本發(fā)明屬于食品質(zhì)量安全檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種雙重巢式熒光PCR檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的引物和探針組合、方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
：自1996年轉(zhuǎn)基因作物開始商業(yè)化種植以來，每年都以驚人的速度發(fā)展。截止到2014，全球種植轉(zhuǎn)基因作物的國家已達(dá)28個，占全球人口的60％，即40億人。2015年全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積為1.797億公頃，與1996年的170萬公頃相比增加了100倍，而轉(zhuǎn)基因大豆是種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物。中國是大豆和大豆產(chǎn)品凈出口國，國內(nèi)需求量不斷增加引起轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)口量屢創(chuàng)新高。而隨著轉(zhuǎn)基因大豆大規(guī)模商業(yè)化，其安全性也受到國際社會和我國民眾的廣泛關(guān)注，許多國家出臺了嚴(yán)格的管理法規(guī)，目前全球許多國家和地區(qū)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)行強(qiáng)制性標(biāo)識管理制度。2002年，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》及衛(wèi)生部出臺《轉(zhuǎn)基因食品衛(wèi)生管理辦法》，規(guī)定轉(zhuǎn)基因食品必須強(qiáng)制性的進(jìn)行轉(zhuǎn)基因標(biāo)識。正因如此，轉(zhuǎn)基因大豆檢測技術(shù)的要求也越來越高。目前，全世界共有31個轉(zhuǎn)基因大豆品系得到監(jiān)管機(jī)構(gòu)的審批，其中就包括轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406。2015年，中國進(jìn)口大豆8169萬噸，轉(zhuǎn)基因大豆占其中絕大部分，且進(jìn)口國主要為美國和巴西。歐盟轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)雖然出臺了針對轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的熒光PCR檢測方法，此方法具有定量能力，但由于探針的原因?qū)е缕錂z測通量偏低；而用于檢測其它的轉(zhuǎn)基因品系的多重PCR雖然提高了檢測的通量，但體系內(nèi)含多對引物，反應(yīng)不穩(wěn)定。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的內(nèi)外源基因的雙重巢式熒光PCR檢測的引物和探針組合。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的內(nèi)外源基因的雙重巢式熒光PCR檢測試劑盒。本發(fā)明的再一個目的在于提供一種基于上述檢測引物和探針組合和檢測試劑盒的轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的內(nèi)外源基因的雙重巢式熒光PCR檢測方法。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明中使用的術(shù)語“大豆DAS44406品系特異性序列”指的是大豆DAS44406的品系轉(zhuǎn)基因外源插入片段(外源基因5’插入序列)，例如根據(jù)大豆DAS44406品系特異性序列設(shè)計的引物和/或探針只能對大豆DAS44406品系進(jìn)行擴(kuò)增，對其它品系則不能進(jìn)行擴(kuò)增。本發(fā)明第一方面提供了引物和探針組合，包括：引物一、引物二和探針一的組合；和引物三、引物四和探針二的組合；所述引物一由SEQIDNO:1和SEQIDNO:2組成，所述引物二由SEQIDNO:3和SEQIDNO:4組成，所述探針一為SEQIDNO:5，所述引物三由SEQIDNO:6和SEQIDNO:7組成，所述引物四由SEQIDNO:8和SEQIDNO:9組成，所述探針二為SEQIDNO:10。本發(fā)明第二方面提供了所述的引物和探針組合在檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406中的應(yīng)用。本發(fā)明第三方面提供了一種試劑盒，包括所述的引物和探針組合。在一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括Mix2和Mix1，所述Mix2包括dNTPs、反應(yīng)緩沖液和MgCl2組成，所述Mix1包括DNA聚合酶。在一優(yōu)選例中，所述Mix2和Mix1均來自寶生物工程大連有限公司的貨號為RR060A的試劑盒中的試劑。在一優(yōu)選例中，還包括基因組DNA提取試劑。在一優(yōu)選例中，所述基因組DNA提取試劑來自天根生化科技(北京)有限公司且貨號為DP305-02的植物基因組DNA提取試劑盒中的試劑。在一優(yōu)選例中，還包括ProbeqPCRMix。在一優(yōu)選例中，所述ProbeqPCRMix來自寶生物工程(大連)有限公司的貨號為RR391S的試劑盒中的試劑。在一優(yōu)選例中，還包括陽性對照和陰性對照。在一優(yōu)選例中，所述陽性對照為轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的DNA或含轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的品系特異性序列的質(zhì)粒DNA，所述陰性對照不含轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的品系特異性序列。本發(fā)明第四方面提供了所述的試劑盒在檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406中的應(yīng)用。本發(fā)明第五方面提供了一種檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的雙重巢式熒光PCR方法，包括使用所述的引物和探針組合或上述任一項(xiàng)所述試劑盒的步驟。在一優(yōu)選例中，包括如下步驟：1)雙重巢式熒光PCR擴(kuò)增：以生物樣品含有的DNA為模板與權(quán)利要求1所述的引物一和引物三進(jìn)行第一輪雙重PCR反應(yīng)；然后以第一輪雙重PCR反應(yīng)所得的PCR產(chǎn)物為模板與引物二、引物四、探針一和探針二進(jìn)行第二輪熒光PCR反應(yīng)；2)根據(jù)雙重巢式熒光PCR擴(kuò)增的結(jié)果判斷生物樣品是否含有轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的品系特異性序列。在一優(yōu)選例中，在步驟1)之前還包括在生物樣品中提取DNA的步驟。在一優(yōu)選例中，所述在生物樣品中提取DNA是采用天根生化科技(北京)有限公司的貨號為DP305-02的植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行。在一優(yōu)選例中，所述雙重巢式熒光PCR擴(kuò)增的第一輪雙重PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系如下：所述Mix2包括dNTPs、MgCl2和反應(yīng)緩沖液。所述Mix1包括DNA聚合酶。所述Mix2和Mix1均來自寶生物工程(大連)有限公司的貨號為RR060A的試劑盒中的試劑。在一優(yōu)選例中，所述雙重巢式熒光PCR擴(kuò)增的第二輪熒光PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系如下：所述ProbeqPCRMix來自寶生物工程大連有限公司的貨號為RR391S的試劑盒中的試劑。在一優(yōu)選例中，所述雙重巢式熒光PCR擴(kuò)增的第一輪雙重PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序如下：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃90s，15個循環(huán)；72℃5min；所述雙重巢式熒光PCR擴(kuò)增的第二輪熒光PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性1min；95℃15s,60℃1min，40個循環(huán)。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：(1)本發(fā)明成功將多重PCR、巢式PCR、熒光定量PCR整合到一起，吸收各技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，改進(jìn)其檢測流程，針對轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的內(nèi)外源基因設(shè)計了多條引物、探針進(jìn)行了大量篩選，綜合其特異性、靈敏度、引物與引物之間的作用，以及所使用的各引物、探針與雙重?zé)晒釶CR擴(kuò)增試劑盒的適配性，最終篩選出重復(fù)性和特異性好、靈敏度高、適用性廣且可同時檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406品系特異性序列和大豆內(nèi)源基因的引物對和探針組合，同時還開發(fā)了同時檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406品系特異性序列和大豆內(nèi)源基因Lectin的試劑盒和方法。(2)模板需要量少。如果利用普通熒光定量PCR對某一樣品中多個基因進(jìn)行定性定量分析時，即如果檢測2個基因則需要在6管中都加入模板(以每個基因三個重復(fù)計算)，以每管50ng模板來計算則需要300ng模板。而該方法則只需要在第一輪雙重PCR時加入50ng模板即可，因?yàn)榈诙啛晒舛縋CR是利用第一輪雙重PCR產(chǎn)物稀釋物作為模板。這樣對于一些痕量的樣品具有較大的優(yōu)勢。(3)靈敏度高。雙重巢式熒光定量PCR靈敏度高于普通熒光定量PCR，相比普通熒光定量PCR提高了1個數(shù)量級，這對于一些深加工食品的轉(zhuǎn)基因檢測具有巨大的優(yōu)勢。(4)通量高。本發(fā)明建立的方法通過一次實(shí)驗(yàn)同時對2個基因進(jìn)行定性定量檢測。(5)特異性強(qiáng)。在本發(fā)明的方法中，任何一個基因均需要內(nèi)外2對引物全部配對才能夠擴(kuò)增，特異性高于普通PCR。(6)避免假陽性。在本發(fā)明的方法中，如果轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406品系特異性序列的檢測結(jié)果顯示是陽性，大豆內(nèi)源基因Lectin的檢測結(jié)果顯示是陰性，則可判斷檢測結(jié)果為假陽性，則可進(jìn)行復(fù)檢以得出準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。附圖說明圖1是雙重巢式熒光PCR檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的品系特異性序列和大豆內(nèi)源基因Lectin的熔融曲線圖。其中1代表轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的品系特異性序列的擴(kuò)增曲線，2代表大豆內(nèi)源基因Lectin的擴(kuò)增曲線，3代表陰性對照。圖2是雙重巢式熒光PCR靈敏度測試，檢測轉(zhuǎn)基因含量分別為100％、10％、1％、0.1％、0.01％和0.001％的樣品的大豆內(nèi)源基因Lectin的擴(kuò)增曲線圖。其中1-6代表其模板依次為轉(zhuǎn)基因含量為100％、10％、1％、0.1％、0.01％和0.001％的樣品。圖3是雙重巢式熒光PCR靈敏度測試，檢測轉(zhuǎn)基因含量分別為100％、10％、1％、0.1％、0.01％和0.001％的樣品的轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406品系特異性序列的擴(kuò)增曲線圖。其中1-6代表其模板依次為轉(zhuǎn)基因含量為100％、10％、1％、0.1％、0.01％和0.001％的樣品。具體實(shí)施方式除非特殊說明，本發(fā)明所用術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的一般含義。下面參考具體實(shí)施例和附圖，對本發(fā)明進(jìn)行說明，需要說明的是，這些實(shí)施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1本實(shí)施例提供了引物和探針組合及其應(yīng)用。引物和探針組合的篩選方法為：針對轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406外源基因5’插入序列(如圖1所示)和大豆內(nèi)源基因Lectin，設(shè)計不同的引物和探針組合并進(jìn)行了優(yōu)化篩選，綜合其特異性、靈敏度、配對復(fù)合擴(kuò)增的相互影響、以及不同引物探針組合與熒光PCR擴(kuò)增試劑盒的適配性，最終篩選出特異性好、重復(fù)性好且靈敏度高的如下可同時檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406品系特異性序列和大豆內(nèi)源基因的雙重巢式熒光PCR的引物對和探針組合。所述的引物和探針組合的核苷酸序列如表1所示：表1其中FAM、ROX為熒光基團(tuán)，BHQ1、BHQ2為淬滅基團(tuán)。上述引物和探針組合由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。利用上述引物對和探針可同時針對轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406品系特異性序列和大豆內(nèi)源基因進(jìn)行雙重巢式熒光PCR擴(kuò)增。在應(yīng)用上，上述引物和探針組合可應(yīng)用于檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406上；還可以用來制備檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的產(chǎn)品。實(shí)施例2本實(shí)施例提供了一種試劑盒及其應(yīng)用，所述試劑盒包括：(1)SEQIDNO：1-SEQIDNO：10(來自實(shí)施例1)；(2)dNTPs、MgCl2、10×PCRBuffer反應(yīng)緩沖液和DNA聚合酶中的至少一種；(3)基因組DNA提取試劑；(4)ProbeqPCRMix；(5)陽性對照和陰性對照。上述dNTPs、MgCl2、10×PCRBuffer反應(yīng)緩沖液和DNA聚合酶均來自寶生物工程(大連)有限公司的貨號為RR060A的試劑盒中的試劑。上述基因組DNA提取試劑來自天根生化科技(北京)有限公司且貨號為DP305-02的植物基因組DNA提取試劑盒中的試劑。上述ProbeqPCRMix來自寶生物工程(大連)有限公司的貨號為RR391S的試劑盒中的試劑。實(shí)驗(yàn)證明，上述基因組DNA提取試劑、ProbeqPCRMix，以及與SEQIDNO：1-SEQIDNO：10的聯(lián)合使用，效果非常優(yōu)越，具體表現(xiàn)為特異性強(qiáng)、重復(fù)性好和靈敏度高。在應(yīng)用上，上述試劑盒可應(yīng)用于檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406DAS44406上；還可以用來制備檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的產(chǎn)品。實(shí)施例3本實(shí)施例提供了一種檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的方法，例如根據(jù)雙重巢式熒光PCR擴(kuò)增的結(jié)果判斷生物樣品是否含有轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的品系特異性序列和/或大豆內(nèi)源基因Lectin。該方法使用了實(shí)施例1的引物和探針組合或?qū)嵤├?的試劑盒。上述方法包括如下步驟：(1)基因組DNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司的貨號為DP305-02的植物基因組DNA提取試劑盒提取生物樣品的基因組DNA，提取后取1μL用核酸蛋白分析儀測定提取的基因組DNA的濃度和純度，用TE將所有樣品標(biāo)定至100ng/μL，保存于-20℃待用。(2)雙重巢式熒光PCR擴(kuò)增第一輪雙重PCR。反應(yīng)體系如表2所示。其中，Mix2內(nèi)含dNTPs、MgCl2和反應(yīng)緩沖液；Mix1內(nèi)含DNA聚合酶，Mix2和Mix1均來自寶生物工程(大連)有限公司的貨號為RR060A的試劑盒。第一輪雙重PCR反應(yīng)條件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃90s，15個循環(huán)；72℃5min；具體循環(huán)數(shù)可以根據(jù)實(shí)際情況在范圍內(nèi)調(diào)整。第一輪雙重PCR反應(yīng)結(jié)束后，用ddH2O稀釋PCR產(chǎn)物100倍；表2成分體系第一輪引物每條引物的終濃度均為0.1μmol/LMix225μLMix10.25μLDNA模板1.0μL(DNA模板的濃度50ng/μL)超純水補(bǔ)足至50μL表2中第一輪引物為實(shí)施例1中的SEQIDNO：1-SEQIDNO：2；以及SEQIDNO：6-SEQIDNO：7。第二輪熒光PCR。以第一輪稀釋后的雙重PCR產(chǎn)物為模板，采用第二輪引物及探針，進(jìn)行第二輪熒光PCR。所述第二輪引物及探針為SEQIDNO：3-SEQIDNO：5，以及SEQIDNO：8-SEQIDNO：10。反應(yīng)體系：ProbeqPCRMix10μL，各引物(實(shí)施例1中的SEQIDNO：3-SEQIDNO：4，以及SEQIDNO：8-SEQIDNO：9)終濃度均為0.4μmol/L，各探針(實(shí)施例1中的SEQIDNO：5和SEQIDNO：10)終濃度均為0.2μmol/L，第一輪PCR產(chǎn)物的100倍稀釋的稀釋物1μL作為模板，ddH2O補(bǔ)足至20μL。其中，ProbeqPCRMix來自寶生物工程(大連)有限公司的貨號為RR391S的試劑盒中的試劑。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1min；95℃15s,60℃1min，40個循環(huán)。步驟三：雙重巢式熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測在每個循環(huán)的60℃階段結(jié)束后收集FAM和ROX的熒光信號。所述雙重巢式熒光PCR擴(kuò)增的結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)如表3所示：表3FAM通道ROX通道結(jié)果判定++含有轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406品系特異性序列+-可能存在假陽性，需復(fù)檢-+非轉(zhuǎn)基因大豆--非大豆品種表3中的“+”代表陽性，“-”代表陰性。一般來說，陽性意味著Ct值≤35；陰性意味著Ct值≥40；但在檢測過程中，當(dāng)35＜Ct值＜40時判為結(jié)果可疑，需重新檢測，如復(fù)檢Ct值一致的則判為陽性，如復(fù)檢Ct值≥40則判為陰性。實(shí)施例4本實(shí)施例對實(shí)施例1的引物和探針組合、實(shí)施例2的試劑盒以及實(shí)施例3建立的檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的方法進(jìn)行了有效性驗(yàn)證。所用的供試材料如下：轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406，保存于中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院。用實(shí)施例3建立的檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406、的方法對上述供試材料進(jìn)行檢測，同時以水為陰性對照。結(jié)果分析：結(jié)果如圖1所示，HEX通道下Ct值為25.13，表明該樣品中含有轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406品系特異性序列，ROX通道下Ct值為25.42，表明該樣品中含有大豆成分。說明本發(fā)明的基于實(shí)施例1的引物和探針組合、實(shí)施例2的試劑盒以及實(shí)施例3建立的檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的方法可以有效檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406。實(shí)施例5本實(shí)施例對實(shí)施例1的引物和探針組合以及實(shí)施例3建立的檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的方法進(jìn)行了特異性驗(yàn)證。所用的供試材料如下：轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2，轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12，轉(zhuǎn)基因大豆MON89788，轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127，轉(zhuǎn)基因大豆DP-356043-5，轉(zhuǎn)基因大豆CV127，轉(zhuǎn)基因大豆MON87708，轉(zhuǎn)基因大豆FG72，轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406，轉(zhuǎn)基因大豆DAS68416，轉(zhuǎn)基因大豆MON87701，轉(zhuǎn)基因大豆MON87705，轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423-1，轉(zhuǎn)基因大豆MON87769，轉(zhuǎn)基因大豆DAS81419，轉(zhuǎn)基因玉米BT176，轉(zhuǎn)基因玉米MON810，轉(zhuǎn)基因玉米T25，轉(zhuǎn)基因油菜GT73，轉(zhuǎn)基因水稻TT51-5，非轉(zhuǎn)基因大豆。上述供試材料均保存于中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院。用實(shí)施例3建立的檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的方法對上述供試材料進(jìn)行檢測。結(jié)果分析：結(jié)果如表4所示，所有的轉(zhuǎn)基因大豆(GTS40-3-2、A2704-12、MON89788、A5547-127、DP-356043-5、CV127、MON87708、FG72、DAS44406、DAS68416、MON87701、MON87705、DP-305423-1、MON87769和DAS81419)和非轉(zhuǎn)基因大豆的大豆內(nèi)源基因Lectin的結(jié)果均為陽性，其余樣品(轉(zhuǎn)基因玉米BT176、轉(zhuǎn)基因玉米MON810、轉(zhuǎn)基因玉米T25、轉(zhuǎn)基因油菜GT73和轉(zhuǎn)基因水稻TT51-5)的大豆內(nèi)源基因Lectin的結(jié)果均為陰性；僅有轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406品系特異性序列的結(jié)果呈陽性，其余樣品均為陰性，由表3對比可知，本發(fā)明方法測得的轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406品系特異性序列的結(jié)果與歐盟標(biāo)準(zhǔn)方法一致，這再次表明本發(fā)明的基于實(shí)施例1的引物對和探針以及實(shí)施例2的試劑盒建立的檢測或輔助轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的方法可以有效檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406，而且上述結(jié)果也同時表明本研究建立的雙重巢式熒光PCR檢測方法對大豆內(nèi)源基因Lectin及轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406品系特異性序列均表現(xiàn)高特異性。表4實(shí)施例6本實(shí)施例對實(shí)施例1的引物和探針組合以及實(shí)施例3建立的檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的方法進(jìn)行了靈敏度驗(yàn)證。所用的供試材料如下：實(shí)施例5提取的轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的基因組DNA和非轉(zhuǎn)基因大豆的基因組DNA。將上述轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的基因組DNA和非轉(zhuǎn)基因大豆的基因組DNA按照質(zhì)量比例配制轉(zhuǎn)基因大豆含量分別為100％、10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％的樣品，以實(shí)施例3的的反應(yīng)體系和程序進(jìn)行雙重巢式熒光PCR擴(kuò)增，每個濃度梯度重復(fù)3次，以確定本方法檢測方法的靈敏度。如圖2和3所示，當(dāng)模板含量為100％～0.001％時，大豆內(nèi)源基因Lectin以及轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406品系均可觀察到擴(kuò)增曲線，且模板含量與Ct值成比例關(guān)系，當(dāng)模板含量為100％-0.01％時，每個含量的2個基因、3次重復(fù)均能順利擴(kuò)增，而當(dāng)模板含量為0.001％時，均無擴(kuò)增。因此本方法同時檢出Lectin內(nèi)源基因以及DAS44406品系的最低檢出限為0.01％。實(shí)施例7本實(shí)施例對實(shí)施例1的引物和探針組合以及實(shí)施例3建立的檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的方法進(jìn)行了重復(fù)性驗(yàn)證。所用的供試材料如下：實(shí)施例6配置成的轉(zhuǎn)基因大豆含量為100％、10％、1％、0.1％的樣品，以實(shí)施例3的的反應(yīng)體系和程序進(jìn)行多次雙重巢式熒光PCR擴(kuò)增，每個濃度梯度重復(fù)9次，得到每個靶基因、每種模板量、每個重復(fù)次的Ct值，根據(jù)這些Ct值計算每個靶基因在每個濃度的9個重復(fù)次的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果如表5所示，靶基因?yàn)榇蠖箖?nèi)源基因Lectin的4種含量的9個重復(fù)次的Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差介于0.064～0.072，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差介于0.204％～0.295％；靶基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因大豆DAS44406品系特異性序列的4種含量的9個重復(fù)次Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差介于0.050～0.222，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差介于0.169％～0.677％，表明本研究建立檢測方法具有比較好的可重復(fù)性。表5表5中靶基因分為DAS44406和Lectin，DAS44406代表轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406品系特異性序列，Lectin代表大豆內(nèi)源基因Lectin，模板量對應(yīng)轉(zhuǎn)基因大豆含量，Ct值下面的1-9代表9個重復(fù)次(9個重復(fù)反應(yīng))中每次反應(yīng)的Ct值。對比例1實(shí)際上，在尋求到本發(fā)明的引物和探針組合之前，嘗試了非常多的引物和探針組合，在本對比例中只摘取其中之若干進(jìn)行闡述，其余不予贅述，具體為：利用實(shí)施例1的引物和探針組合以及用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計并選取其中排分靠前的引物和探針組合1-6，用實(shí)施例3建立的檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的方法對50份進(jìn)口大豆樣品進(jìn)行了檢測，同時用歐盟標(biāo)準(zhǔn)(標(biāo)準(zhǔn)號：qt-eve-gm-015，網(wǎng)站http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/entry？db＝gmometh&id＝qt-eve-gm-015&q＝id％3aQT-eve-gm*)中對這50份大豆樣品進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406的檢測，用《食品中抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆實(shí)時PCR檢測方法的建立與應(yīng)用》中大豆內(nèi)源基因lectin的檢測方法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如表6所示。表6結(jié)果顯示：本發(fā)明引物和探針組合的檢測結(jié)果與歐盟標(biāo)準(zhǔn)和已公開的檢測方法的檢測結(jié)果完全一致，這說明本發(fā)明引物和探針組合特異性強(qiáng)、靈敏度高且重復(fù)性很好，而采用引物設(shè)計軟件隨機(jī)選取的若干種引物和探針組合則或多或少的存在特異性不強(qiáng)、靈敏度不高和重復(fù)性不好的各種缺陷。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3