本發(fā)明屬于植物基因
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是一種新疆野蘋果miR156表達(dá)量的檢測方法。
背景技術(shù)：
：新疆野蘋果(Malussieversii(Ledeb.)Roem.)又名塞威氏蘋果，是薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)的多年生野生果樹，在我國主要分布在新疆的伊犁地區(qū)。新疆野蘋果地處西部山區(qū)，受環(huán)境影響，在花期和果期經(jīng)常會遇到干旱、低溫、酷熱等不良環(huán)境的影響，從而導(dǎo)致花粉敗育、結(jié)實(shí)率低，進(jìn)而影響下一年實(shí)生苗的繁殖與發(fā)育，從而嚴(yán)重影響整個新疆野蘋果林的種群結(jié)構(gòu)。MiR156與植物的生長發(fā)育相關(guān)，尤其在營養(yǎng)生長和生殖生長的時相轉(zhuǎn)變調(diào)控中起到關(guān)鍵作用，因此，采用合適的方法檢測不同發(fā)育時期以及不同生長特性新疆野蘋果的miR156表達(dá)量，對后期新疆野蘋果雜交育種、遺傳改良實(shí)踐具有重要意義。通過檢索，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明專利申請相關(guān)的專利公開文獻(xiàn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種新疆野蘋果miR156表達(dá)量的檢測方法，本方法為首次對新疆野蘋果小RNA提取的新方法，該方法可以為檢測木本植物小RNA表達(dá)情況提供參考，對研究營養(yǎng)生長和生殖生長時相轉(zhuǎn)變調(diào)控網(wǎng)具有參考意義，同時，也可以為后期新疆野蘋果雜交育種、遺傳改良實(shí)踐提供理論依據(jù)。本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種新疆野蘋果miR156表達(dá)量的檢測方法，步驟如下：(一)總RNA提取總RNA采用CTAB法提取，具體步驟如下：⑴取不同樹齡的新疆野蘋果的葉片或愈傷組織，將其在液氮中充分研磨成粉狀；⑵取粉末置于加有裂解液1的離心管中，粉末與裂解液1的比例g：μL為1：8000，渦旋混勻，60-70℃溫育8-15min，期間上下顛倒混勻2-3次；所述裂解液1的組成成分及比例如下：100mMpH8.0Tris-HCl；25mMEDTA；2MNaCl；質(zhì)量終濃度為2％的CTAB；質(zhì)量終濃度為2％的PVP；質(zhì)量終濃度為0.5％的spermidine；體積終濃度為2％的β-mercaptoethanol；⑶再加入三氯甲烷，三氯甲烷與裂解液1的體積比為1：1，渦旋混勻，室溫放置5min；⑷13000rpm4℃離心10min；⑸吸上清于新的離心管中，加入上清體積1/5的三氯甲烷，渦旋混勻，室溫放置5-10min；⑹10000-13000rpm4℃離心13-18min，吸上清于新的離心管中，加入上清兩倍體積的異丙醇，輕柔混勻；⑺10000-13000rpm4℃離心13-18min,棄上清，得沉淀；⑻加入17μLRNase-FreeWater于離心管中，加入10×DNaseI緩沖液2μL，DnaseI1μL，37℃溫浴10-20min；⑼加入總體積兩倍體積的異丙醇，10000-13000rpm4℃離心13-18min，棄上清，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80％的乙醇清洗沉淀2-3次；⑽待乙醇完全揮發(fā)后，加入30-50μLRNase-FreeWater，即得總RNA，將總RNA立即電泳檢測，檢測質(zhì)量合格后，備用；(二)反轉(zhuǎn)錄(A)反轉(zhuǎn)錄的總RNA質(zhì)量為1μg，體系為10μL，內(nèi)參基因的反轉(zhuǎn)錄為polyA加尾法，miR156反轉(zhuǎn)錄為頸環(huán)引物法，引物如下：⑴內(nèi)參基因反轉(zhuǎn)錄體系：⑵miR156反轉(zhuǎn)錄體系：(B)將混合物進(jìn)行70-80℃、5-8min預(yù)變性，完成后取出置于冰上；待其冷卻后，迅速離心，轉(zhuǎn)速500-3000r/min，離心20s，，將液體全部收集于管底；(C)配制反轉(zhuǎn)錄體系，向每個樣品加入以下10μL：(D)設(shè)置反轉(zhuǎn)錄程序，包括退火、延伸、逆轉(zhuǎn)錄酶失活三步：該程序完成后，得到完整cDNA；(三)qRT-PCR檢測：(A)試劑：SYBRGreen混合液；(B)儀器：定量PCR儀；(C)2個內(nèi)參基因，1個目的基因，引物如下：(D)qRT-PCRR體系，將cDNA模板稀釋2倍使用：(E)反應(yīng)程序：+熔解曲線；(四)對qRT-PCR獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行法分析，在excel表中作柱狀圖，得到目的基因新疆野蘋果miR156的相對表達(dá)量。而且，所述步驟(一)⑴中不同樹齡為生長1年、2年、3年、5年、6年或者幾十年；或者，所述步驟(一)⑴中葉片為新疆野蘋果的新生當(dāng)年生枝條距頂端10cm的葉片；或者，所述步驟(一)⑴中愈傷組織為：取新疆野蘋果的當(dāng)年生枝條，取葉片進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得的愈傷組織。而且，所述步驟(三)(D)中cDNA模板稀釋2倍后，每個樣做三個重復(fù)。而且，所述步驟(一)⑴中新疆野蘋果生長于新疆維吾爾自治區(qū)伊犁新源野果林。本發(fā)明取得的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：1、本方法為首次對新疆野蘋果小RNA提取的新方法，該方法可以為檢測木本植物小RNA表達(dá)情況提供參考，對研究營養(yǎng)生長和生殖生長時相轉(zhuǎn)變調(diào)控網(wǎng)具有參考意義，同時，也可以為后期新疆野蘋果雜交育種、遺傳改良實(shí)踐提供理論依據(jù)。2、本方法以Ms-Actin和Ms-18SrRNA為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR檢測新疆野蘋果miR156表達(dá)量，將不同樹齡新疆野蘋果的葉片或愈傷組織提取總RNA，PolyA加尾法和頸環(huán)引物法反轉(zhuǎn)RNA獲得cDNA，完成實(shí)時熒光定量PCR，方便簡單、操作方便，提高了檢測效率。3、本方法確定了miR156的最佳反轉(zhuǎn)錄條件及體系；確定了兩個穩(wěn)定性較強(qiáng)的內(nèi)參基因序列及引物序列；明確了miR156定量表達(dá)檢測的最適合條件及體系；發(fā)現(xiàn)了新疆野蘋果愈傷組織使用此方法可以提取總RNA；確定了保存時間在兩年以上的葉片材料仍可以提取出較完整的RNA。附圖說明圖1為本發(fā)明中RNA純度質(zhì)量檢測結(jié)果圖；圖2為本發(fā)明中不同年份的野蘋果材料的miR156的表達(dá)量分析圖(其中，橫坐標(biāo)為野蘋果材料的不同年份，縱坐標(biāo)為miR156的相對表達(dá)量)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明；下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明中所使用的原料，如無特殊說明，均為常規(guī)的市售產(chǎn)品；本發(fā)明中所使用的方法，如無特殊說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。實(shí)施例1一種新疆野蘋果miR156表達(dá)量的檢測方法，步驟如下：利用CTAB法提取新疆野蘋果葉片和愈傷組織總RNA，PolyA加尾法和頸環(huán)引物法反轉(zhuǎn)RNA獲得cDNA，2倍稀釋cDNA模板后(最好每個樣共取6μLcDNA做三個技術(shù)重復(fù))，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。具體步驟如下：(一)總RNA提取總RNA采用CTAB法提取，具體步驟如下：1、取不同樹齡的新疆野蘋果的葉片或愈傷組織，將其在液氮中充分研磨成粉狀。2、取0.1g粉末置于加有800μL裂解液1的離心管中，渦旋混勻，65℃溫育10min，期間上下顛倒混勻2-3次。其中，所述裂解液1的組成成分及比例如下：100mMpH8.0Tris-HCl；25mMEDTA；2MNaCl；質(zhì)量終濃度為2％的CTAB；質(zhì)量終濃度為2％的PVP(聚乙烯吡咯烷酮，Polyvinylpyrrolidone)；質(zhì)量終濃度為0.5％的spermidine(三鹽酸亞精胺)；體積終濃度為2％的β-mercaptoethanol(β-巰基乙醇)；3、再加入800μL三氯甲烷，渦旋混勻，室溫放置5min。4、13000rpm4℃離心10min；5、吸上清于新的離心管中，加入上清體積1/5的三氯甲烷，渦旋混勻，室溫放置5min。6、13000rpm4℃離15min，吸上清于新的2ml離心管中，加入上清兩倍體積的異丙醇，輕柔混勻。7、10000-13000rpm4℃離13-18min,棄上清；8、加入17μL的RNase-FreeWater于離心管中，加入10×DNaseI緩沖液2μL，DnaseI1μL，37℃溫浴15min；9、加入總體積兩倍體積的異丙醇，10000-13000rpm4℃離心13-18min，棄上清，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80％的乙醇清洗2-3次；10、待乙醇完全揮發(fā)后，加入30-50μLRNase-FreeWater，即得總RNA，將總RNA立即電泳檢測，檢測質(zhì)量合格后，備用；RNA質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)如下：取所提取的RNA溶液1μL，于nanodrop微量分光光度計中測定OD吸光值及濃度，當(dāng)OD260/280比值介于1.8-2.0之間時，說明RNA中污染蛋白等物質(zhì)較少，OD260/230比值大于1.8時，說明無機(jī)鹽離子較少，RNA純度適合后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取4μLRNA溶液電泳檢測完整性，當(dāng)檢測圖如圖1所示，獲得完整銳利的28s和18srRNA條帶，且28srRNA的亮度大于等于18srRNA的兩倍時，所提取總RNA完整度較好。(二)反轉(zhuǎn)錄(A)反轉(zhuǎn)錄的總RNA質(zhì)量為1μg，體系為10μL，內(nèi)參基因的反轉(zhuǎn)錄為polyA加尾法，miR156反轉(zhuǎn)錄為頸環(huán)引物法。引物如下：1、內(nèi)參基因反轉(zhuǎn)錄體系：2、miR156反轉(zhuǎn)錄體系：(B)將混合物進(jìn)行70℃、5min預(yù)變性，完成后取出置于冰上。待其冷卻后，迅速離心，轉(zhuǎn)速500-3000r/min，離心20s，將液體全部收集于管底。(C)配制反轉(zhuǎn)錄體系，向每個樣品加入以下10μL：(D)設(shè)置反轉(zhuǎn)錄程序，包括退火、延伸、逆轉(zhuǎn)錄酶失活三步。該程序完成后將得到完整cDNA。(若需保存，可放－20℃)(三)qRT-PCR檢測：(A)試劑：SYBRGreen混合液(SYBRGreenPCRMasterMix)(B)儀器：定量PCR儀(C)2個內(nèi)參基因，1個目的基因，引物如下：Malus×domesticaactin-FGTCCGTGGAGAAGAGTTACMalus×domesticaactin-RATGGATGGCTGGAAGAGG18SrRNA-FATAAACGATGCCGACCAG18SrRNA-RCCTTGCGACCATACTCCCmiR156-FAGAAGACAGTGGGTCGACCTCACAmiR156-RAACTGGTGTCGTGGAG(D)qRT-PCRR體系：(將cDNA模板稀釋2倍使用，)(E)反應(yīng)程序：+熔解曲線；(四)對qRT-PCR獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行法分析，在excel表中作柱狀圖，得到目的基因新疆野蘋果miR156的相對表達(dá)量。上述新疆野蘋果生長于新疆維吾爾自治區(qū)伊犁新源野果林，待新疆野蘋果植株生長1年、2年、3年、5年、6年甚至幾十年，分別取其新生當(dāng)年生枝條距頂端10cm左右的葉片至液氮中，或取當(dāng)年生枝條帶回實(shí)驗(yàn)室處理，取葉片進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得愈傷組織。CTAB法提取組織總RNA檢測質(zhì)量合格后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(PolyA加尾法和頸環(huán)引物法)獲得cDNA模板，2倍稀釋cDNA模板后可以每個樣共取6μLcDNA做三個技術(shù)重復(fù)，完成實(shí)時熒光定量，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得到目的基因的相對表達(dá)量。分析結(jié)果如圖2所示，由圖2可以看出，不同年份的野蘋果材料，miR156的表達(dá)量隨年份變化而呈現(xiàn)不同的表達(dá)水平。實(shí)施例2一種新疆野蘋果miR156表達(dá)量的檢測方法，步驟如下：(一)總RNA提取總RNA采用CTAB法提取，具體步驟如下：⑴取不同樹齡的新疆野蘋果的葉片或愈傷組織，將其在液氮中充分研磨成粉狀；⑵取粉末置于加有裂解液1的離心管中，粉末與裂解液1的比例g：μL為1：8000，渦旋混勻，60-70℃溫育8-15min，期間上下顛倒混勻2-3次；所述裂解液1的組成成分及比例如下：100mMpH8.0Tris-HCl；25mMEDTA；2MNaCl；質(zhì)量終濃度為2％的CTAB；質(zhì)量終濃度為2％的PVP；質(zhì)量終濃度為0.5％的spermidine；體積終濃度為2％的β-mercaptoethanol；⑶再加入三氯甲烷，三氯甲烷與裂解液1的體積比為1：1，渦旋混勻，室溫放置5min；⑷13000rpm4℃離心10min；⑸吸上清于新的離心管中，加入上清體積1/5的三氯甲烷，渦旋混勻，室溫放置5-10min；⑹10000-13000rpm4℃離心13-18min，吸上清于新的離心管中，加入上清兩倍體積的異丙醇，輕柔混勻；⑺10000-13000rpm4℃離心13-18min,棄上清，得沉淀；⑻加入17μLRNase-FreeWater于離心管中，加入10×DNaseI緩沖液2μL，DnaseI1μL，37℃溫浴10-20min；⑼加入總體積兩倍體積的異丙醇，10000-13000rpm4℃離心13-18min，棄上清，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80％的乙醇清洗沉淀2-3次；⑽待乙醇完全揮發(fā)后，加入30-50μLRNase-FreeWater，即得總RNA，將總RNA立即電泳檢測，檢測質(zhì)量合格后，備用；其檢測結(jié)果同實(shí)施例1；(二)反轉(zhuǎn)錄(A)反轉(zhuǎn)錄的總RNA質(zhì)量為1μg，體系為10μL，內(nèi)參基因的反轉(zhuǎn)錄為polyA加尾法，miR156反轉(zhuǎn)錄為頸環(huán)引物法，引物如下：⑴內(nèi)參基因反轉(zhuǎn)錄體系：⑵miR156反轉(zhuǎn)錄體系：(B)將混合物進(jìn)行70-80℃、5-8min預(yù)變性，完成后取出置于冰上；待其冷卻后，迅速離心，轉(zhuǎn)速500-3000r/min，離心20s，將液體全部收集于管底；(C)配制反轉(zhuǎn)錄體系，向每個樣品加入以下10μL：(D)設(shè)置反轉(zhuǎn)錄程序，包括退火、延伸、逆轉(zhuǎn)錄酶失活三步：該程序完成后，得到完整cDNA；(三)qRT-PCR檢測：(A)試劑：SYBRGreen混合液；(B)儀器：定量PCR儀；(C)2個內(nèi)參基因，1個目的基因，引物如下：Malus×domesticaactin-FGTCCGTGGAGAAGAGTTACMalus×domesticaactin-RATGGATGGCTGGAAGAGG18SrRNA-FATAAACGATGCCGACCAG18SrRNA-RCCTTGCGACCATACTCCCmiR156-FAGAAGACAGTGGGTCGACCTCACAmiR156-RAACTGGTGTCGTGGAG(D)qRT-PCRR體系，將cDNA模板稀釋2倍使用：(E)反應(yīng)程序：+熔解曲線；(四)對qRT-PCR獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行法分析，在excel表中作柱狀圖，得到目的基因新疆野蘋果miR156的相對表達(dá)量。而且，所述步驟(一)⑴中不同樹齡為生長1年、2年、3年、5年、6年或者幾十年；或者，所述步驟(一)⑴中葉片為新疆野蘋果的新生當(dāng)年生枝條距頂端10cm的葉片；或者，所述步驟(一)⑴中愈傷組織為：取新疆野蘋果的當(dāng)年生枝條，取葉片進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得的愈傷組織。而且，所述步驟(三)(D)中cDNA模板稀釋2倍后，每個樣做三個重復(fù)。而且，所述步驟(一)⑴中新疆野蘋果生長于新疆維吾爾自治區(qū)伊犁新源野果林。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明的技術(shù)方案作任何形式上的限制。凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3