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胃癌檢測引物探針及其試劑盒的制作方法

文檔序號:12346674閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種胃癌檢測引物探針,其特征在于:包括用于逆轉(zhuǎn)錄hsa-mir-20a的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物a,用于逆轉(zhuǎn)錄hsa-mir-17的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物b,用于逆轉(zhuǎn)錄hsa-miR-106b的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物c,用于逆轉(zhuǎn)錄hsa-mir-16的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物d,用于檢測hsa-mir-20a的上游引物a和探針a,用于檢測hsa-mir-17的上游引物b和探針b,用于檢測hsa-miR-106b的上游引物c和探針c,用于檢測hsa-mir-16的上游引物d和探針d,以及用于檢測hsa-mir-20a、hsa-mir-17、hsa-miR-106b和hsa-mir-16的通用下游引物;

所述hsa-mir-20a、hsa-mir-17和hsa-miR-106b是標志物,所述hsa-mir-16是內(nèi)參;

所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述探針a的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示;

所述上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述探針b的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示;

所述上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述探針c的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示;

所述上游引物d的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,所述探針d的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示;

所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示;

所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示,所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示,所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示,所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物d的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示;

所述探針a和探針b的5’端設有一種熒光報告基團,所述探針c和探針d的5’端設有另一種熒光報告基團,所述探針a、探針b、探針c和探針d的3’端設有淬滅熒光基團;

所述各上游引物在反應體系中的終濃度為0.1μM/L~1.5μM/L,所述通用下游引物在反應體系中的終濃度為2μM/L~4μM/L;

所述探針a在反應體系中的終濃度為0.1μM/L~0.17μM/L,所述探針b在反應體系中的終濃度為0.18μM/L~0.5μM/L,所述探針c在反應體系中的終濃度為0.1μM/L~0.15μM/L,所述探針d在反應體系中的終濃度為0.16μM/L~0.5μM/L。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胃癌檢測引物探針,其特征在于:所述探針a在反應體系中的終濃度為0.16μM/L,所述探針b在反應體系中的終濃度為0.2μM/L,所述探針c在反應體系中的終濃度為0.15μM/L,所述探針d在反應體系中的終濃度為0.17μM/L。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胃癌檢測引物探針,其特征在于:所述各上游引物在反應體系中的終濃度為0.8μM/L,所述通用下游引物在反應體系中的終濃度為3μM/L。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胃癌檢測引物探針,其特征在于:所述各莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物在逆轉(zhuǎn)錄體系中的終濃度是50nM/L。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胃癌檢測引物探針,其特征在于:所述探針a和探針b的5’端的熒光報告基團是FAM,所述探針c和探針d的5’端的熒光報告基團是HEX 、VIC、TET或Cy3,所述淬滅熒光基團是BHQ1或MGB。

6.一種采用如權(quán)利要求1所述的引物探針的胃癌檢測產(chǎn)品。

7.一種胃癌檢測試劑盒,其特征在于:包括用于配制數(shù)字PCR反應液的數(shù)字PCR預混液、液滴穩(wěn)定劑和miRNAs引物探針混合液,以及用于進行RNA逆轉(zhuǎn)錄的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物混合液;

所述miRNAs引物探針混合液中包括用于檢測hsa-mir-20a的上游引物a和探針a,用于檢測hsa-mir-17的上游引物b和探針b,用于檢測hsa-miR-106b的上游引物c和探針c,用于檢測hsa-mir-16的上游引物d和探針d,以及用于檢測hsa-mir-20a、hsa-mir-17、hsa-miR-106b和hsa-mir-16的通用下游引物;

所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物混合液中包括用于逆轉(zhuǎn)錄hsa-mir-20a的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物a,用于逆轉(zhuǎn)錄hsa-mir-17的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物b,用于逆轉(zhuǎn)錄hsa-miR-106b的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物c,用于逆轉(zhuǎn)錄hsa-mir-16的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物d;

所述hsa-mir-20a、hsa-mir-17和hsa-miR-106b是標志物,所述hsa-mir-16是內(nèi)參;

所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述探針a的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示;

所述上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述探針b的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示;

所述上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述探針c的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示;

所述上游引物d的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,所述探針d的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示;

所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示;

所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示,所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示,所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示,所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物d的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示;

所述探針a和探針b的5’端設有一種熒光報告基團,所述探針c和探針d的5’端設有另一種熒光報告基團,所述探針a、探針b、探針c和探針d的3’端設有淬滅熒光基團;

所述各上游引物在反應體系中的終濃度為0.1μM/L~1.5μM/L,所述通用下游引物在反應體系中的終濃度為2μM/L~4μM/L;

所述探針a在反應體系中的終濃度為0.1μM/L~0.17μM/L,所述探針b在反應體系中的終濃度為0.18μM/L~0.5μM/L,所述探針c在反應體系中的終濃度為0.1μM/L~0.15μM/L,所述探針d在反應體系中的終濃度為0.16μM/L~0.5μM/L。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的胃癌檢測試劑盒,其特征在于:所述探針a在反應體系中的終濃度為0.16μM/L,所述探針b在反應體系中的終濃度為0.2μM/L,所述探針c在反應體系中的終濃度為0.15μM/L,所述探針d在反應體系中的終濃度為0.17μM/L;所述各上游引物在反應體系中的終濃度為0.8μM/L,所述通用下游引物在反應體系中的終濃度為3μM/L;所述各莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物在逆轉(zhuǎn)錄體系中的終濃度是50nM/L;所述探針a和探針b的5’端的熒光報告基團是FAM,所述探針c和探針d的5’端的熒光報告基團是HEX 、VIC、TET或Cy3,所述淬滅熒光基團是BHQ1或MGB。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的胃癌檢測試劑盒,其特征在于:所述數(shù)字PCR預混液中包括DNA聚合酶、超純水、dNTPs混合液、參比熒光ROX和緩沖液;所述液滴穩(wěn)定劑中包括礦物油。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的胃癌檢測試劑盒,其特征在于:反應時,反應體系中包括數(shù)字PCR預混液10體積,miRNAs引物探針混合液2體積,液滴穩(wěn)定劑2體積,cDNA模板1體積,滅菌超純水5體積。

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