本發(fā)明屬于有機(jī)近紅外熒光染料制備領(lǐng)域，具體涉及一種發(fā)射近紅外熒光的共軛苯并噻唑衍生物及其制備方法與熒光成像應(yīng)用。

背景技術(shù)：

熒光技術(shù)具有簡(jiǎn)單快速、無(wú)損檢測(cè)、靈敏度高、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和可視化球像等特點(diǎn)而備受關(guān)注。特別在生物熒光成像方面發(fā)展迅速，熒光探針技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為動(dòng)態(tài)監(jiān)控活體細(xì)胞及醫(yī)學(xué)診斷成像的重要工具之一。但由于生物體自身的背景熒光干擾，必須發(fā)展熒光發(fā)射波長(zhǎng)在近紅外區(qū)域(650-900nm)的熒光染料，這樣不僅可降低生物背景熒光干擾，而且其對(duì)生物組織樣品具有較低的光損傷和較深的組織穿透能力。目前已發(fā)展的近紅外有機(jī)熒光染料要么其斯托克斯位移一般較小，為10-20nm左右，會(huì)導(dǎo)致部分發(fā)射光能被自吸收，造成熒光淬滅；要么熒光量子產(chǎn)率低，小于10％，這些都會(huì)造成生物熒光成像中的對(duì)比度大大下降。因此發(fā)展具有大斯托克斯位移和高量子產(chǎn)率的近紅外有機(jī)熒光染料，將可極大地提高熒光成像的精確度，是非常必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種斯托克斯位移大、熒光發(fā)射量子產(chǎn)率高的近紅外熒光探針及其制備方法與熒光成像應(yīng)用。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種共軛苯并噻唑衍生物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)為：

本發(fā)明還提供了上述的共軛苯并噻唑衍生物的制備方法，其特征在于，包括：

步驟1：惰性氣體保護(hù)下，將4-甲基苯酚與六次甲基四胺在三氟乙酸中70-75℃回流反應(yīng)12-48小時(shí)，冷卻至室溫，并傾入水中，用氯仿萃取2-4次，合并有機(jī)相并旋蒸除去氯仿，得到3，5-二甲?；?4-甲基苯酚；

步驟2：惰性氣體保護(hù)下，將步驟1中所得3，5-二甲?；?4-甲基苯酚與2-甲基苯并噻唑在醋酸酐中140-145℃回流6-24小時(shí)，冷卻后加入氫氧化鈉，在80-95℃攪拌0.5-1.5小時(shí)，冷卻至室溫，用濃鹽酸調(diào)pH＝6-7，過(guò)濾，將所得固體通過(guò)硅膠色譜層析柱純化，即得共軛苯并噻唑衍生物。

優(yōu)選地，所述的步驟1中的4-甲基苯酚、六次甲基四胺、三氟乙酸的配比為1mmol∶2mmol∶1ml。

優(yōu)選地，所述的步驟2中的3，5-二甲酰基-4-甲基苯酚、2-甲基苯并噻唑、醋酸酐的配比為1mmol∶2mmol∶2ml。

優(yōu)選地，所述的步驟2中的硅膠色譜柱層析分離提純時(shí)洗脫劑為體積比為10∶1的正己烷和乙酸乙酯。

優(yōu)選地，所述的步驟2中的共軛苯并噻唑衍生物在二甲亞砜中的最大吸收波長(zhǎng)為340nm，最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)為690nm，熒光量子產(chǎn)率42％。具有發(fā)展近紅外熒光探針和用于生物熒光成像的應(yīng)用前景。

本發(fā)明還提供了一種近紅外熒光探針，其特征在于，其結(jié)構(gòu)為：

本發(fā)明還提供了上述的近紅外熒光探針的制備方法，其特征在于，包括：

將上述的共軛苯并噻唑衍生物溶于氯仿，在三乙胺存在下，滴加2，4-二硝基苯磺酰氯，室溫下攪拌4-8小時(shí)，加水后用氯仿萃取2-4次，合并有機(jī)相并旋蒸除去氯仿，所得粗產(chǎn)物經(jīng)通過(guò)硅膠色譜柱層析純化，即得近紅外熒光探針。

優(yōu)選地，所述的共軛苯并噻唑衍生物、2，4-二硝基苯磺酰氯、三乙胺的配比為1mmol∶2mmol∶1ml。

本發(fā)明還提供了上述的近紅外熒光探針的應(yīng)用方法，其特征在于，包括：將呈梯度變化的半胱氨酸的水溶液分別加入上述的近紅外熒光探針的磷酸緩沖溶液(含50％乙醇，pH＝7.4)，采用熒光光譜儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，以半胱氨酸濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度的變化為縱坐標(biāo)作圖，得到線性工作曲線，通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度即可從圖中讀出溶液中半胱氨酸的含量，其中激發(fā)波長(zhǎng)340nm，發(fā)射波長(zhǎng)670nm，響應(yīng)時(shí)間為20分鐘。

優(yōu)選地，所述的熒光光譜儀為Edinburgh FS5。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的共軛苯并噻唑衍生物是一種具有共軛結(jié)構(gòu)的新型苯并噻唑衍生物，具有熒光發(fā)射波長(zhǎng)位于近紅外區(qū)、熒光發(fā)射量子產(chǎn)率高、斯托克斯位移大、制備方法簡(jiǎn)單快速的特點(diǎn)，并可用于發(fā)展近紅外熒光探針來(lái)檢測(cè)半胱氨酸和進(jìn)行活體細(xì)胞熒光成像，在發(fā)展新型有機(jī)小分子近紅外熒光探針和高對(duì)比度生物熒光成像中具有重要應(yīng)用前景。

本發(fā)明制備的共軛苯并噻唑衍生物可發(fā)射近紅熒光(＞650nm)，具有斯托克斯位移大(＞200nm)、熒光發(fā)射量子產(chǎn)率高(＞10％)的特點(diǎn)。本發(fā)明涉及的近近紅外熒光探針對(duì)半胱氨酸具有高靈敏和高選擇性響應(yīng)，并可應(yīng)用于活體細(xì)胞熒光成像。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明所涉及的共軛苯并噻唑衍生物I和近紅外熒光探針I(yè)I的合成路線示意圖；

圖2為本發(fā)明所涉及的共軛苯并噻唑衍生物I在二甲亞砜中的吸收光譜和近紅外熒光光譜；

圖3為本發(fā)明所涉及的近紅外熒光探針I(yè)I對(duì)半胱氨酸(Cys)選擇性響應(yīng)的熒光光譜；

圖4為本發(fā)明所涉及的近紅外熒光探針I(yè)I對(duì)半胱氨酸的熒光滴定光譜(a)及相應(yīng)熒光強(qiáng)度與半胱氨酸濃度之間的線性關(guān)系(b)；

圖5為本發(fā)明涉及的近紅外熒光探針I(yè)I在活體L929細(xì)胞中對(duì)半胱氨酸的熒光成像圖，用熒光探針I(yè)I培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞明場(chǎng)(a)和暗場(chǎng)(b)圖像。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。

實(shí)施例1

一種共軛苯并噻唑衍生物，其結(jié)構(gòu)如式I，如圖1所示，其制備方法為：

(1)氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將4-甲基苯酚(15mmol)和六次甲基四胺(30mmol)溶于15ml三氟乙酸中，70-75℃回流反應(yīng)48小時(shí)，冷卻至室溫(25℃)，并傾入60ml水中，用氯仿萃取三次，合并有機(jī)相并旋蒸除去氯仿，固體烘干后得到3，5-二甲酰基-4-甲基苯酚，直接用于下一步反應(yīng)；

(2)氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將步驟(1)中所得3，5-二甲酰基-4-甲基苯酚(1mmol)與2-甲基苯并噻唑(2mmol)在2ml醋酸酐中140-145℃回流12小時(shí)，冷卻后加入氫氧化鈉1.5g，在80-95℃攪拌1小時(shí)，冷卻至室溫，用濃鹽酸調(diào)pH＝6-7，過(guò)濾，將過(guò)濾所得固體粗產(chǎn)物通過(guò)硅膠色譜層析柱純化，溶劑為乙酸乙酯，洗脫劑為10∶1的正己烷和乙酸乙酯，即得共軛苯并噻唑衍生物I，表征數(shù)據(jù)如下。

通過(guò)測(cè)試二甲亞砜中的吸收光譜和熒光光譜(圖2)，可見(jiàn)I發(fā)射近紅外熒光(690nm)，具有大的斯托克斯位移(＞200nm)和高的熒光量子產(chǎn)率(42％)。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)，δ(ppm)：9.88(s，1H)，8.11(d，J＝8Hz，2H)，8.04(s，1H)，7.99(t，J＝4Hz，3H)，7.69(s，2H)，7,59(d，J＝16Hz，2H)，7.53(t，J＝8Hz，2H)，7.45(t，J＝8Hz，2H)，2.34(s，3H)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)，δ(ppm)：167.48，153.99，134.48，133.12，129.27，125.19，122.94，122.63，122.10，20.67.MALDI-TOF-MS：m/z calcd 426.55；found 426.94.

實(shí)施例2

一種近紅外熒光探針，其結(jié)構(gòu)如式II，如圖1所示，其制備方法為：

將實(shí)施例1的共軛苯并噻唑衍生物(1mmol)溶于10ml氯仿，在三乙胺(1ml)存在下，滴加2，4-二硝基苯磺酰氯(2mmol)，室溫下攪拌6小時(shí)，加水20ml，用氯仿萃取三次，合并有機(jī)相并旋蒸除去氯仿，所得粗產(chǎn)物經(jīng)通過(guò)硅膠色譜柱層析純化，溶劑為乙酸乙酯，洗脫劑為10∶1的正己烷和乙酸乙酯，即得近紅外熒光探針I(yè)I，表征數(shù)據(jù)如下。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：8.32(s，1H)，8.26(d，J＝8Hz，1H)，8.10(s，1H)，8.07(t，J＝6Hz，2H)，7.91(d，J＝8Hz，2H)，7.72(d，J＝16Hz，2H)，7.60(t，J＝6Hz，4H)，7.51(t，J＝8Hz，2H)，7.39(d，J＝16Hz，2H)，2.52(s，3H)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：150.35，143.87，138.86，134.48，133.60，131.09，130.54，128.94，127.06，126.46，126.30，125.01，124.99，122.97，121.77，120.74，21.26.MALDI-TOF-MS：m/z calcd 656.71；found 656.62.

實(shí)施例3

近紅外熒光探針對(duì)半胱氨酸選擇性檢測(cè)和活體細(xì)胞熒光成像應(yīng)用。

將實(shí)施例2中所得近紅外熒光探針溶于PBS緩沖溶液(含50％乙醇，pH＝7.4)中配制成10μM的溶液，向溶液中分別加入常見(jiàn)的氨基酸(Ala，Arg，Asp，Cys，Glu，Gly，GSH，Hcy，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，Val)，采用Edinburgh FS5檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)340nm，可見(jiàn)只有半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)引起了熒光變化，響應(yīng)時(shí)間為20分鐘，其它氨基酸并沒(méi)有引起熒光的明顯變化；而且該熒光探針對(duì)半胱氨酸表現(xiàn)出最高靈敏度，因此可應(yīng)用于半胱氨酸的選擇性測(cè)定(圖3)。隨著半胱氨酸濃度的增加，熒光逐漸增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度和半光氨酸的濃度在0-20μM范圍內(nèi)具有線性關(guān)系(圖4)，線性回歸方程為Y＝0.03765X+0.1097，其中Y為670nm處的熒光強(qiáng)度，X為半光氨酸的濃度，據(jù)上述線性方程即可通過(guò)熒光強(qiáng)度的測(cè)定直接計(jì)算半光氨酸的濃度。

將實(shí)施例2中所得近紅外熒光探針與活體L929細(xì)胞(細(xì)胞個(gè)數(shù)為2萬(wàn)、探針濃度為10μM、培養(yǎng)基為10％胎牛血清、在5％CO₂和95％濕度，37℃條件下培養(yǎng)48小時(shí))培養(yǎng)30分鐘后，置于熒光顯微鏡下可清晰觀察到細(xì)胞(圖5)，表明該發(fā)明設(shè)計(jì)的熒光探針在近紅外生物熒光成像中具有重要的應(yīng)用前景。