本發(fā)明屬于分子標記檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于黃瓜‘粵青1號’雜交種子純度鑒定的引物及方法。

背景技術(shù)：

種子質(zhì)量是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要元素，其質(zhì)量的優(yōu)劣程度直接影響農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量。品種的純度和真?zhèn)舞b定是以形態(tài)學(xué)標記為依據(jù)，這種鑒定方法從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)角度具有穩(wěn)定可靠的優(yōu)點，但從遺傳學(xué)角度看，品種的純度和真?zhèn)舞b定是實質(zhì)上是對品質(zhì)基因型的鑒定，只有通過鑒定DNA分子本身才能準確可靠的鑒定品種的基因型。傳統(tǒng)的品種純度鑒定方法時間跨度大，容易受環(huán)境和人為因素的影響，效率低。

黃瓜是世界上重要的蔬菜作物。有限的親本資源以及雜交品種的不斷涌現(xiàn),使得品種間尤其是雜交種子之間的遺傳差異越來越小,蔬菜種子的真實性與品種純度鑒定也越來越難，加之黃瓜為自花授粉作物，人工去雄不及時，常會出現(xiàn)假雜種，導(dǎo)致種子遺傳純度下降，給生產(chǎn)造成巨大損失。

“粵青1號”黃瓜是以YC-5為母本，B11為父本育成的華北型黃瓜一代雜種。具有生長勢強，產(chǎn)量高，抗病抗逆型強的特點。是華南地區(qū)推廣面積較多的品種。為了保證優(yōu)良品種發(fā)產(chǎn)生最大的經(jīng)濟效益，因此一種快速、準確、有效的品種鑒定方法非常重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可用于快速鑒定黃瓜‘粵青1號’雜交種子純度的引物及方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種用于黃瓜‘粵青1號’雜交種子純度鑒定的SSR引物，其可以在黃瓜‘粵青1號’雜交種子中擴增出189 bp的母本特異標記，226 bp的父本特異標記。

所述母本特異標記的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，父本特異標記的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述SSR引物的核苷酸序列如下所示：

85F: 5’-TCACACCTGCATTTTTCATCA-3’（SEQ ID NO .1）；

85R: 5’-GAGGCGTTCTCAACATACCC-3’（SEQ ID NO.2）。

黃瓜‘粵青1號’雜交種子純度的鑒定方法，包括如下步驟：

（1）提取黃瓜幼苗基因組DNA；

（2）以黃瓜基因組DNA為模板，使用權(quán)利要求1-3任一項所述的SSR引物進行PCR擴增；

（3）對擴增的產(chǎn)物進行凝膠電泳；

（4）對電泳結(jié)果進行分析，只有同時具有母本和父本特異性條帶的單株才為真正的雜交種，缺少其中的任意一條帶記為假雜種，計算種子純度，其中，SSR引物產(chǎn)生189 bp的母本特異標記， 226 bp的父本特異標記。

PCR擴增的20μl反應(yīng)體系為：基因組DNA 5ng，10×buffer（+Mg²⁺)2μl，dNTP 0.2mmol·L^-1，SSR引物0.25 mmol·L^-1，Taq 酶0.2U。

PCR擴增的程序為：94℃預(yù)變性5min后，94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，30個循環(huán)后，72℃保持7min，然后置于4℃保存待檢測。

所述凝膠電泳為8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的方法可將‘粵青1號’雜交種子與其母本、父本種子區(qū)分開來，快速檢測出雜交種子的純度。本方法具有快速、準確、低成本，操作簡單等優(yōu)點，能夠替代傳統(tǒng)雜交種子純度鑒定的方法，具有較高的商業(yè)應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為SSR引物對黃瓜‘粵青1號’種子純度鑒定PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜（YC-5：母本；B11：父本；F1-1--F1-4：雜交一代種子）；

圖2為46株‘粵青1號’雜交種子的檢測結(jié)果，準確率為100%。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。

實施例1 雜交黃瓜‘粵青1號’種子純度檢測方法的建立。

1、篩選純度鑒定的SSR引物。

從所公布的黃瓜SSR引物在親間進行篩選，選出共顯性差異標記條帶的85號引物，其序列如下所示：

85F: 3’-TCACACCTGCATTTTTCATCA-5’(SEQ ID NO.1)；

85R: 3’-GAGGCGTTCTCAACATACCC-5’ (SEQ ID NO.2).

兩種標記帶型清晰、重復(fù)性好。引物能產(chǎn)生的母本特異性標記和的父本特異性標記。

2、利用上述特異性引物對雜交黃瓜‘粵青1號’種子進行純度鑒定。

（1）黃瓜DNA的提取

實驗材料為黃瓜‘粵青1號’商品種及其母本YC-5、父本B11子葉DNA。步驟如下：

①用液氮在2ml的離心管內(nèi)用研杵研磨，在液氮快蒸發(fā)干時迅速加入1000μl 2%CTAB提取緩沖液，混勻后置于65℃水浴中溫浴50min（每隔5min搖動一次）。

②靜置至室溫后在4℃下12000rpm離心10min，將上清（約800μl）轉(zhuǎn)移到新的2ml 離心管。

③加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），顛倒混勻，靜置3-5分鐘，在4℃ 下12000rpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5ml 離心管中。

④加2/3體積340μl預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻（緩慢顛倒20次），置于－20℃下培養(yǎng)30min。

⑤在4℃下13000rpm離心10min，棄上清，加入200-300μl預(yù)冷的 70%乙醇洗滌DNA沉淀（兩次），微干。

⑥加入100μl無菌水溶解。

（2）SSR-PCR 擴增：

PCR體系（20μl）

DNA模板：5ng

引物-F：0.25 mmol·L^-1

引物-R：0.25 mmol·L^-1

dNTP：0.2mmol·L^-1

10×PCR(Mg²⁺) buffer：2.0μl

Taq酶：0.2U

ddH₂0補足至20μl

PCR擴增程序

94℃預(yù)變性5min后，94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，30個循環(huán)后，72℃保持7min，然后置于20℃保存待檢測。

（3）凝膠電泳

擴增產(chǎn)物在雙垂直非變性濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，120V穩(wěn)壓1.5個小時，電泳結(jié)束后進行0.1%AgNO₃銀染15min；銀染后用2%NaOH、0.4%甲醛、0.04%Na₂CO₃顯色，顯色后在燈箱上拍照分析。

（4）擴增結(jié)果

85號引物在黃瓜‘粵青1號’母本中擴增出a條帶，在父本中擴增出b條帶，在黃瓜‘粵青1號’雜交一代種子擴增出兩條特異條帶(見圖1）。

回收特異條帶，送英俊公司測序。a條帶的序列如SEQ ID NO.3所示，b條帶的序列如SEQ ID NO.4所示。雜交種子中與父本、母本擴增產(chǎn)物的序列相符。

實施例2

采用實施例1的方法對從白云基地的種子純度鑒定田取的46株‘粵青1號’，對其單株編號，提取單株DNA進行檢測（見圖2），檢測結(jié)果兩個引物檢測結(jié)果一致，種子純度為100%，與田間調(diào)查結(jié)果一致，準確率為100%。

以上實施例表明，本發(fā)明的方法可將‘粵青1號’雜交種子與其父母本種子進行有效區(qū)分，快速、準確檢測出種子純度。

<110> 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所

<120> 用于黃瓜'粵青1號'雜交種子純度鑒定的引物及方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcacacctgc atttttcatc a 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaggcgttct caacataccc 20

<210> 3

<211> 189

<212> DNA

<213> 黃瓜（Cucumis sativus L.）

<400> 3

gaaaagcatt gatatgagta tgatatgaat atgaatatga atatgaatat gaacatgaac 60

atgaacatga gtagagagtt tcattgtttt atctgatcat ttgcttcaac cttacctatc 120

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<210> 4

<211> 226

<212> DNA

<213> 黃瓜（Cucumis sativus L.）

<400> 4

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