本發(fā)明涉及一種檢測(cè)胃癌miRNA表達(dá)水平的引物探針組和檢測(cè)產(chǎn)品，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：microRNA是一類內(nèi)源性、高度保守的非編碼小分子RNA，由單鏈RNA前體分子加工形成，長(zhǎng)度一般為18～23bp，合成時(shí)首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄成原始miRNA，然后由核糖核酸酶Ⅲ家族的Drosha酶切割形成miRNA前體，再經(jīng)核糖核酸酶Ⅲ家族的Dicer酶加工最終形成成熟的miRNA。人體內(nèi)存在大量miRNAs，這些成熟的miRNA能夠與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物結(jié)合，并與與其靶標(biāo)基因mRNA的3’端非編碼區(qū)結(jié)合，調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程，從而調(diào)控對(duì)應(yīng)靶蛋白的表達(dá)，組成了一系列的RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在腫瘤發(fā)生起著重要的作用。有些miRNA在腫瘤中上調(diào)，起類似癌基因作用，有些miRNA在腫瘤中下調(diào)，起抑癌基因的作用，對(duì)細(xì)胞的功能發(fā)生較大的影響。一種miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因，一個(gè)把標(biāo)基因也可以被多種miRNAs調(diào)控，通過調(diào)節(jié)靶基因蛋白表達(dá)影響細(xì)胞的增值、分化、凋亡、侵襲等過程，多項(xiàng)研究表明miRNA在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)。由于miRNA參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，以miRNA表達(dá)水平預(yù)測(cè)化療和放療療效的研究也逐步展開。胃癌是胃黏膜上皮和腺上皮發(fā)生的惡性腫瘤，是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居世界第四位，且死亡率居高不下，位于惡性腫瘤第二位。我國屬于胃癌高發(fā)的國家，是惡性腫瘤預(yù)防和控制的重點(diǎn)。胃癌的早期診斷目前仍是尚未完全攻克的難題，多無特異性癥狀，大約三分之二的患者在確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期或已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，胃癌進(jìn)展期患者的平均生存時(shí)間只有6-9個(gè)月。高特異性、敏感性及穩(wěn)定性的外周血診斷指標(biāo)對(duì)于胃癌的診斷、病情進(jìn)展和預(yù)后起著非常重要的作用。大量研究表明循環(huán)中的miRNA可作為許多腫瘤疾病的診斷指標(biāo)。一個(gè)特異性與敏感性兼?zhèn)涞臉?biāo)志物應(yīng)該能有助于早期發(fā)現(xiàn)胃癌，評(píng)估胃癌進(jìn)展與轉(zhuǎn)移情況，術(shù)后隨訪及評(píng)估藥物療效。鑒于miRNA能在血清/血漿中穩(wěn)定表達(dá)且已證明各類腫瘤中血清miRNA與正常對(duì)照組存在明顯差異，一種新的、早期的、無創(chuàng)或微創(chuàng)的高敏感性和高特異性的早期胃癌生物標(biāo)記物，用于胃癌的預(yù)防、病情監(jiān)測(cè)、早期診斷和治療，從而改善預(yù)后，這對(duì)降低胃癌發(fā)生率和死亡率均具有重要的意義。循環(huán)miRNA檢測(cè)方法與組織內(nèi)miRNA檢測(cè)方法相近。目前不同實(shí)驗(yàn)室采用檢測(cè)方法主要有：NorthernBlot法、高通量測(cè)序法、miRNA芯片和熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)法。測(cè)序技術(shù)結(jié)果最為可靠，有利于發(fā)現(xiàn)新的miRNA，但是測(cè)序方法價(jià)格較高。miRNA芯片雖然價(jià)格相對(duì)較低，但其重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差，只用于已知疾病相關(guān)miRNAs初篩。NorthernBlot方法繁雜并且靈敏度較低，不適用于臨床樣本的高通量檢測(cè)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可以快速、便捷、準(zhǔn)確地檢測(cè)作為胃癌早期診斷標(biāo)志物的miRNA的表達(dá)水平的胃癌檢測(cè)引物探針及其試劑盒。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是：一種胃癌檢測(cè)引物探針，包括用于逆轉(zhuǎn)錄hsa-mir-20a的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物a，用于逆轉(zhuǎn)錄hsa-mir-17的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物b，用于逆轉(zhuǎn)錄hsa-miR-106b的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物c，用于逆轉(zhuǎn)錄hsa-mir-16的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物d，用于檢測(cè)hsa-mir-20a的上游引物a和探針a，用于檢測(cè)hsa-mir-17的上游引物b和探針b，用于檢測(cè)hsa-miR-106b的上游引物c和探針c，用于檢測(cè)hsa-mir-16的上游引物d和探針d，以及用于檢測(cè)hsa-mir-20a、hsa-mir-17、hsa-miR-106b和hsa-mir-16的通用下游引物；所述hsa-mir-20a、hsa-mir-17和hsa-miR-106b是標(biāo)志物，所述hsa-mir-16是內(nèi)參；所述上游引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述探針a的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；所述上游引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述探針b的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示；所述上游引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述探針c的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示；所述上游引物d的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述探針d的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示；所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示，所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示，所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示，所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物d的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示；所述探針a和探針b的5’端設(shè)有一種熒光報(bào)告基團(tuán)，所述探針c和探針d的5’端設(shè)有另一種熒光報(bào)告基團(tuán)，所述探針a、探針b、探針c和探針d的3’端設(shè)有淬滅熒光基團(tuán)；所述各上游引物在反應(yīng)體系中的終濃度為0.1μM/L～1.5μM/L，所述通用下游引物在反應(yīng)體系中的終濃度為2μM/L～4μM/L；所述探針a在反應(yīng)體系中的終濃度為0.1μM/L～0.17μM/L，所述探針b在反應(yīng)體系中的終濃度為0.18μM/L～0.5μM/L，所述探針c在反應(yīng)體系中的終濃度為0.1μM/L～0.15μM/L，所述探針d在反應(yīng)體系中的終濃度為0.16μM/L～0.5μM/L。上述探針a在反應(yīng)體系中的終濃度為0.16μM/L，所述探針b在反應(yīng)體系中的終濃度為0.2μM/L，所述探針c在反應(yīng)體系中的終濃度為0.15μM/L，所述探針d在反應(yīng)體系中的終濃度為0.17μM/L。上述各上游引物在反應(yīng)體系中的終濃度為0.8μM/L，所述通用下游引物在反應(yīng)體系中的終濃度為3μM/L。上述各莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物在逆轉(zhuǎn)錄體系中的終濃度是50nM/L。上述探針a和探針b的5’端的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，所述探針c和探針d的5’端的熒光報(bào)告基團(tuán)是HEX、VIC、TET或Cy3，所述淬滅熒光基團(tuán)是BHQ1或MGB。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是：一種采用上述引物探針的胃癌檢測(cè)產(chǎn)品。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是：一種胃癌檢測(cè)試劑盒，包括用于配制數(shù)字PCR反應(yīng)液的數(shù)字PCR預(yù)混液、液滴穩(wěn)定劑和miRNAs引物探針混合液，以及用于進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物混合液；所述miRNAs引物探針混合液中包括用于檢測(cè)hsa-mir-20a的上游引物a和探針a，用于檢測(cè)hsa-mir-17的上游引物b和探針b，用于檢測(cè)hsa-miR-106b的上游引物c和探針c，用于檢測(cè)hsa-mir-16的上游引物d和探針d，以及用于檢測(cè)hsa-mir-20a、hsa-mir-17、hsa-miR-106b和hsa-mir-16的通用下游引物；所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物混合液中包括用于逆轉(zhuǎn)錄hsa-mir-20a的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物a，用于逆轉(zhuǎn)錄hsa-mir-17的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物b，用于逆轉(zhuǎn)錄hsa-miR-106b的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物c，用于逆轉(zhuǎn)錄hsa-mir-16的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物d；所述hsa-mir-20a、hsa-mir-17和hsa-miR-106b是標(biāo)志物，所述hsa-mir-16是內(nèi)參；所述上游引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述探針a的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；所述上游引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述探針b的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示；所述上游引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述探針c的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示；所述上游引物d的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述探針d的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示；所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示，所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示，所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示，所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物d的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示；所述探針a和探針b的5’端設(shè)有一種熒光報(bào)告基團(tuán)，所述探針c和探針d的5’端設(shè)有另一種熒光報(bào)告基團(tuán)，所述探針a、探針b、探針c和探針d的3’端設(shè)有淬滅熒光基團(tuán)；所述各上游引物在反應(yīng)體系中的終濃度為0.1μM/L～1.5μM/L，所述通用下游引物在反應(yīng)體系中的終濃度為2μM/L～4μM/L；所述探針a在反應(yīng)體系中的終濃度為0.1μM/L～0.17μM/L，所述探針b在反應(yīng)體系中的終濃度為0.18μM/L～0.5μM/L，所述探針c在反應(yīng)體系中的終濃度為0.1μM/L～0.15μM/L，所述探針d在反應(yīng)體系中的終濃度為0.16μM/L～0.5μM/L。上述探針a在反應(yīng)體系中的終濃度為0.16μM/L，所述探針b在反應(yīng)體系中的終濃度為0.2μM/L，所述探針c在反應(yīng)體系中的終濃度為0.15μM/L，所述探針d在反應(yīng)體系中的終濃度為0.17μM/L；所述各上游引物在反應(yīng)體系中的終濃度為0.8μM/L，所述通用下游引物在反應(yīng)體系中的終濃度為3μM/L；所述各莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物在逆轉(zhuǎn)錄體系中的終濃度是50nM/L；所述探針a和探針b的5’端的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，所述探針c和探針d的5’端的熒光報(bào)告基團(tuán)是HEX、VIC、TET或Cy3，所述淬滅熒光基團(tuán)是BHQ1或MGB。上述數(shù)字PCR預(yù)混液中包括DNA聚合酶、超純水、dNTPs混合液、參比熒光ROX和緩沖液；所述液滴穩(wěn)定劑中包括礦物油。上述胃癌檢測(cè)試劑盒反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)體系中包括數(shù)字PCR預(yù)混液10體積，miRNAs引物探針混合液2體積，液滴穩(wěn)定劑2體積，cDNA模板1體積，滅菌超純水5體積。本發(fā)明具有積極的效果：(1)本發(fā)明的胃癌檢測(cè)試劑盒采用多重探針數(shù)字PCR技術(shù)，基于Taqman探針原理，對(duì)引物探針進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)，針對(duì)多個(gè)miRNA分別使用不同的熒光素標(biāo)記的探針，檢測(cè)時(shí)帶不同熒光的液滴將被相應(yīng)識(shí)別出來，分別被計(jì)數(shù)。在保證熒光信號(hào)強(qiáng)度與探針濃度成正比的前提下，調(diào)整熒光素的濃度以及調(diào)整兩種熒光素混合的配比，可以一次同時(shí)檢測(cè)4個(gè)miRNA的表達(dá)水平。本發(fā)明解決樣本中miRNA含量低、樣本量少的問題，具有更好的組內(nèi)穩(wěn)定性，能夠更好地用于疾病的無創(chuàng)檢測(cè)。本發(fā)明的胃癌檢測(cè)試劑盒4個(gè)miRNA聯(lián)合作為胃癌早期診斷標(biāo)志物的診斷準(zhǔn)確率為97％，可以成為胃癌早期診斷的有效手段。(2)本發(fā)明的胃癌檢測(cè)試劑盒與一般的定量相比，不用設(shè)置陽性對(duì)照，也不需要設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品，一般的檢測(cè)技術(shù)是定性檢測(cè)，本發(fā)明的技術(shù)可以達(dá)到真正意義上的絕對(duì)定量，檢測(cè)出低至1個(gè)拷貝數(shù)模板量，克服了qPCR不具有精確定量的缺點(diǎn)。本發(fā)明對(duì)血清中miRNA進(jìn)行定量檢測(cè)，不依賴于擴(kuò)增曲線的閾值(CT值)進(jìn)行定量，不依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線達(dá)到絕對(duì)定量的目的，有很好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，不受擴(kuò)增效率的影響。(3)本發(fā)明的胃癌檢測(cè)試劑盒對(duì)樣本溶液采用微滴化處理，減少背景干擾，根據(jù)熒光類型、熒光微滴個(gè)數(shù)結(jié)果，能夠直接判讀拷貝數(shù)，操作簡(jiǎn)化，降低檢測(cè)成本，以前的檢測(cè)技術(shù)方法的靈敏度一般在1％～50％之間，而本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法的靈敏度可以達(dá)到0.1％，檢測(cè)樣本中miRNA的絕對(duì)量和比例。附圖說明圖1為用本發(fā)明的試劑盒對(duì)胃癌患者血漿樣本進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述本
發(fā)明內(nèi)容對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。下述實(shí)施例中，若非特意表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業(yè)渠道獲得。文中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著的科學(xué)出版社2002年出版的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。一、試劑盒的組成。本實(shí)施例的胃癌檢測(cè)試劑盒，包括數(shù)字PCR預(yù)混液、液滴穩(wěn)定劑、miRNAs引物探針混合液和莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物混合液。試劑盒各成分如表1所示。表1試劑盒成分表試劑盒成分分裝試劑公司數(shù)字PCR預(yù)混液1管Lifetechnologies液滴穩(wěn)定劑1管RaindancetechnologiesmiRNAs引物探針混合液1管百力格莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物混合液1管百力格上述表1中試劑盒各組分的說明如下：1)數(shù)字PCR預(yù)混液的主要成分包括DNA聚合酶、超純水、dNTPs混合液、參比熒光ROX、緩沖液等(由Lifetechnologies公司提供，貨號(hào)：1508099)。2)液滴穩(wěn)定劑的主要成分是礦物油，(由Raindancetechnologies公司提供，貨號(hào)：30-00826)，主要作用是微滴化處理過程將反應(yīng)體系形成油包水小液滴。3)miRNAs引物探針混合液中檢測(cè)的miRNA分別是hsa-mir-20a、hsa-mir-17、hsa-miR-106b以及內(nèi)參hsa-mir-16。miRNAs引物探針混合液包括hsa-mir-20a、hsa-mir-17、hsa-miR-106b、hsa-mir-16各自的上游引物，hsa-mir-20a、hsa-mir-17、hsa-miR-106b、hsa-mir-16各自的探針，以及hsa-mir-20a、hsa-mir-17、hsa-miR-106b、hsa-mir-16共用的通用下游引物。hsa-mir-20a、hsa-mir-17和hsa-miR-106b是標(biāo)志物，hsa-mir-16是內(nèi)參。本發(fā)明選擇的內(nèi)參是經(jīng)過樣本驗(yàn)證的在結(jié)直腸腺癌、腺瘤和健康對(duì)照組中表達(dá)量無顯著性差異，并且在胃癌的不同分期患者中表達(dá)量也無顯著性差異。4)莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物混合液包括hsa-mir-20a、hsa-mir-17、hsa-miR-106b和hsa-mir-16各自的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物。本發(fā)明中的所有引物和探針都是基于miRNA在miRBase數(shù)據(jù)庫的序列信息，如表2所示。表2miRNA信息表GeneAccessionSequence(5’——3’)hsa-mir-20aMIMAT0000075uaaagugcuuauagugcagguaghsa-mir-17MIMAT0000070caaagugcuuacagugcagguaghsa-miR-106bMIMAT0000680uaaagugcugacagugcagauhsa-mir-16MIMAT0000069uagcagcacguaaauauuggcg為設(shè)計(jì)引物方便，把在數(shù)據(jù)庫中檢索的到的miRNA序列中的U替換成T，替換后的結(jié)果如表3所示。表3miRNA堿基替換后序列信息表GeneAccessionSequence(5’——3’)hsa-mir-20aMIMAT0000075taaagtgcttatagtgcaggtaghsa-mir-17MIMAT0000070caaagtgcttacagtgcaggtaghsa-miR-106bMIMAT0000680taaagtgctgacagtgcagathsa-mir-16MIMAT0000069tagcagcacgtaaatattggcg通用下游引物是以逆轉(zhuǎn)錄引物為模板設(shè)計(jì)的GC含量、二聚體情況等達(dá)到最佳的一段序列。上游引物是與通用下游引物配對(duì)的相關(guān)參數(shù)達(dá)到最佳的一段序列。莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物序列是將miRNA的3’端后4至6位堿基反向互補(bǔ)序列添加到經(jīng)典頸環(huán)結(jié)構(gòu)的3’端形成的序列，主要用于抽提RNA后的miRNA逆轉(zhuǎn)錄。選擇基于莖環(huán)引物的miRNA定量，莖環(huán)法具有特異性強(qiáng)，靈敏度高、miRNA前體的背景干擾小、線性范圍廣、效率高等優(yōu)點(diǎn)。莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物由一段與miRNA特異性互補(bǔ)序列和一段較長(zhǎng)的通用莖環(huán)引序列組成，通用莖環(huán)引序列的核苷酸序列為：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgac。miRNAs引物探針混合液中的上游引物、探針、通用下游引物，以及莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物混合液中的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列如表4所示。表4引物和探針序列表探針兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。探針的5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM或VIC，探針的3’端標(biāo)記的淬滅基團(tuán)是BHQ1。本實(shí)施例中hsa-mir-20a和hsa-mir-17的探針的5’端標(biāo)記的是FAM，hsa-miR-106b和hsa-mir-16的探針的5’端標(biāo)記的是VIC。探針引物干粉由百力格生物技術(shù)有限公司合成，母液由干粉加入滅菌超純水稀釋而成，引物和探針混合液均由母液加入滅菌超純水稀釋而成，包括上游引物、探針、通用下游引物，由于多重PCR可能產(chǎn)生引物間的抑制作用和擴(kuò)增效率的不穩(wěn)定性，不同的引物探針使用濃度存在差異，本發(fā)明優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件使引物探針使用濃度組合效果最佳，上游引物的使用濃度各為1μM/L～15μM/L，最終反應(yīng)體系中的濃度為0.1μM/L～1.5μM/L，優(yōu)選地，上游引物在最終反應(yīng)體系中的濃度為0.8μM/L；通用下游引物使用濃度為20μM/L～40μM/L，最終反應(yīng)體系中的濃度為2μM/L～4μM/L，優(yōu)選地，通用下游引物在最終反應(yīng)體系中的濃度為3μM/L；各探針使用濃度為1μM/L～5μM/L，最終反應(yīng)體系中探針的濃度為0.1μM/L～0.5μM/L，優(yōu)選地，hsa-mir-20a探針在最終反應(yīng)體系中的濃度為0.16μM/L、hsa-mir-17探針在最終反應(yīng)體系中的濃度為0.2μM/L、hsa-miR-106b探針在最終反應(yīng)體系中的濃度為0.15μM/L、hsa-mir-16探針在最終反應(yīng)體系中的濃度為0.17μM/L。莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物在逆轉(zhuǎn)錄體系中的終濃度50nM/L。二、試劑盒的使用方法。本實(shí)施例的胃癌檢測(cè)試劑盒的具體檢測(cè)步驟如下：1、RNA提取用抗凝管采集待測(cè)胃癌患者樣本和健康對(duì)照樣本，用德國Qiagen公司提供的血清總RNA提取試劑盒(貨號(hào)：51504)，按照試劑盒操作說明書抽提血清中的RNA。通過Thermo-Fisher公司3.0核酸蛋白熒光定量?jī)x，測(cè)定樣本RNA濃度和純度，抽提的RNA最終加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中。2、RNA逆轉(zhuǎn)錄采用美國Invitrogen公司生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：18080085)，根據(jù)試劑盒說明書配置逆轉(zhuǎn)錄體系，取步驟1中抽提的RNA和莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物混合液，進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA模板，將逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA產(chǎn)物用滅菌超純水稀釋50倍，稀釋后的cDNA模板作為數(shù)字PCR反應(yīng)的模板，放置4℃冰箱待用。3、數(shù)字PCR反應(yīng)液制備根據(jù)表5中的PCR反應(yīng)體系，取試劑盒中20μl的數(shù)字PCR預(yù)混液混合、4μl的miRNAs引物探針混合液，加入2ul的逆轉(zhuǎn)錄稀釋后的cDNA、4μl的液滴穩(wěn)定劑，加入滅菌超純水補(bǔ)至40μl，制得數(shù)字PCR反應(yīng)液。表5PCR反應(yīng)體系表反應(yīng)成分加入濃度加入體積數(shù)字PCR預(yù)混液2×20ulmiRNAs引物探針混合液---4ul液滴穩(wěn)定劑10×4ulcDNA模板---2ulddH2O---to40ul4、PCR反應(yīng)微滴制備將微滴發(fā)生板放入8通道微滴生成器中，用Raindance公司生產(chǎn)的微滴生成器RainDropSource對(duì)樣本進(jìn)行微滴化處理，將數(shù)字PCR混合液制作成PCR微反應(yīng)液滴，形成500～800萬個(gè)油包水液滴。本實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)體系通過微滴發(fā)生器形成上百萬個(gè)皮升級(jí)大小的油包水小液滴后再進(jìn)行PCR反應(yīng)，每個(gè)微滴中會(huì)含有1個(gè)或者不含目的基因的模板。5、PCR擴(kuò)增采用博日公司的PCR擴(kuò)增儀對(duì)生成的微滴進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的反應(yīng)程序如表6所示。表6PCR反應(yīng)程序表優(yōu)選地，數(shù)字PCR擴(kuò)增的條件為：預(yù)變性階段的條件95℃，10min；循環(huán)1，40個(gè)循環(huán)，條件為95℃15s，60℃45s；循環(huán)2條件為98℃10min；循環(huán)3條件為12℃30min。6、微滴檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)束后，將8聯(lián)管置于微滴分析儀中，用Raindance公司生產(chǎn)的微滴分析儀RainDropSense對(duì)每個(gè)微滴逐個(gè)檢測(cè)，含有熒光信號(hào)的微滴標(biāo)記為1，不含熒光信號(hào)標(biāo)記為0，再對(duì)微滴計(jì)數(shù)，軟件自動(dòng)分析，通過泊松分布公式計(jì)算miRNA的拷貝數(shù)(液滴數(shù))。泊松分布公式如下：7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定FAM信號(hào)通道檢測(cè)結(jié)果分別是hsa-mir-20a和hsa-mir-17的拷貝數(shù)，VIC信號(hào)通道檢測(cè)結(jié)果分別是hsa-miR-106b和內(nèi)參hsa-mir-16的拷貝數(shù)。待測(cè)樣本miRNA表達(dá)判斷：若(待測(cè)樣本標(biāo)志物miRNA拷貝數(shù)-待測(cè)樣本內(nèi)參miRNA拷貝數(shù))>(健康對(duì)照樣本miRNA拷貝數(shù)-健康對(duì)照樣本內(nèi)參miRNA拷貝數(shù))，則待測(cè)樣本的miRNA表達(dá)上調(diào)。若(待測(cè)樣本標(biāo)志物miRNA拷貝數(shù)-待測(cè)樣本內(nèi)參miRNA拷貝數(shù))<(健康對(duì)照樣本miRNA拷貝數(shù)-健康對(duì)照樣本內(nèi)參miRNA拷貝數(shù))，則待測(cè)樣本的miRNA表達(dá)下調(diào)。三、應(yīng)用例采用本實(shí)施例的胃癌檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胃癌患者的血漿樣本，通過用Raindance公司的微滴分析儀RainDropSense對(duì)每個(gè)微滴逐個(gè)檢測(cè)，對(duì)微滴計(jì)數(shù)，軟件自動(dòng)分析，通過泊松分布公式計(jì)算miRNA的絕對(duì)拷貝數(shù)。得到的檢測(cè)結(jié)果圖如圖1所示，hsa-mir-20a圈中是hsa-mir-20a目的片段的液滴數(shù)，hsa-mir-17圈中是hsa-mir-17目的片段的液滴數(shù)，hsa-miR-106b圈中是hsa-miR-106b目的片段的液滴數(shù)，hsa-mir-16圈中是hsa-mir-16目的片段的液滴數(shù)。emptydroplets圈中是不包括以上四個(gè)目的片段的液滴數(shù)，可以明顯看到miRNA目的片段的區(qū)域界線清晰，僅通過一次反應(yīng)即可統(tǒng)計(jì)出胃癌患者的血漿樣本的miRNA拷貝數(shù)，再與健康對(duì)照樣本miRNA拷貝數(shù)比較，準(zhǔn)確的判斷樣本的miRNA表達(dá)水平，有助于胃癌患者的早期診斷。顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而這些屬于本發(fā)明的精神所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。SEQUENCELISTING<110>上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司<120>胃癌檢測(cè)引物探針及其試劑盒<130>無<160>13<170>PatentInversion3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1agtgcttatagtgcaggtag20<210>2<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>2aagtgcttacagtgcagg18<210>3<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>3agtgctgacagtgcagatg19<210>4<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>4gcagcacgtaaatattggc19<210>5<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>5gtcgtatccagtgcgaac18<210>6<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>6cctcggaccctgcactggat20<210>7<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>7cagtgcaggtaggtcgtatcca22<210>8<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>8cactggatacgacatctgcact22<210>9<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>9tggcggtcgtatccagtgca20<210>10<211>51<212>DNA<213>人工合成<400>10gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactacctgc51<210>11<211>51<212>DNA<213>人工合成<400>11gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacctacctg51<210>12<211>51<212>DNA<213>人工合成<400>12gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacatctgca51<210>13<211>50<212>DNA<213>人工合成<400>13gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgaccgccaa50當(dāng)前第1頁1 2 3