技術特征：

1.一種新疆野蘋果miR156表達量的檢測方法，其特征在于：步驟如下：

(一)總RNA提取

總RNA采用CTAB法提取，具體步驟如下：

⑴取不同樹齡的新疆野蘋果的葉片或愈傷組織，將其在液氮中充分研磨成粉狀；

⑵取粉末置于加有裂解液1的離心管中，粉末與裂解液1的比例g：μL為1：8000，渦旋混勻，60-70℃溫育8-15min，期間上下顛倒混勻2-3次；

所述裂解液1的組成成分及比例如下：

100mM pH 8.0Tris-HCl；

25m MEDTA；

2M NaCl；

質量終濃度為2％的CTAB；

質量終濃度為2％的PVP；

質量終濃度為0.5％的spermidine；

體積終濃度為2％的β-mercaptoethanol；

⑶再加入三氯甲烷，三氯甲烷與裂解液1的體積比為1：1，渦旋混勻，室溫放置5min；

⑷13000rpm 4℃離心10min；

⑸吸上清于新的離心管中，加入上清體積1/5的三氯甲烷，渦旋混勻，室溫放置5-10min；

⑹10000-13000rpm 4℃離心13-18min，吸上清于新的離心管中，加入上清兩倍體積的異丙醇，輕柔混勻；

⑺10000-13000rpm 4℃離心13-18min,棄上清，得沉淀；

⑻加入17μLRNase-Free Water于離心管中，加入10×DNase I緩沖液2μL，Dnase I 1μL，37℃溫浴10-20min；

⑼加入總體積兩倍體積的異丙醇，10000-13000rpm 4℃離心13-18min，棄上清，使用質量分數(shù)為80％的乙醇清洗沉淀2-3次；

⑽待乙醇完全揮發(fā)后，加入30-50μLRNase-Free Water，即得總RNA，將總RNA立即電泳檢測，檢測質量合格后，備用；

(二)反轉錄

(A)反轉錄的總RNA質量為1μg，體系為10μL，內參基因的反轉錄為polyA加尾法，miR156反轉錄為頸環(huán)引物法，引物如下：

⑴內參基因反轉錄體系：

⑵miR156反轉錄體系：

(B)將混合物進行70-80℃、5-8min預變性，完成后取出置于冰上；待其冷卻后，迅速離心，轉速500-3000r/min，離心20s，，將液體全部收集于管底；

(C)配制反轉錄體系，向每個樣品加入以下10μL：

(D)設置反轉錄程序，包括退火、延伸、逆轉錄酶失活三步：

該程序完成后，得到完整cDNA；

(三)qRT-PCR檢測：

(A)試劑：SYBR Green混合液；(B)儀器：定量PCR儀；(C)2個內參基因，1個目的基因，引物如下：

Malus×domesticaactin-FGTCCGTGGAGAAGAGTTACMalus×domesticaactin-RATGGATGGCTGGAAGAGG18SrRNA-FATAAACGATGCCGACCAG18SrRNA-RCCTTGCGACCATACTCCCmiR156-FAGAAGACAGTGGGTCGACCTCACAmiR156-RAACTGGTGTCGTGGAG

(D)qRT-PCRR體系，將cDNA模板稀釋2倍使用：

(E)反應程序：

(四)對qRT-PCR獲得的數(shù)據(jù)進行2^－△△Ct法分析，在excel表中作柱狀圖，得到目的基因新疆野蘋果miR156的相對表達量。

2.根據(jù)權利要求1所述的新疆野蘋果miR156表達量的檢測方法，其特征在于：所述步驟(一)⑴中不同樹齡為生長1年、2年、3年、5年、6年或者幾十年；或者，所述步驟(一)⑴中葉片為新疆野蘋果的新生當年生枝條距頂端10cm的葉片；或者，所述步驟(一)⑴中愈傷組織為：取新疆野蘋果的當年生枝條，取葉片進行組織培養(yǎng)獲得的愈傷組織。

3.根據(jù)權利要求1所述的新疆野蘋果miR156表達量的檢測方法，其特征在于：所述步驟(三)(D)中cDNA模板稀釋2倍后，每個樣做三個重復。

4.根據(jù)權利要求1所述的新疆野蘋果miR156表達量的檢測方法，其特征在于：所述步驟(一)⑴中新疆野蘋果生長于新疆維吾爾自治區(qū)伊犁新源野果林。