肥料外，大部分被棄之浪費(fèi)，造成了巨大的生物資源浪費(fèi)，同時(shí)又帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境污染，甚至被一些不法商販非法利用還帶來(lái)食品安全問題。因此，對(duì)屠宰廠（場(chǎng)）副產(chǎn)物—?jiǎng)游锓闻K進(jìn)行深度開發(fā)和綜合加工利用具有重要意義。

動(dòng)物肺中碳水化合物含量（以干基計(jì)）在4%以上，肝素就存在于這些碳水化合物中，因此，動(dòng)物肺臟是一類資源豐富的肝素制取原料。動(dòng)物肺中雖然肝素含量高，但是由于大量雜蛋白、脂肪和類肝素存在，而且這些雜質(zhì)與肝素結(jié)合非常牢固，不易分離純化，因而很難獲得純度、活性俱佳的肺肝素成品。目前，國(guó)內(nèi)也有極少數(shù)企業(yè)在開發(fā)、試產(chǎn)動(dòng)物肺肝素鈉，但因產(chǎn)品純度低、效價(jià)低而無(wú)法銷售。目前來(lái)看，利用動(dòng)物肺提取肝素需要解決以下幾個(gè)關(guān)鍵技術(shù)：（1）動(dòng)物肺中粗蛋白含量（以干基計(jì)）達(dá)到70%以上，肝素和蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以糖蛋白形式存在，肝素-蛋白質(zhì)復(fù)合物是無(wú)活性的，因此必須有效地將肺組織中的肝素與蛋白質(zhì)完全解離，并除去雜蛋白，以提高肝素活性和效價(jià)，獲得較高收率；（2）動(dòng)物肺中油脂含量（以干基計(jì)）在10%以上，過多的油脂不僅會(huì)影響提取過程中蛋白質(zhì)的解離和肝素的釋放，同時(shí)也影響樹脂的吸附和再生，進(jìn)而影響肝素的效價(jià)和收率，因此，有必要在肝素萃取之前最大程度地除去油脂，以提高肝素收率和效價(jià)；（3）動(dòng)物肺中硫酸軟骨素和硫酸皮膚素含量比較高，而且兩者與肝素性質(zhì)相似，不易分離，因此，如何有效去除肺肝素中的硫酸軟骨素和硫酸皮膚素，是制備合格肝素成品的關(guān)鍵所在。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)已有少數(shù)科研工作者在研究提取動(dòng)物肺肝素方面取得了一些進(jìn)展，其中有些已申請(qǐng)了發(fā)明專利。例如，CN201110161138.6 公開了一種利用豬肺提取肝素鈉粗品的制備工藝，該工藝采用常規(guī)的酶解方法，經(jīng)破漿、酶解、過濾、離子交換吸附處理、洗滌與洗脫、沉淀、干燥等步驟制取肝素鈉粗品，該方法制備的肝素鈉粗品效價(jià)能達(dá)到90U/mg，但是在提取肝素鈉過程中沒有對(duì)肺原料進(jìn)行脫脂處理，也沒有對(duì)肝素鈉粗品進(jìn)行純化與精制步驟，僅采用單純性酶解方法不能使肝素從肺細(xì)胞中徹底釋放出來(lái)，也不能徹底除去蛋白質(zhì)、硫酸軟骨素和硫酸皮膚素等雜質(zhì)。因此，現(xiàn)有技術(shù)方案所制取的肺肝素鈉效價(jià)低，雜質(zhì)含量高，質(zhì)量達(dá)不到市場(chǎng)收購(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)要求，難以產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種從動(dòng)物肺中提取肝素鈉的方法，以解決現(xiàn)有利用動(dòng)物肺提取肝素鈉的制備方法中，均采用單純性酶解或鹽解方法不能實(shí)現(xiàn)肝素完全提取、產(chǎn)品收率低、雜質(zhì)含量高、效價(jià)低、無(wú)法銷售的問題，所述的從動(dòng)物肺中提取肝素鈉的方法，該工藝以豐富的動(dòng)物肺為原料，應(yīng)用酶解、鹽解、樹脂提純、酸堿處理、復(fù)沉精制等現(xiàn)代生物與生化分離技術(shù)，具有工藝簡(jiǎn)單、成本低、收得率高、適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種所述的從動(dòng)物肺中提取肝素鈉的方法所制備的肝素鈉，該肝素鈉具有純度好、效價(jià)高、能達(dá)到市場(chǎng)收購(gòu)標(biāo)準(zhǔn)要求等優(yōu)點(diǎn)。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種從動(dòng)物肺中提取肝素鈉的方法，包括以下步驟：

（1）絞碎打漿：動(dòng)物肺經(jīng)預(yù)處理、絞碎、勻漿后加水，攪拌混勻，得到肺漿液；

（2）酶解脫脂：用NaOH調(diào)節(jié)步驟（1）中的肺漿液的pH值至8.5 -9.2，升溫至40-45℃，加入脂肪酶，保溫酶解，過濾，收集濾渣，加水?dāng)嚢璧妹撝螡{液；

（3）鹽解提?。和襟E（2）中的脫脂肺漿液中加入氯化鈉，調(diào)節(jié)pH值，升溫至50-55℃并保溫，再升溫并進(jìn)行過濾，得到鹽解液；

（4）酶解除蛋白：將步驟（3）中的鹽解液降溫至55℃，調(diào)節(jié)pH值至8.0-9.0，加入蛋白酶，保溫酶解，然后升溫滅酶并進(jìn)行過濾，得到酶解液；

（5）吸附：將步驟（4）中的酶解液降溫至60℃，調(diào)整其鹽度和pH值，加入D-254樹脂，保溫吸附處理10-12小時(shí)后，收集吸附后的樹脂；

（6）洗脫：

（6-1）：用水反復(fù)沖洗步驟（5）中的吸附后的樹脂至水變清為止，濾干樹脂，再以完全浸沒樹脂為量，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-7%的氯化鈉溶液，溫度保持在50-55℃，攪拌30-60min，濾干得洗滌后的樹脂；

（6-2）：以完全浸沒步驟（6-1）中的洗滌后的樹脂為量，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20-25%的氯化鈉溶液，溫度保持在50-55℃，攪拌3-4小時(shí)后，分離樹脂，收集洗脫液；

（6-3）：重復(fù)步驟（6-2）一次，將兩次收集的洗脫液合并，并用100目濾袋過濾，收集洗脫液待用；

（7）調(diào)酸除蛋白：往步驟（6-3）中的洗脫液加入其重量0.1-0.3%的保護(hù)劑攪拌均勻后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.0-3.5，靜置10分鐘，用100目濾袋過濾，收集濾液待用；

（8）調(diào)堿除蛋白：用NaOH調(diào)節(jié)步驟（7）中的濾液的pH值至11.0，攪拌均勻后靜置30分鐘，用100目濾袋過濾，收集濾液待用；

（9）沉淀脫鹽：用稀鹽酸調(diào)節(jié)步驟（8）中的濾液的pH值至7.0-8.0，加入其體積1.8-2.2倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80-85%的預(yù)冷過的乙醇，攪拌均勻后密封沉淀18-24小時(shí)，傾出上層乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10）復(fù)沉精制：

（10-1）：往步驟（9）中的沉淀物中加入其重量10倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的氯化鈉溶液，攪拌溶解后,升溫至80℃并保溫，然后降溫并進(jìn)行過濾，收集濾液，加入乙醇，靜置，收集沉淀物；

（10-2）：往步驟（10-1）中的沉淀物中加入其重量10倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的氯化鈉溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?升溫至80℃并保溫，然后降溫并進(jìn)行過濾，收集濾液，加入乙醇，靜置，收集沉淀物；

（11）脫水干燥：往步驟（10-2）中的沉淀物中加入其重量2倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95-100%的乙醇脫水2-3次，收集沉淀物，置于60-70℃下干燥10-15小時(shí)即得肝素鈉。

在上述步驟（1）中，在所述動(dòng)物肺經(jīng)預(yù)處理、絞碎、勻漿后加水，攪拌混勻，得到肺漿液的過程中，具體包括以下步驟：取新鮮（或經(jīng)冷凍保存后自然解凍）動(dòng)物肺清洗去污，剝離氣管，去除皮質(zhì)脂肪，用斬拌機(jī)絞碎成肉糜狀，再經(jīng)細(xì)磨機(jī)研磨勻漿5-10min，得到肺漿料，然后添加肺漿料2-3倍重量的水，攪拌混勻，得到肺漿液。

在上述步驟（2）中，在所述升溫至40-45℃，加入脂肪酶，保溫酶解，過濾，收集濾渣，加水?dāng)嚢璧妹撝螡{液的過程中，具體包括以下步驟：升溫至40-45℃，按每公斤肺添加1.2-2.5克的比例加入脂肪酶，保溫酶解30-60分鐘，酶解結(jié)束后用80目濾袋過濾，收集濾渣，往濾渣中加入3-5倍重量的水，攪拌均勻后得脫脂肺漿液；所述脂肪酶為堿性脂肪酶，酶活力為10000-30000U/g。

在上述步驟（3）中，在所述往脫脂肺漿液中加入氯化鈉，調(diào)節(jié)pH值，升溫至50-55℃并保溫，再升溫保溫并進(jìn)行過濾，得到鹽解液的過程中，具體包括以下步驟：按每公斤肺添加300-400克的比例往脫脂肺漿液中加入氯化鈉，調(diào)pH值至9.0，攪拌下升溫至50-55℃，保溫反應(yīng)3-5小時(shí)，整個(gè)反應(yīng)過程中保持pH值在8.5-9.0之間，反應(yīng)結(jié)束后快速升溫至100℃，保溫10min，趁熱用80目濾袋過濾，收集濾液得鹽解液，濾渣經(jīng)干燥可作飼料用。

在上述步驟（4）中，在所述加入蛋白酶，保溫酶解，然后升溫滅酶并進(jìn)行過濾，得到酶解液的過程中，具體包括以下步驟：按每公斤肺添加3-5克的比例加入2709蛋白酶，保溫50-55℃，酶解3-5小時(shí)后，升溫至85℃，保溫30min后，趁熱用100目濾袋過濾，收集濾液得酶解液。

在上述步驟（5）中所述將酶解液降溫至60℃，調(diào)整其鹽度和PH值，加入D-254樹脂，保溫吸附處理10-12小時(shí)后，收集吸附后的樹脂的過程中，具體包括以下步驟：將酶解液降溫至60℃，調(diào)整其鹽度為2.0-2.8波美度，調(diào)節(jié)其PH值為8.0-8.5，然后按每公斤肺添加30-40克比例加入D-254樹脂，攪拌狀態(tài)下保持溫度55-60℃吸附處理10-12小時(shí)后，過濾，收集吸附后的樹脂。

在上述步驟（7）中，所述保護(hù)劑為亞硫酸氫鈉。

在上述步驟（10-1）中，在所述升溫至80℃并保溫，然后降溫并進(jìn)行過濾，收集濾液，加入乙醇，靜置，收集沉淀物的過程中，具體包括以下步驟：升溫至80℃，保溫10分鐘后，冷卻到常溫，用100目濾袋過濾，收集濾液，再往濾液中加入其體積1-1.2倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷過的乙醇，攪拌均勻后靜置30分鐘，傾出上層乙醇清液，收集沉淀物。

在上述步驟（10-2）中，在所述升溫至80℃并保溫，然后降溫并進(jìn)行過濾，收集濾液，加入乙醇，靜置，收集沉淀物的過程中，具體包括以下步驟：升溫至80℃，保溫10分鐘后，冷卻到常溫，用100目濾袋過濾，收集濾液，再往濾液中加入其體積0.5-0.8倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷過的乙醇，攪拌均勻后靜置30分鐘，傾出上層乙醇清液，收集沉淀物。

如上所述的從動(dòng)物肺中提取肝素鈉的方法所制備的肝素鈉。

肝素鈉是一種生物醫(yī)藥中間體，是從動(dòng)物肝、肺、小腸粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，屬粘多糖類物質(zhì)，具有多種生理功能和非常廣泛的用途。肝素鈉是世界上最有效和臨床用量最大的抗凝血藥物，主要應(yīng)用于心腦血管疾病和血液透析治療，其在血液透析治療中是唯一有效的特效藥物。臨床應(yīng)用及研究顯示，肝素鈉除具有抗凝血作用外，還具有其他多種生物活性和臨床用途，包括降血脂作用、抗中膜平滑肌細(xì)胞（SMC）增生、促進(jìn)纖維蛋白溶解等作用。此外，低分子肝素鈉是由肝素鈉原料藥作為原料進(jìn)一步加工成的一大類抗血栓的藥物，具有更為廣泛的臨床醫(yī)學(xué)用途，成為治療急性靜脈血栓和急性冠脈綜合癥（心絞痛、心肌梗塞）等疾病的首選藥物。目前，肝素鈉尚無(wú)法人工化學(xué)合成。

本發(fā)明方法所制備的肝素鈉，純度好，效價(jià)高，效價(jià)穩(wěn)定在120U/mg以上，其中硫酸軟骨素和硫酸皮膚素含量很低，完全達(dá)到了市場(chǎng)收購(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)要求。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為：

（1）本發(fā)明方法在肝素鈉萃取前，先對(duì)肺漿液進(jìn)行酶解脫脂處理，除去肺漿液中的油脂，既有利于后續(xù)萃取過程中肝素與蛋白質(zhì)的解離，又避免了過多的油脂對(duì)離子交換中樹脂的干擾，大大提高了樹脂的吸附能力和利用率。

（2）本發(fā)明方法在肝素鈉萃取過程中，采用鹽解與酶解相結(jié)合，酸處理與堿處理相結(jié)合工藝，最大限度地使肝素與蛋白質(zhì)解離，較為徹底地去除了蛋白質(zhì)雜質(zhì)，解決了單純性酶解或單純性鹽解不能使肝素從肺細(xì)胞中徹底釋放出來(lái)的問題。

（3）本發(fā)明方法在肝素鈉粗品純化過程中，采用復(fù)沉與乙醇分級(jí)沉淀相結(jié)合方法，較為徹底地去除了硫酸軟骨素和硫酸皮膚素等類肝素雜質(zhì)，所得到的肝素鈉成品純度好，效價(jià)高，效價(jià)穩(wěn)定在120U/mg以上，完全達(dá)到了市場(chǎng)收購(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)要求。

（4）本發(fā)明方法能有效提高肺肝素鈉的收率，平均每公斤動(dòng)物肺提取肝素鈉效價(jià)達(dá)到22萬(wàn)單位以上，與現(xiàn)有技術(shù)相比，收率提高20%以上。

（5）本發(fā)明方法工藝簡(jiǎn)單，原料豐富，成本低廉，實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物肺臟的高值化開發(fā)利用，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

附圖1為本發(fā)明所制取的肝素鈉核磁共振氫譜譜圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

（1）斬拌打漿：取新鮮豬肺100公斤，清洗去污，剝離氣管，去除皮質(zhì)脂肪，用斬拌機(jī)絞碎成肉糜狀，再經(jīng)細(xì)磨機(jī)研磨勻漿5min，得到肺漿料，然后往肺漿料中添加300公斤水，攪拌混勻，得到肺漿液；

（2）酶解脫脂：用NaOH調(diào)整步驟（1）中的肺漿液的PH值至8.6，升溫至45℃，往肺漿液中加入脂肪酶150克，保溫酶解45分鐘，酶解結(jié)束后用80目濾袋過濾，收集濾渣，往濾渣中加入3倍重量的水，攪拌均勻后得脫脂肺漿液；

（3）鹽解提?。和襟E（2）中的脫脂肺漿液中添加32公斤氯化鈉，調(diào)pH值至9.0，攪拌下升溫至52℃，保溫反應(yīng)5小時(shí)，反應(yīng)過程中保持pH值在8.5-9.0之間，反應(yīng)結(jié)束后快速升溫至100℃，保溫10min，趁熱用80目濾袋過濾，收集濾液得鹽解液，濾渣經(jīng)干燥可作飼料用；

（4）酶解除蛋白：將步驟（3）中的鹽解液降溫至55℃，調(diào)節(jié)PH值至8.5，加入2709蛋白酶300克，保溫53℃，酶解5小時(shí)后，升溫至85℃，保溫30min后，趁熱用100目濾袋過濾，收集濾液得酶解液；

（5）吸附：將步驟（4）中的酶解液降溫至60℃，調(diào)整其鹽度為2.2波美度，調(diào)節(jié)其PH值為8.0，然后加入D-254樹脂3.2公斤，攪拌狀態(tài)下保持溫度55-60℃吸附處理12小時(shí)后，過濾，收集吸附后的樹脂；

（6）洗脫：

（6-1）：用水反復(fù)沖洗步驟（5）中的吸附后的樹脂至水變清為止，濾干樹脂，再以完全浸沒樹脂為量，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氯化鈉溶液，溫度保持在50-55℃，攪拌60min，濾干得洗滌后的樹脂；

（6-2）：以完全浸沒步驟（6-1）中的洗滌后的樹脂為量，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22%的氯化鈉溶液，溫度保持在50-55℃，攪拌4小時(shí)后，分離樹脂，收集洗脫液；

（6-3）：重復(fù)步驟（6-2）一次，將兩次收集的洗脫液合并，并用100目濾袋過濾，收集洗脫液待用；

（7）調(diào)酸除蛋白：往步驟（6-3）中的洗脫液中加入20克亞硫酸氫鈉，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值至3.0，靜置10分鐘，用100目濾袋過濾，收集濾液待用；

(8)調(diào)堿除蛋白：用NaOH調(diào)節(jié)步驟（7）中的濾液的PH值至11.0，攪拌均勻后靜置30分鐘，用100目濾袋過濾，收集濾液待用；

（9）沉淀脫鹽：用稀鹽酸調(diào)節(jié)步驟（8）中的濾液的PH值至7.2，加入其體積2倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的預(yù)冷過的乙醇，攪拌均勻后密封沉淀24小時(shí)，傾出上層乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10）復(fù)沉精制：

（10-1）：往步驟（9）中的沉淀物中加入其重量10倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的氯化鈉溶液，攪拌溶解后,升溫至80℃，保溫處理10分鐘后，冷卻到常溫，用100目濾袋過濾，收集濾液，再往濾液中加入其體積1.0倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷過的乙醇，攪拌均勻后靜置30分鐘，傾出上層乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10-2）：往步驟（10-1）中的沉淀物中加入其重量10倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的氯化鈉溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?升溫至80℃，保溫處理10分鐘后，冷卻到常溫，用100目濾袋過濾，收集濾液，再往濾液中加入其體積0.8倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷過的乙醇，攪拌均勻后靜置30分鐘，傾出上層乙醇清液，收集沉淀物待用；

（11）脫水干燥：往步驟（10-2）中的沉淀物中加入其重量2倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇脫水2次，收集沉淀物，置于65-70℃下干燥12小時(shí)，得肝素鈉179克。

實(shí)施例2

（1）斬拌打漿：取冷凍豬肺100公斤，經(jīng)自然解凍后清洗去污，剝離氣管，去除皮質(zhì)脂肪，用斬拌機(jī)絞碎成肉糜狀，再經(jīng)細(xì)磨機(jī)研磨勻漿8min，得到肺漿料，然后往肺漿料中添加200公斤水，攪拌混勻，得到肺漿液；

（2）酶解脫脂：用NaOH調(diào)整步驟（1）中的肺漿液的PH值至9.0，升溫至45℃，往肺漿液中加入脂肪酶200克，保溫酶解30分鐘，酶解結(jié)束后用80目濾袋過濾，收集濾渣，往濾渣中加入5倍重量的水，攪拌均勻后得脫脂肺漿液；

（3）鹽解提?。和襟E（2）中的脫脂肺漿液中添加40公斤氯化鈉，調(diào)pH值至9.0，攪拌下升溫至55℃，保溫反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)過程中保持pH值在8.5-9.0之間，反應(yīng)結(jié)束后快速升溫至100℃，保溫10min，趁熱用80目濾袋過濾，收集濾液得鹽解液，濾渣經(jīng)干燥可作飼料用；

（4）酶解除蛋白：將步驟（3）中的鹽解液降溫至55℃，調(diào)節(jié)PH值至8.2，加入2709蛋白酶500克，保溫55℃，酶解4小時(shí)后，升溫至85℃，保溫30min后，趁熱用100目濾袋過濾，收集濾液得酶解液；

（5）吸附：將步驟（4）中的酶解液降溫至60℃，調(diào)整其鹽度為2.5波美度，調(diào)節(jié)其PH值為8.5，然后加入D-254樹脂3.8公斤，攪拌狀態(tài)下保持溫度55-60℃吸附處理10小時(shí)后，過濾，收集吸附后的樹脂；

（6）洗脫：

（6-1）：用水反復(fù)沖洗步驟（5）中的吸附后的樹脂至水變清為止，濾干樹脂，再以完全浸沒樹脂為量，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的氯化鈉溶液，溫度保持在50-55℃，攪拌30min，濾干得洗滌后的樹脂；

（6-2）：以完全浸沒步驟（6-1）中的洗滌后的樹脂為量，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的氯化鈉溶液，溫度保持在50-55℃，攪拌3小時(shí)后，分離樹脂，收集洗脫液；

（6-3）：重復(fù)步驟（6-2）一次，將兩次收集的洗脫液合并，并用100目濾袋過濾，收集洗脫液待用；

（7）調(diào)酸除蛋白：往步驟（6-3）中的洗脫液中加入30克亞硫酸氫鈉，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值至3.5，靜置10分鐘，用100目濾袋過濾，收集濾液待用；

（8）調(diào)堿除蛋白：用NaOH調(diào)節(jié)步驟（7）中的濾液的PH值至11.0，攪拌均勻后靜置30分鐘，用100目濾袋過濾，收集濾液待用；

（9）沉淀脫鹽：用稀鹽酸調(diào)節(jié)步驟（8）中的濾液的PH值至7.8，加入其體積2.2倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的預(yù)冷過的乙醇，攪拌均勻后密封沉淀18小時(shí)，傾出上層乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10）復(fù)沉精制：

（10-1）：往步驟（9）中的沉淀物中加入其重量10倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的氯化鈉溶液，攪拌溶解后,升溫至80℃，保溫處理10分鐘后，冷卻到常溫，用100目濾袋過濾，收集濾液，再往濾液中加入其體積1.2倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷過的乙醇，攪拌均勻后靜置30分鐘，傾出上層乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10-2）：往步驟（10-1）中的沉淀物中加入其重量10倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的氯化鈉溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?升溫至80℃，保溫處理10分鐘后，冷卻到常溫，用100目濾袋過濾，收集濾液，再往濾液中加入其體積0.5倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷過的乙醇，攪拌均勻后靜置30分鐘，傾出上層乙醇清液，收集沉淀物待用；

（11）脫水干燥：往步驟（10-2）中的沉淀物中加入其重量2倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇脫水3次，收集沉淀物，置于65-70℃下干燥10小時(shí)，得肝素鈉172克。

實(shí)施例3

（1）斬拌打漿：取新鮮羊肺100公斤，剝離氣管，去除皮質(zhì)脂肪，用斬拌機(jī)絞碎成肉糜狀，再經(jīng)細(xì)磨機(jī)研磨勻漿8min，得到肺漿料，然后往肺漿料中添加250公斤水，攪拌混勻，得到肺漿液；

（2）酶解脫脂：用NaOH調(diào)整步驟（1）中的肺漿液的PH值至8.8，升溫至43℃，往肺漿液中加入脂肪酶200克，保溫酶解45分鐘，酶解結(jié)束后用80目濾袋過濾，收集濾渣，往濾渣中加入4倍重量的水，攪拌均勻后得脫脂肺漿液；

（3）鹽解提?。和襟E（2）中的脫脂肺漿液中添加35公斤氯化鈉，調(diào)pH值至9.0，攪拌下升溫至52℃，保溫反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)過程中保持pH值在8.5-9.0之間，反應(yīng)結(jié)束后快速升溫至100℃，保溫10min，趁熱用80目濾袋過濾，收集濾液得鹽解液，濾渣經(jīng)干燥可作飼料用；

（4）酶解除蛋白：將步驟（3）中的鹽解液降溫至55℃，調(diào)節(jié)PH值至8.6，按加入2709蛋白酶400克，保溫52℃，酶解4小時(shí)后，升溫至85℃，保溫30min后，趁熱用100目濾袋過濾，收集濾液得酶解液；

（5）吸附：將步驟（4）中的酶解液降溫至60℃，調(diào)整其鹽度為2.8波美度，調(diào)節(jié)其PH值為8.3，然后加入D-254樹脂3.5公斤，攪拌狀態(tài)下保持溫度55-60℃吸附處理11小時(shí)后，過濾，收集吸附后的樹脂；

（6）洗脫：

（6-1）：用水反復(fù)沖洗步驟（5）中的吸附后的樹脂至水變清為止，濾干樹脂，再以完全浸沒樹脂為量，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的氯化鈉溶液，溫度保持在50-55℃，攪拌45min，濾干得洗滌后的樹脂；

（6-2）：以完全浸沒步驟（6-1）中的洗滌后的樹脂為量，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23%的氯化鈉溶液，溫度保持在50-55℃，攪拌3.5小時(shí)后，分離樹脂，收集洗脫液；

（6-3）：重復(fù)步驟（6-2）一次，將兩次收集的洗脫液合并，并用100目濾袋過濾，收集洗脫液待用；

（7）調(diào)酸除蛋白：往步驟（6-3）中的洗脫液中加入25克亞硫酸氫鈉，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值至3.0，靜置10分鐘，用100目濾袋過濾，收集濾液待用；

(8)調(diào)堿除蛋白：用NaOH調(diào)節(jié)步驟（7）中的濾液的PH值至11.0，攪拌均勻后靜置30分鐘，用100目濾袋過濾，收集濾液待用；

（9）沉淀脫鹽：用稀鹽酸調(diào)節(jié)步驟（8）中的濾液的PH值至7.5，加入其體積2倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的預(yù)冷過的乙醇，攪拌均勻后密封沉淀22小時(shí)，傾出上層乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10）復(fù)沉精制：

（10-1）：往步驟（9）中的沉淀物中加入其重量10倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的氯化鈉溶液，攪拌溶解后,升溫至80℃，保溫處理10分鐘后，冷卻到常溫，用100目濾袋過濾，收集濾液，再往濾液中加入其體積1.0倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷過的乙醇，攪拌均勻后靜置30分鐘，傾出上層乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10-2）：往步驟（10-1）中的沉淀物中加入其重量10倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的氯化鈉溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?升溫至80℃，保溫處理10分鐘后，冷卻到常溫，用100目濾袋過濾，收集濾液，再往濾液中加入其體積0.6倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷過的乙醇，攪拌均勻后靜置30分鐘，傾出上層乙醇清液，收集沉淀物待用；

（11）脫水干燥：往步驟（10-2）中的沉淀物中加入其重量2倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇脫水3次，收集沉淀物，置于65-70℃下干燥12小時(shí)，得肝素鈉146克。

實(shí)施例4

（1）斬拌打漿：取新鮮牛肺100公斤，清洗去污，剝離氣管，去除皮質(zhì)脂肪，用斬拌機(jī)絞碎成肉糜狀，再經(jīng)細(xì)磨機(jī)研磨勻漿10min，得到肺漿料，然后往肺漿料中添加200公斤水，攪拌混勻，得到肺漿液；

（2）酶解脫脂：用NaOH調(diào)整步驟（1）中的肺漿液的PH值至8.8，升溫至42℃，往肺漿液中加入脂肪酶200克，保溫酶解40分鐘，酶解結(jié)束后用80目濾袋過濾，收集濾渣，往濾渣中加入5倍重量的水，攪拌均勻后得脫脂肺漿液；

（3）鹽解提?。和襟E（2）中的脫脂肺漿液中添加38公斤氯化鈉，調(diào)pH值至9.0，攪拌下升溫至53℃，保溫反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)過程中保持pH值在8.5-9.0之間，反應(yīng)結(jié)束后快速升溫至100℃，保溫10min，趁熱用80目濾袋過濾，收集濾液得鹽解液，濾渣經(jīng)干燥可作飼料用；

（4）酶解除蛋白：將步驟（3）中的鹽解液降溫至55℃，調(diào)節(jié)PH值至8.5，加入2709蛋白酶350克，保溫50℃，酶解4小時(shí)后，升溫至85℃，保溫30min后，趁熱用100目濾袋過濾，收集濾液得酶解液；

（5）吸附：將步驟（4）中的酶解液降溫至60℃，調(diào)整其鹽度為2.6波美度，調(diào)節(jié)其PH值為8.2，然后加入D-254樹脂3.6公斤，攪拌狀態(tài)下保持溫度55-60℃吸附處理10小時(shí)后，過濾，收集吸附后的樹脂；

（6）洗脫：

（6-1）：用水反復(fù)沖洗步驟（5）中的吸附后的樹脂至水變清為止，濾干樹脂，再以完全浸沒樹脂為量，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的氯化鈉溶液，溫度保持在50-55℃，攪拌40min，濾干得洗滌后的樹脂；

（6-2）：以完全浸沒步驟（6-1）中的洗滌后的樹脂為量，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22%的氯化鈉溶液，溫度保持在50-55℃，攪拌4小時(shí)后，分離樹脂，收集洗脫液；

（6-3）：重復(fù)步驟（6-2）一次，將兩次收集的洗脫液合并，并用100目濾袋過濾，收集洗脫液待用；

（7）調(diào)酸除蛋白：往步驟（6-3）中的洗脫液中加入22克亞硫酸氫鈉，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值至3.2，靜置10分鐘，用100目濾袋過濾，收集濾液待用；

(8)調(diào)堿除蛋白：用NaOH調(diào)節(jié)步驟（7）中的濾液的PH值至11.0，攪拌均勻后靜置30分鐘，用100目濾袋過濾，收集濾液待用；

（9）沉淀脫鹽：用稀鹽酸調(diào)節(jié)步驟（8）中的濾液的PH值至7.5，加入其體積2倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的預(yù)冷過的乙醇，攪拌均勻后密封沉淀20小時(shí)，傾出上層乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10）復(fù)沉精制：

（10-1）：往步驟（9）中的沉淀物中加入其重量10倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的氯化鈉溶液，攪拌溶解后,升溫至80℃，保溫處理10分鐘后，冷卻到常溫，用100目濾袋過濾，收集濾液，再往濾液中加入其體積1.0倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷過的乙醇，攪拌均勻后靜置30分鐘，傾出上層乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10-2）：往步驟（10-1）中的沉淀物中加入其重量10倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的氯化鈉溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?升溫至80℃，保溫處理10分鐘后，冷卻到常溫，用100目濾袋過濾，收集濾液，再往濾液中加入其體積0.5倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷過的乙醇，攪拌均勻后靜置30分鐘，傾出上層乙醇清液，收集沉淀物待用；

（11）脫水干燥：往步驟（10-2）中的沉淀物中加入其重量2倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇脫水2次，收集沉淀物，置于65-70℃下干燥12小時(shí)，得肝素鈉215克。

實(shí)施例5

（1）斬拌打漿：取冷凍牛肺200公斤，經(jīng)自然解凍后清洗去污，剝離氣管，去除皮質(zhì)脂肪，用斬拌機(jī)絞碎成肉糜狀，再經(jīng)細(xì)磨機(jī)研磨勻漿10min，得到肺漿料，然后往肺漿料中添加600公斤水，攪拌混勻，得到肺漿液；

（2）酶解脫脂：用NaOH調(diào)整步驟（1）中的肺漿液的PH值至9.0，升溫至45℃，往肺漿液中加入脂肪酶300克，保溫酶解60分鐘，酶解結(jié)束后用80目濾袋過濾，收集濾渣，往濾渣中加入4倍重量的水，攪拌均勻后得脫脂肺漿液；

（3）鹽解提?。和襟E（2）中的脫脂肺漿液中添加70公斤氯化鈉，調(diào)pH值至9.0，攪拌下升溫至52℃，保溫反應(yīng)5小時(shí)，反應(yīng)過程中保持pH值在8.5-9.0之間，反應(yīng)結(jié)束后快速升溫至100℃，保溫10min，趁熱用80目濾袋過濾，收集濾液得鹽解液，濾渣經(jīng)干燥可作飼料用；

（4）酶解除蛋白：將步驟（3）中的鹽解液降溫至55℃，調(diào)節(jié)PH值至8.8，加入2709蛋白酶900克，保溫52℃，酶解3.5小時(shí)后，升溫至85℃，保溫30min后，趁熱用100目濾袋過濾，收集濾液得酶解液；

（5）吸附：將步驟（4）中的酶解液降溫至60℃，調(diào)整其鹽度為2.2波美度，調(diào)節(jié)其PH值為8.0，然后加入D-254樹脂7公斤，攪拌狀態(tài)下保持溫度55-60℃吸附處理12小時(shí)后，過濾，收集吸附后樹脂；

（6）洗脫：

（6-1）：用水反復(fù)沖洗步驟（5）中的吸附后的樹脂至水變清為止，濾干樹脂，再以完全浸沒樹脂為量，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的氯化鈉溶液，溫度保持在50-55℃，攪拌60min，濾干得洗滌后的樹脂；

（6-2）：以完全浸沒步驟（6-1）中的洗滌后的樹脂為量，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的氯化鈉溶液，溫度保持在50-55℃，攪拌3小時(shí)后，分離樹脂，收集洗脫液；

（6-3）：重復(fù)步驟（6-2）一次，將兩次收集的洗脫液合并，并用100目濾袋過濾，收集洗脫液待用；

（7）調(diào)酸除蛋白：往步驟（6-3）中的洗脫液中加入60克亞硫酸氫鈉，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值至3.0，靜置10分鐘，用100目濾袋過濾，收集濾液待用；

(8)調(diào)堿除蛋白：用NaOH調(diào)節(jié)步驟（7）中的濾液的PH值至11.0，攪拌均勻后靜置30分鐘，用100目濾袋過濾，收集濾液待用；

（9）沉淀脫鹽：用稀鹽酸調(diào)節(jié)步驟（8）中的濾液的PH值至7.2，加入其體積2.2倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的預(yù)冷過的乙醇，攪拌均勻后密封沉淀18小時(shí)，傾出上層乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10）復(fù)沉精制：

（10-1）：往步驟（9）中的沉淀物中加入其重量10倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的氯化鈉溶液，攪拌溶解后,升溫至80℃，保溫處理10分鐘后，冷卻到常溫，用100目濾袋過濾，收集濾液，再往濾液中加入其體積1.2倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷過的乙醇，攪拌均勻后靜置30分鐘，傾出上層乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10-2）：往步驟（10-1）中的沉淀物中加入其重量10倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的氯化鈉溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?升溫至80℃，保溫處理10分鐘后，冷卻到常溫，用100目濾袋過濾，收集濾液，再往濾液中加入其體積0.8倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷過的乙醇，攪拌均勻后靜置30分鐘，傾出上層乙醇清液，收集沉淀物待用；

（11）脫水干燥：往步驟（10-2）中的沉淀物中加入其重量2倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇脫水3次，收集沉淀物，置于65-70℃下干燥10小時(shí)，得肝素鈉438克。

肝素鈉純度檢測(cè)：

對(duì)實(shí)施例1得到的肝素鈉，取樣采用BRUKER NMR儀器（型號(hào)：AV500），依據(jù)美國(guó)藥典USP34-NF29方法進(jìn)行核磁共振圖譜分析，檢測(cè)樣品中硫酸皮膚素、肝素鈉和硫酸軟骨素三種物質(zhì)的含量比。這三種物質(zhì)出峰范圍為2.02-2.07ppm，其中硫酸皮膚素的出峰位置為2.07ppm，肝素鈉為2.04ppm，硫酸軟骨素為2.02ppm。目前市場(chǎng)上對(duì)合格肝素鈉粗品的收購(gòu)標(biāo)準(zhǔn)為其硫酸皮膚素含量小于60%，硫酸軟骨素含量小于30%，反映在核磁共振氫譜譜圖上的信息要求則為在2.07ppm處的峰高不高于2.04ppm 處峰高的二分之一，在2.02ppm處的峰高不高于2.04ppm處峰高的四分之一。實(shí)施例1所得到的肝素鈉樣品檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，從圖1可見，在2.04ppm處的波峰高而窄，表示肝素鈉含量高，在2.02ppm處和2.07ppm處峰分別有極小的峰波，表示樣品中的硫酸軟骨素和硫酸皮膚素含量很低，由此說明本發(fā)明方法所制備的肝素鈉產(chǎn)品純度高，完全達(dá)到市場(chǎng)收購(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)要求。

肝素鈉活性檢測(cè)：

對(duì)實(shí)施例1-5得到的肝素鈉，取樣采用綿羊血漿法進(jìn)行活性（效價(jià)）檢測(cè)，并與申請(qǐng)?zhí)枮镃N201110161138.6的專利進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果如表1所示。

從表1中可以看出，本發(fā)明方法所制備的肝素鈉，活性高，單位效價(jià)達(dá)到每毫克120U以上，較對(duì)比例提高40%-80%，每公斤肺可提取肝素鈉效價(jià)在22萬(wàn)U以上，肝素鈉收率較對(duì)比例提高20%以上。

綜上所述，本發(fā)明方法在肝素萃取前，對(duì)肺漿液進(jìn)行酶解脫脂處理，避免了過多的油脂對(duì)離子交換中樹脂的干擾，大大提高了樹脂的吸附能力和利用率,在肝素萃取、純化過程中，采用鹽解與酶解相結(jié)合，酸處理與堿處理相結(jié)合，復(fù)沉與乙醇分級(jí)沉淀相結(jié)合，最大限度地使肝素與蛋白質(zhì)解離，較為徹底地去除了蛋白質(zhì)、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素等雜質(zhì)，使肝素鈉成品的純度、活性和收率都有大幅度提高，獲得了較理想的提取效果。所制備的肝素鈉成品單位效價(jià)在120U/mg以上，肝素鈉收率達(dá)到22萬(wàn)U/kg肺以上。

盡管已用具體實(shí)施例來(lái)說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。