本發(fā)明涉及家畜分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體來說，涉及一種鑒別地方豬品種與大白豬的結(jié)構(gòu)變異分子標(biāo)記技術(shù)。

背景技術(shù)：

自野豬被馴化以來，生存環(huán)境和人工選擇等因素造就了多種多樣的家豬品種，特別是地方豬品種的體型外貌、行為特征、生長繁殖性能等方面存在很大的差異(王亞楠，2015)。貴州地方豬品種體質(zhì)健壯、基因純和、肉質(zhì)香嫩、抗逆性強(qiáng)，耐粗飼(蔣會梅等，2012)，具有豐富的遺傳多樣性，源自歐洲的、已實(shí)現(xiàn)全球商品化的大白豬，在瘦肉率、生長速度等方面有明顯的優(yōu)勢。兩大類豬品種所具有的優(yōu)勢在實(shí)踐生產(chǎn)中將依據(jù)人類的需求進(jìn)行選擇性利用，是新品種選育的基礎(chǔ)。如何區(qū)分地方豬品種和歐洲商品豬，特別是在地方豬群體中甄別有沒有歐洲豬血統(tǒng)的摻入，當(dāng)前缺乏準(zhǔn)確的技術(shù)。

我們測定了香豬的全基因組序列，從中發(fā)現(xiàn)了一個結(jié)構(gòu)變異SV200。結(jié)構(gòu)變異(structural variations，SVs)包括基因組水平發(fā)生的片段的插入、缺失、倒位、重復(fù)、易位和拷貝數(shù)變異等(姜玥，2013)。研究表明，基因組結(jié)構(gòu)變異與個體的表型變異和疾病的發(fā)生有關(guān)。1976年發(fā)現(xiàn)果蠅棒眼的形成是由于bar基因發(fā)生了復(fù)制所致(Muller，1936)。通過第二代測序技術(shù)，從中國恒河猴(Chinese rhesus macaque)基因組中檢測出125150個結(jié)構(gòu)變異；這些結(jié)構(gòu)變異中有123610個缺失型變異，長度為25bp～10kb，其中63％的缺失位于基因的間隔區(qū)，35％位于基因中(Fang xiaodong，et al，2011)。從小鼠基因組鑒定出的711920個SVs中發(fā)現(xiàn)，98％的SV是缺失或插入類型，一半以上的SV是由逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子引起的(Binnaz Yalcinl，et al，2011)。人類發(fā)生A型血友病是由于F8基因發(fā)生倒位所致；SOX3基因缺失及340kb片段的插入，使病人出現(xiàn)X連鎖的隱性甲狀腺功能減退(何永蜀等，2009)。

本發(fā)明所述的結(jié)構(gòu)變異SV200位于基質(zhì)金屬蛋白酶15(matrix metallopeptidase 15,MMP-15)基因的內(nèi)含子5中。MMP-15屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)，是高度保守的、依賴于Zn²⁺等金屬離子的蛋白水解酶。MMPs幾乎能降解所有細(xì)胞外基質(zhì)成分，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)來維持基因的平衡，影響細(xì)胞的正常分化、遷移，參與血管生成、傷口愈合、胚胎形成及組織重構(gòu)等生理過程(丁巍等，2011)。從香豬基因組中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)變異SV200的功能不明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供一種鑒別地方豬品種的結(jié)構(gòu)變異SV200分子標(biāo)記。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種在地方豬品種群體中以缺失(D)為主的結(jié)構(gòu)變異SV200，缺失片段長度為155bp，序列是SEQ ID No.3，位于豬參考基因組Sscrofa 10.2的chr 6：17953135-17953289，MMP-15基因內(nèi)含子5中，將結(jié)構(gòu)變異SV200存在的兩種等位基因命名為D或A，分別對應(yīng)DD、AA和DA三種基因型。

本發(fā)明還提供用于檢測結(jié)構(gòu)變異SV200的一對引物，所述的引物分別為：上游引物F：5’-CCCTGTTCCTCCCATTGTCA-3’，下游引物R：5’-ATGGCCACCGTGTCAAAGTC-3’，目的序列分別為SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

本發(fā)明還提供所述結(jié)構(gòu)變異SV200在不同豬品種群體中的檢測方法。

該方法包括以下步驟：

(1)提取待測豬品種的基因組DNA；

(2)以待測樣品基因組DNA為模板，利用引物F和R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，以凝膠成像系統(tǒng)分析判斷基因型，分析待測樣品的豬品種。

步驟(2)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增的體系為20μL：2×Taq PCR Master Mix10μL，10μmol/L上游引物F 0.4μL，10μmol/L下游引物F 0.4μL，ddH₂O 8.2μL，10ng/μL基因組DNA 1μL；進(jìn)行PCR反應(yīng)采用的條件：1)預(yù)變性：94.0℃5min；2)擴(kuò)增反應(yīng)：變性：94.0℃30sec，退火：57℃30sec，延伸：72.0℃45sec，30個循環(huán)；72.0℃10min。

本發(fā)明進(jìn)一步提供所述結(jié)構(gòu)變異SV200鑒別地方豬品種群體的分子標(biāo)記的應(yīng)用技術(shù)。

前述的應(yīng)用包括以下步驟：

(1)應(yīng)用PCR技術(shù)檢測結(jié)構(gòu)變異SV200在不同豬品種群體中的基因型分布情況。

(2)采用SPSS v20.0進(jìn)行基因頻率的差異顯著性檢驗(yàn)，分析結(jié)構(gòu)變異SV200在5個地方豬品種和大白豬之間的差異。

(3)根據(jù)結(jié)構(gòu)變異SV200的基因型輔助鑒別豬品種。

本發(fā)明對6個豬品種群體中的結(jié)構(gòu)變異SV200進(jìn)行了檢測(表2)，5個地方豬品種群體均以DD和DA基因型為主，大白豬群體主要以AA和DA基因型為主；大白豬群體的D基因頻率明顯低于5個地方豬品種，經(jīng)SPSS v20.0軟件的χ2檢驗(yàn)分析，5個地方豬品種群體與大白豬的D基因頻率間的差異極顯著(P<0.01)，5個地方豬品種群體之間，D基因頻率的差異不大(P>0.05)。

將純合的DD和AA基因型擴(kuò)增條帶回收，克隆測序，與豬參考基因組Sscrofa 10.2進(jìn)行比對，確定結(jié)構(gòu)變異SV200的缺失片段長度為155bp，位于MMP-15內(nèi)含子5中。采用TRANSFAC等軟件分析，未能從155bp的缺失區(qū)域中找到轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)。

MMP-15基因編碼基質(zhì)金屬蛋白酶，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)。MMP-15又稱MT-MMP2，即膜型金屬蛋白酶-2，主要降解層粘蛋白(游紹莉等，2001)，在胚胎發(fā)育過程中MMPs廣泛表達(dá)，MMP15a基因在斑馬魚胚胎受精后一個細(xì)胞時期就開始表達(dá)(李艷歡等，2009)。在卵巢癌中，HLA-G與MMP-15基因的表達(dá)有很強(qiáng)的相關(guān)性，HLA-G參與腫瘤侵襲或腫瘤轉(zhuǎn)移，可能依賴于NK細(xì)胞毒性抑制和MMP-15基因表達(dá)的誘導(dǎo)(Wei huayan，2013)。MMP-15基因位于人類基因組16q13，從中發(fā)現(xiàn)多個SNP位點(diǎn)，rs12447804位點(diǎn)位于該基因的一個內(nèi)含子上，其C/T多態(tài)性與廣東潮汕人群阻塞性肺病的發(fā)病有關(guān)(鄧燕，2014)。人的MMP-15基因有2個轉(zhuǎn)錄本(參照Ensembl)。

本發(fā)明檢測了結(jié)構(gòu)變異SV200在6個豬品種群體中的分布情況，并對該結(jié)構(gòu)變異區(qū)域的進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，5個地方豬品種群體的SV200發(fā)生缺失(D基因)的頻率明顯高于大白豬的相應(yīng)值(P<0.01)，結(jié)構(gòu)變異SV200可作為鑒別地方豬品種的分子標(biāo)記，為地方豬品種的鑒別和輔助選育提供技術(shù)支持。

本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明提供的地方豬品種結(jié)構(gòu)變異SV200不受地方豬品種的年齡、性別、飼養(yǎng)條件等因素的限制。

(2)本發(fā)明建立的檢測地方豬品種結(jié)構(gòu)變異SV200的方法準(zhǔn)確可靠，操作簡便。

(3)地方豬品種結(jié)構(gòu)變異SV200分子標(biāo)記，可為地方豬品種的分子標(biāo)記輔助選育技術(shù)奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中結(jié)構(gòu)變異SV200的基因分型結(jié)果；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中地方豬品種結(jié)構(gòu)變異SV200基因頻率與大白豬的比較。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋，但不限定本發(fā)明的范圍，若無特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)方法和條件均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)方法和常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，或按照相關(guān)試劑廠商說明書建議的方法和條件。

實(shí)施例1豬結(jié)構(gòu)變異SV200的檢測技術(shù)，步驟如下：

1、提取基因組DNA

本發(fā)明采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取基因組DNA，具體方法如下：

1)處理材料

a、如果材料是血液，直接取200μL新鮮、冷凍或加入各種抗凝劑的血液，不足200μL可加緩沖液GA補(bǔ)足。

b、如果材料是組織，取50mg組織樣品剪碎，加入200μL緩沖液GA，震蕩至徹底懸浮。

2)加入20μLProteinase K溶液，混勻。

a、提取血液基因組時，只需加入Proteinase K溶液混勻，即可進(jìn)行下一步；

b、提取組織基因組時，加入Proteinase K溶液混勻后，56℃水浴直至組織顆粒全部溶解，瞬時離心去除管蓋內(nèi)壁的水珠，再進(jìn)行下一步。

3)加入200μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10min，溶液應(yīng)變清亮，瞬時離心去除內(nèi)壁水珠；

4)加入200μL無水乙醇，充分震蕩混勻15sec，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，瞬時離心以去除管蓋內(nèi)壁水珠；

5)將上步所得溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rmp離心30sec，倒掉廢液；

6)向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD(使用前需加入無水乙醇)，12000rmp離心30sec，倒掉；

7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前需加入無水乙醇)，12000rmp離心30sec，倒掉廢液；

8)重復(fù)操作步驟(7)一次；

9)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rmp離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

10)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加50-200μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12000rmp離心2min，將DNA溶液收集到離心管中；

11)為增加基因組DNA的得率，將離心得到的溶液再重復(fù)加入吸附柱CB3中，室溫放置2min，12000rpm離心2min，收集DNA溶液，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或-20℃保存。

2、目標(biāo)序列的擴(kuò)增

本發(fā)明所述的結(jié)構(gòu)變異SV200位于chr 6：17953135-17953289，參考NCBI Genbank收錄的相應(yīng)序列，使用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計(jì)兩條引物，上游引物F：5’-CCCTGTTCCTCCCATTGTCA-3’，下游引物R：5’-ATGGCCACCGTGTCAAAGTC-3’，目的片段分別為960bp和805bp，測序后得出目的序列分別為SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

PCR擴(kuò)增體系為20μL：2×Taq PCR Master Mix 10μL，10μmol/L上游引物F 0.4μL，10μmol/L下游引物F 0.4μL，ddH₂O 8.2μL，10ng/μL基因組DNA 1μL；進(jìn)行AS-PCR采用的反應(yīng)條件：1)預(yù)變性：94.0℃5min；2)擴(kuò)增反應(yīng)：變性：94.0℃30sec，退火：57℃30sec，延伸：72.0℃45sec，30個循環(huán)；72.0℃10min。

3、PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測及基因型判斷

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％的瓊脂糖電泳檢測，0.5μg/mL溴乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)記錄條帶。

每個樣品，若只擴(kuò)增出805bp的單條帶，將基因型定義為DD型；若擴(kuò)增出805bp和960bp的雙條帶，將基因型定義為DA型；若只擴(kuò)增出960bp的單條帶，將基因型定義為AA型(圖1)。

實(shí)施例2結(jié)構(gòu)變異SV200基因型在各豬品種中的分布及檢測應(yīng)用

按照實(shí)施例1的方法，試驗(yàn)材料如表1所示，以chr 6：17953135-17953289為候選結(jié)構(gòu)變異，命名為SV200，利用PCR技術(shù)檢測6個豬品種中結(jié)構(gòu)變異SV200的基因型(表2和圖2)，應(yīng)用SPSS v20.0軟件中的χ2檢驗(yàn)，分析結(jié)構(gòu)變異SV200的基因頻率。結(jié)果顯示，地方豬品種的結(jié)構(gòu)變異SV200以“缺失”基因(D)為主，大白豬以“正?！钡腁基因?yàn)橹?，地方豬品種與大白豬群體間的基因頻率差異極顯著(P<0.01)。

表1試驗(yàn)材料及來源統(tǒng)計(jì)表

表2結(jié)構(gòu)變異SV200的基因型和基因頻率

(備注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)；相同字母表示差異不顯著(P>0.05)