本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的引物組、含有該引物組的試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豬瘟病毒(CSFV)是屬于黃病毒科、瘟病毒屬的成員。豬瘟病毒具有高度傳染性和致病性，會引發(fā)豬只大量死亡而造成養(yǎng)豬業(yè)的嚴重損失。豬只從感染豬瘟病毒至顯示臨床癥狀前，就可能排出大量病毒。若動物耐過急性或亞急性感染，會產(chǎn)生抗體或轉(zhuǎn)為慢性感染病例，后者終其一生會持續(xù)性或間歇性的排毒，直到死亡為止。若懷孕母豬感染豬瘟病毒，病毒可穿過胎盤感染胎兒，導(dǎo)致流產(chǎn)、木乃伊胎或死產(chǎn)。如果感染發(fā)生在懷孕中期(約第50-70天)，可能產(chǎn)出弱仔或持續(xù)性毒血癥的仔豬。這些持續(xù)性感染的仔豬會因為本身無法產(chǎn)生正常的免疫反應(yīng)來對抗病毒(免疫耐受)，而成為持續(xù)傳播病毒的傳染源。目前常用血清學(xué)(ELISA)方法診斷豬瘟病毒野毒株，但是血清學(xué)檢測方法是抗原和抗體反應(yīng)，僅檢測1次無法準確判斷豬群的感染狀況和排毒狀況；血清學(xué)檢測抗體，檢測的抗體水平高低無法定量檢測分析，血清學(xué)僅能評價機體體液免疫產(chǎn)生的水平；血清學(xué)評估豬群健康度、對無癥狀帶毒和免疫耐受的豬群評估存在技術(shù)上的瓶頸；血清學(xué)需要采集前腔靜脈血，血樣采集相對費力、費時、且需要特殊設(shè)備輔助，多人協(xié)助。聚合酶鏈式反應(yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)擴增技術(shù)作為最基本的基因擴增技術(shù)，現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域，在病毒診斷領(lǐng)域也得到了廣泛的應(yīng)用。然而其擴增結(jié)果受限于檢測對象的模板含量，當模板量很少時，常常獲得陰性結(jié)果。在豬臍帶血豬瘟病毒診斷領(lǐng)域，豬臍帶血中的豬瘟病毒量通常很低，使用傳統(tǒng)的常規(guī)PCR檢測技術(shù)通常由于其靈敏度不夠而出現(xiàn)假陰性結(jié)果，無法滿足要求。巢式PCR擴增技術(shù)是一種建立在常規(guī)PCR技術(shù)上的新技術(shù)，其設(shè)計兩套PCR引物(巢式引物)對模板進行兩輪PCR擴增反應(yīng)。在第一輪擴增中，外引物用以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，以此擴增產(chǎn)物作為模板用內(nèi)引物進行第二輪擴增。由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶位點的可能性(因為與兩套引物都互補的模板很少)因而增加了檢測的敏感性，同時又有兩對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。胎盤(Placenta)通常是指尿膜絨毛膜與子宮黏膜發(fā)生聯(lián)系所形成的結(jié)構(gòu)，包括兩部分，即尿膜絨毛膜的絨毛部分為胎兒胎盤，子宮黏膜部分為母體胎盤。胎兒的血管和子宮血管各自分布到自己的胎盤部分上去，但并不直接相通。臍帶血通常是指胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液。在實際生產(chǎn)中，快速精準檢測臍帶血中的豬瘟病毒野毒株難度相對很大，急需建立一種快速的臍帶血豬瘟病毒野毒株的診斷方法，不僅可以對母豬疫苗株的安全評價及仔豬疾病的快速準確診斷，及時制定防控計劃，具有十分重要的臨床意義，而且可根據(jù)臍帶血檢測結(jié)果評估豬群CSFV野毒感染狀況，開展豬瘟疾病的凈化，達到規(guī)?；i瘟野毒感染為陰性。因此，亟待建立一種可以精準診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的方法。巢式PCR連續(xù)使用兩個PCR反應(yīng)體系進行兩輪PCR擴增，特別在第二輪PCR擴增時反應(yīng)體系中同時存在2對引物，引物與引物之間發(fā)生連接引起非特異性擴增。因此，采用巢式PCR方法診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株，關(guān)鍵是需要根據(jù)Genbank發(fā)布的這些病毒全基因組或部分序列的保守序列，設(shè)計得到特異性引物，并避免引物與引物之間發(fā)生連接引起非特異性擴增。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提出一種診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的引物組、含有該引物組的試劑盒及其應(yīng)用，利用本發(fā)明的引物組所建立的巢式PCR方法具有靈敏度高、特異性好、可重復(fù)性好、檢測結(jié)果快速客觀準確等優(yōu)點，可以快速診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株?；谏鲜瞿康模景l(fā)明提供的一種診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的引物組，所述引物組由內(nèi)外兩套引物組成，外套引物由外套上游引物和外套下游引物組成，內(nèi)套引物由內(nèi)套上游引物和內(nèi)套下游引物組成，各引物的核苷酸序列如下所示：外套上游引物：5’-AGRCCAGACTGGTGGCCNTAYGA-3’，其為SEQIDNO:1序列；外套下游引物：5’-TTYACCACTTCTGTTCTCA-3’，其為SEQIDNO:2序列；內(nèi)套上游引物：5’-TCRWCAACCAAYGAGATAGGG-3’，其為SEQIDNO:3序列；內(nèi)套下游引物：5’-CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC-3’，其為SEQIDNO:4序列。上述引物序列中簡并堿基R表示A或G堿基，N表示A、C、G或T堿基，Y表示T或C堿基，W表示A或T堿基。本發(fā)明還提供了所述的診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的引物組在制備診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株試劑中的應(yīng)用。進一步的，本發(fā)明還提供了一種診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的試劑盒，所述試劑盒包含所述的引物組。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，外套上游引物和外套下游引物的摩爾比為1:1；內(nèi)套上游引物和內(nèi)套下游引物的摩爾比為1:1。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性對照、陽性對照、2×PCRMixture。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述陰性對照為無DNA酶的ddH2O；所述陽性對照為含有豬瘟病毒E2基因片段的克隆質(zhì)粒pEASY-T1-CSFV671，陽性對照pEASY-T1-CSFV671質(zhì)粒的終濃度范圍為1.0×106copies/μl～1.0×107copies/μl。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述豬瘟病毒E2基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，目的片段為272bp。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述克隆質(zhì)粒采用以下方法制備得到：利用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物序列擴增豬瘟病毒E2基因片段，回收片段與pEASY-T1載體連接，篩選陽性克隆，測序正確的克隆質(zhì)粒命名為pEASY-T1-CSFV671。進一步的，本發(fā)明還提供了所述的診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的試劑盒在制備診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株試劑中的應(yīng)用。更進一步的，本發(fā)明還提供了所述的診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的試劑盒的使用方法，包括以下步驟：a.采集經(jīng)豬瘟疫苗免疫的同一頭母豬分娩的所有同窩仔豬的臍帶血，同窩仔豬的臍帶血混合后作為樣品；b.提取步驟a中的樣品的RNA；c.以步驟b得到的RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒通過逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；d.以步驟c得到的cDNA為模板，采用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物序列經(jīng)過PCR擴增得到第一輪PCR擴增產(chǎn)物；e.以步驟d得到的第一輪PCR擴增產(chǎn)物的稀釋液為模板，采用SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的引物序列經(jīng)過PCR擴增得到第二輪PCR擴增產(chǎn)物；f.采用瓊脂糖凝膠電泳法對第二輪PCR擴增產(chǎn)物進行分析：①有擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物長度為272bp，且陰性對照和陽性對照均成立，則表明所檢測的臍帶血樣品中有豬瘟病毒野毒感染；②沒有擴增產(chǎn)物，且陰性對照和陽性對照均成立，則表明所檢測的臍帶血樣品中沒有豬瘟病毒野毒感染，豬瘟疫苗免疫成功。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，第一輪PCR擴增時，PCR反應(yīng)體系以25μL計為：10umol/LSEQIDNO:1所示的上游引物：0.5μL；10umol/LSEQIDNO:2所示的下游引物：0.5μL；2×PCRMixture：12.5μL；200ng/μL的cDNA模板：2μL；ddH2O：補足至25μL；第二輪PCR擴增時，PCR反應(yīng)體系以25μL計為：10umol/LSEQIDNO:3所示的上游引物：0.5μL；10umol/LSEQIDNO:4所示的下游引物：0.5μL；2×PCRMixture：12.5μL；第一輪PCR擴增產(chǎn)物的稀釋液：2μL；ddH2O：補足至25μL；所述第一輪PCR擴增產(chǎn)物的稀釋液為第一輪PCR擴增產(chǎn)物用ddH2O做10倍稀釋得到的稀釋液；第一輪PCR和第二輪PCR反應(yīng)條件均為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性20Sec，57℃退火30Sec，72℃延伸30Sec，共35個循環(huán)；然后72℃延伸10min，最后4℃保護，結(jié)束反應(yīng)。豬屬于上皮絨毛胎盤，豬胎盤生理正常的結(jié)構(gòu)即血胎屏障，胎盤屏障的存在使正常的臍帶血內(nèi)不存在任何病原和抗體等大分子物質(zhì)，即就是不會存在豬瘟基因即豬瘟也就不存在，而采用臍帶血豬瘟疫苗評估，能更加科學(xué)有效直接的評價豬瘟疫苗的使用效果。目前市場上使用的豬瘟主要為豬瘟細胞活疫苗(細胞苗)、豬瘟乳兔組織活疫苗(組織苗)、豬瘟脾淋活疫苗(組織苗)，豬群免疫疫苗后，抗原很快會在母豬體內(nèi)被識別和清除且不會通過血胎屏障在仔豬臍帶血中存在，本發(fā)明主要通過檢測臍帶血中是否含有豬瘟病毒，進而評估判斷的疫苗的質(zhì)量和免疫的效果，精準確定母豬免疫保護力。在巢式PCR擴增中，第一輪PCR擴增后出現(xiàn)的非特異性擴增和過量的外側(cè)引物均會帶入第二輪PCR反應(yīng)再擴增大約35個循環(huán)。使得原本電泳檢測不到的非特異性擴增被指數(shù)倍地放大到電泳檢測水平進而影響后續(xù)實驗。在巢式PCR中若外側(cè)引物與內(nèi)側(cè)引物在第二輪PCR時發(fā)生連接也會造成非特異性擴增。當然內(nèi)側(cè)引物的自然連接有時也是引起非特異性擴增的原因。合理的引物設(shè)計是成功應(yīng)用巢式PCR技術(shù)的關(guān)鍵。在巢式PCR引物設(shè)計的過程，不僅要考慮引物與模板的特異性結(jié)合，還要避免四條巢式引物間形成二聚體。實驗因素也可能影響巢式PCR擴增結(jié)果，如引物濃度過高、退火溫度過低、循環(huán)次數(shù)過多等。提高退火溫度能降低引物與模板間的非特異性結(jié)合，也能抑制引物間的自連接，對兩類非特異性擴增均有減少的作用。但有時過高的退火溫度會影響引物與目的片段的匹配，從而降低PCR反應(yīng)擴增效率導(dǎo)致產(chǎn)物量下降甚至得不到產(chǎn)物?；谝陨弦蛩?，發(fā)明人從眾多設(shè)計的巢式PCR引物組中篩選得到本發(fā)明的引物組，該引物組能特異性與模板結(jié)合，并且引物之間不會自連接形成二聚體，具有較高的特異性。同時發(fā)明人對巢式PCR反應(yīng)條件進行優(yōu)化，選擇了合適的引物濃度、退火溫度、循環(huán)數(shù)等，擴增得到特異性的豬瘟病毒目的片段。利用本發(fā)明的引物組建立的巢式PCR方法能鑒別豬臍帶血中的豬瘟病毒疫苗株和野毒株。采用巢式PCR方法鑒別豬臍帶血中的豬瘟病毒疫苗株和野毒株，關(guān)鍵是需要針對兩者所存在的序列差異片段，設(shè)計得到特異性的引物組。本發(fā)明引物組設(shè)計在CSFV開放性閱讀框(ORF)上，該引物組含有兼并堿基，因此該引物組的廣泛性和特異性強，用于擴增E2基因，檢測結(jié)果能特異性區(qū)分CSFV疫苗毒和CSFV野毒，而且能將豬瘟病毒與牛病毒性黏膜腹瀉病毒和羊邊界病毒區(qū)分開來。另外，結(jié)合豬胎盤的生理結(jié)構(gòu)，豬屬于上皮絨毛胎盤，豬胎盤生理正常的結(jié)構(gòu)即血胎屏障，胎盤屏障的存在使正常的臍帶血內(nèi)不存在任何病原和抗體等大分子物質(zhì)，即使母源抗體(如IgG，12nm)都不能通過此胎盤屏障，是一道天然的保護屏障?？傊?，采用從仔豬臍帶血中檢測CSFVE2基因片段來評價母豬豬瘟野毒帶毒和排毒狀況，仔豬在母體內(nèi)感染狀況和反饋母豬的健康狀況，是一種更加科學(xué)、直接和有效的診斷豬瘟疾病、評估豬瘟疫苗保護力水平和疾病預(yù)警方面的方法之一，在規(guī)?；i場的豬瘟疾病的凈化過程中起到更加可靠的技術(shù)支撐。本發(fā)明巢式PCR檢測方法的工作原理：豬屬于上皮絨毛胎盤，母豬和胎兒獨立血液循環(huán)系統(tǒng)，之間存在血胎盤屏障的緣故，正常的“臍帶血”是不含病原體和抗體物質(zhì)的即無存在任何各種病原的相關(guān)的基因片段，因此，可通過檢測“臍帶血”中是否存在豬瘟病毒基因來判斷母豬免疫豬瘟疫苗后能否有效保護母豬不排毒，仔豬不感染豬瘟病毒，母豬排毒情況即為陽性，進而評價豬瘟疫苗的免疫效果和免疫程序是否合理。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：(1)采用本發(fā)明設(shè)計的引物組所建立的巢式PCR方法可對仔豬臍帶血中的豬瘟病毒野毒感染情況做診斷，從而可以評價母豬豬瘟疫苗的保護力，而且可以預(yù)測和預(yù)警仔豬感染豬瘟病毒野毒的狀況，為疾病防控提供有效的科學(xué)依據(jù)。(2)本發(fā)明的的巢式PCR方法更能直接，有效、綜合評價疫苗免疫母豬后的效果，與傳統(tǒng)的血清學(xué)抗體檢測評估相比更具有優(yōu)勢，該法也是血清學(xué)抗體評估疫苗效果的有效的補充，是非常好的疫苗評估質(zhì)量、免疫效果和免疫程序優(yōu)化的有力工具，可進一步推廣和臨床應(yīng)用。(3)使用本發(fā)明的巢式PCR方法進行仔豬臍帶血檢測，即可鑒別豬瘟病毒野毒株和疫苗株，還可以將豬瘟病毒與牛病毒性黏膜腹瀉病毒和羊邊界病毒區(qū)分開來，根據(jù)鑒別結(jié)果制定相應(yīng)的防控策略，最終達到最終凈化該病的目的。(4)本發(fā)明的巢式PCR方法具有特異性強、靈敏度高、可重復(fù)性好等優(yōu)點。該方法檢測過程簡便，檢測時間短，結(jié)果判定精準簡單。附圖說明圖1為本發(fā)明診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的流程圖；圖2為本發(fā)明實施例A豬場臍帶血樣品巢式PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；其中，M：DL2000DNAMarker，1-6：1#臍帶血樣品-6#臍帶血樣品，+：陽性對照，-：陰性對照；圖3為本發(fā)明實施例B豬場家臍帶血樣品巢式PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；其中，M：DL2000DNAMarker，1-20：1#臍帶血樣品-20#臍帶血樣品，+：陽性對照，-：陰性對照；圖4為本發(fā)明實施例C豬場臍帶血樣品巢式PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；其中，M：DL2000DNAMarker，1-14：1#臍帶血樣品-14#臍帶血樣品，+：陽性對照，-：陰性對照；圖5為本發(fā)明實施例試劑盒特異性試驗的PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；其中，M：DL2000DNAMarker，+：陽性對照，1-8泳道：分別為CSFV-C、PRRSV、CSFV、TGE、PED、PoRV、BVDV和BDV病毒樣品，9-10泳道：為2株CSFV野毒分離株的樣品；圖6為本發(fā)明實施例試劑盒靈敏度試驗的PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；其中，M：DL2000DNAMarker，1：陽性對照，2：陰性對照，3-10：分別為質(zhì)粒pEASY-T1-CSFV671的1-107拷貝數(shù)的樣品；圖7為本發(fā)明實施例試劑盒重復(fù)性試驗的PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；其中，M：DL2000DNAMarker，1-6為CSFV病毒不同批次提取并反轉(zhuǎn)錄的cDNA模板。具體實施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進一步詳細說明。實施例1本發(fā)明試劑盒用于診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株感染的流程圖如圖1所示。具體包括以下步驟：(1)臍帶血樣品采集；(2)臍帶血樣品處理、核酸RNA的提取及cDNA的反轉(zhuǎn)錄；(3)檢測臍帶血全血中豬瘟病毒E2基因片段；(4)根據(jù)檢測結(jié)果，整理分析豬瘟病毒E2基因片段數(shù)據(jù)；(5)評估豬豬瘟疫苗的免疫效果。1.臍帶血中豬瘟病毒總RNA的提取(1)臍帶血的采集臍帶血采集包括以下步驟：a.取干凈的青霉素瓶和瓶塞，清洗干凈，煮沸滅菌30分鐘，烘干后收集備用；b.當仔豬出生時，將每頭母豬分娩的所有仔豬的“臍帶血”都擠到一個干凈的青霉素瓶中，每頭仔豬3-5滴即可，將其“臍帶血”擠到青霉素瓶，密封；注意事項：①必須要采集同窩母豬產(chǎn)的所有的仔豬，避免同窩母豬所產(chǎn)仔豬的個體差異造成漏檢；②可以雙人操作，也可以單獨操作，若仔豬臍帶血不便擠出，可以將臍帶剪成幾段再操作即可；③若母豬分娩出現(xiàn)木乃伊，死胎時，同窩仔豬臍帶血重點檢測；④弱仔的臍帶血可以另外單獨再收集一份，重點檢測；c.臍帶血收集完后蓋好瓶塞，用標簽紙或者醫(yī)用白膠布在青霉素瓶做好標記，注明采集時間、母豬耳號、胎次等信息；d.將收集的臍帶血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷凍保存，送至實驗室檢測，并附上采集臍帶血樣品的數(shù)量、母豬耳號、需要檢測項目的清單。(2)提取臍帶血中豬瘟病毒的總RNA取臍帶血樣品200μL，加入1mLtrizol，渦旋，混勻，靜置5min；50℃水浴消化3h，加入200μL的三氯甲烷，混勻后12000r/min離心15min，取上清，吸取上層液相600μL于一個新的無RNA酶的離心管中，在上清中加入等體積的異丙醇，室溫放置10min沉淀DNA；12000r/min離心10min，沉淀用70％乙醇清洗1次，7500r/min離心5min，沉淀自然干燥10min，30μL的DEPC水溶解RNA。2.cDNA的逆轉(zhuǎn)錄cDNA逆轉(zhuǎn)錄使用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄體系如下所示：名稱體積RevertAidRT1μLRibolockRNaseInhibitor1μLdNTPMixture2μLOligo(dT)1μL5×Reactionbuffer4μLRNA4μLDEPC水加DEPC水至20ul在PCR儀進行如下操作，42℃，30分鐘，70℃，5分鐘，4℃，∞，取出逆轉(zhuǎn)錄擴增產(chǎn)物，進行巢式PCR擴增實驗。3.引物組的設(shè)計采用巢式PCR方法診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株感染，其內(nèi)外引物組設(shè)計是關(guān)鍵。在GenBank基因庫中查找CSFV野毒株的基因序列，然后進行序列比對，找出保守序列區(qū)域，并且CSFV疫苗株、牛病毒性黏膜腹瀉病毒以及羊邊界病毒不具有該保守序列，最終選取豬瘟病毒E2基因保守區(qū)域，并設(shè)計內(nèi)外特異性引物組，序列如下：外套上游引物：5’-AGRCCAGACTGGTGGCCNTAYGA-3’(SEQIDNO:1)；外套下游引物：5’-TTYACCACTTCTGTTCTCA-3’(SEQIDNO:2)；內(nèi)套上游引物：5’-TCRWCAACCAAYGAGATAGGG-3’(SEQIDNO:3)；內(nèi)套下游引物：5’-CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC-3’(SEQIDNO:4)。上述引物序列中簡并堿基R表示A或G堿基，N表示A、C、G或T堿基，Y表示T或C堿基，W表示A或T堿基。上述引物由華大基因合成，用于擴增豬瘟病毒E2基因272bp片段，序列如下所示：4.陽性對照質(zhì)粒的構(gòu)建與制備(1)按照商業(yè)試劑盒操作說明書提取豬瘟病毒RNA；以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2作為特異性引物擴增豬瘟病毒E2基因序列，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性1min；94℃變性15Sec，60℃退火2Sec，62℃延伸20Sec，共45個循環(huán)；然后25℃延伸10sec，最后4℃保護，結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物于2％的瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定；(2)PCR產(chǎn)物的純化、克隆及序列分析：PCR產(chǎn)物用AXYGEN公司的AxyPrepDNAGelExcractionKit膠回收試劑盒回收，然后酶切后與同樣酶切的pEASY-T1克隆載體進行連接，連接后轉(zhuǎn)化Trans1-T1PhageResistant化學(xué)感受態(tài)細胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12h-18h。經(jīng)藍白斑篩選后，用OMEGA公司的PlasmidMiniKit1質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，然后用引物進行擴增和測序，測序后比對成功的克隆質(zhì)粒命名pEASY-T1-CSFV671?？寺≠|(zhì)粒用質(zhì)粒小提試劑盒進行提純，獲得定量標準質(zhì)粒。根據(jù)核酸蛋白檢測儀計測定A260和A280值計算質(zhì)粒濃度，并換算為質(zhì)?？截悢?shù)，克隆質(zhì)粒終濃度為1.0×106copies/μl～1.0×107copies/μl。5.本發(fā)明試劑盒的成分外套上游引物：5’-AGRCCAGACTGGTGGCCNTAYGA-3’(SEQIDNO:1)；外套下游引物：5’-TTYACCACTTCTGTTCTCA-3’(SEQIDNO:2)；內(nèi)套上游引物：5’-TCRWCAACCAAYGAGATAGGG-3’(SEQIDNO:3)；內(nèi)套下游引物：5’-CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC-3’(SEQIDNO:4)；其中簡并堿基R表示A或G堿基，N表示A、C、G或T堿基，Y表示T或C堿基，W表示A或T堿基；陽性對照：含有豬瘟病毒E2基因片段的克隆質(zhì)粒pEASY-T1-CSFV671；陰性對照：無DNA酶的ddH2O；2×PCRMixture。6.采用巢式PCR技術(shù)擴增豬瘟病毒E2基因272bp片段(1)第一輪PCR擴增步驟：以步驟2中的cDNA為模板進行第一輪PCR擴增，反應(yīng)體系如下(25μL)：10umol/L的外套上游引物：0.5μL；10umol/L的外套下游引物：0.5μL；2×PCRMixture：12.5μL；cDNA模板：2μL；加ddH2O補足25uL。其中，外套上游引物：5’-AGRCCAGACTGGTGGCCNTAYGA-3’，外套下游引物：5’-TTYACCACTTCTGTTCTCA-3’；其中簡并堿基R表示A或G堿基，N表示A、C、G或T堿基，Y表示T或C堿基。按照上述體系混合之后，將PCR管放入PCR儀中進行擴增。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性20Sec，57℃退火30Sec，72℃延伸30Sec，35個循環(huán)；然后72℃延伸10min，最后4℃保護，結(jié)束反應(yīng)。(2)第二輪PCR擴增步驟：取豬瘟外套擴增產(chǎn)物用水做10倍稀釋(即1μLPCR擴增產(chǎn)物至9μL水，也可使用滅菌ddH2O來稀釋PCR擴增產(chǎn)物)，按外套引物的體系和反應(yīng)條件進行第二輪PCR擴增。其中內(nèi)套上游引物：5’-TCRWCAACCAAYGAGATAGGG-3’，內(nèi)套下游引物：5’-CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC-3’；其中簡并堿基R表示A或G堿基，Y表示T或C堿基，W表示A或T堿基。同時設(shè)有陽性對照和陰性對照，陽性對照和陰性對照與待測樣品同時進行巢式PCR擴增。陰性對照為無DNA酶的ddH2O；陽性對照為含有外套引物特異性擴增片段(豬瘟病毒E2基因片段)的克隆質(zhì)粒pEASY-T1-CSFV671，陽性對照pEASY-T1-CSFV671質(zhì)粒的終濃度范圍為1.0×106copies/μl～1.0×107copies/μl。取10μL第二輪PCR擴增產(chǎn)物跑1.5％瓊脂糖膠，觀察跑膠結(jié)果。在擴增豬瘟病毒E2基因片段，目的片段為272bp，則判斷為陽性即CSFV存在，否則為陰性，即檢測不到CSFV病毒存在。7.檢測結(jié)果的判定待測樣品擴增得到272bp左右的目的片段，同時陰性對照和陽性對照均成立，即陰性對照沒有檢測到目的片段，陽性對照檢測到目的片段，則判斷為陽性，即仔豬臍帶血中感染豬瘟病毒野毒，表明母豬存在排毒現(xiàn)象，疫苗保護力存在一定不足，建議加強免疫接種或調(diào)整免疫程序；若待測樣品沒有擴增得到272bp左右的目的片段，同時陰性對照和陽性對照均成立，即陰性對照沒有檢測到目的片段，陽性對照檢測到目的片段，則判斷為陰性，即仔豬臍帶血中沒有感染豬瘟病毒野毒，表明豬瘟疫苗免疫母豬保護力很好，且仔豬無感染豬瘟病毒，疫苗免疫效果和免疫程序很到位。實施例2A廠家母豬豬場，豬瘟疫苗均在生產(chǎn)前21天免疫接種，母豬的選擇隨機分組，為了進一步評估豬瘟疫苗對母豬的保護力效果和仔豬感染情況，故采集6窩分娩母豬的仔豬臍帶血，按照實施1所述的方法進行豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的診斷，評估豬瘟疫苗的免疫效果，仔豬感染豬瘟病毒的情況。結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出，陽性對照擴增出272bp條帶，陰性對照無272bp條帶擴增，樣品1-6的臍帶血中均無特異性272bp條帶擴增，表明樣品1-6的臍帶血中不存在豬瘟病毒，母豬不存在豬瘟病毒的排毒和仔豬感染現(xiàn)象，母豬健康水平高，進一步表明母豬的豬瘟疫苗免疫效果且免疫程序很好。B廠家豬瘟疫苗相對還是很好的能夠有效阻斷豬瘟病毒通過血胎屏障侵襲胎兒，這與我國對豬瘟的防控采用全群免疫有關(guān)。實施例3B廠家母豬豬場，豬瘟疫苗均在生產(chǎn)前21天免疫接種，母豬的選擇隨機分組，為了進一步評估豬瘟疫苗對母豬的保護力效果和仔豬感染情況，故采集20窩分娩母豬的仔豬臍帶血，按照實施1所述的方法進行豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的診斷，評估豬瘟疫苗的免疫效果，仔豬感染豬瘟病毒的情況。結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出，陽性對照擴增出272bp條帶，陰性對照無272bp條帶擴增，樣品1-20的臍帶血中均均無特異性272bp條帶擴增，表明樣品1-20的臍帶血中不存在豬瘟病毒，母豬不存在豬瘟病毒的排毒和仔豬感染現(xiàn)象，母豬健康水平高，進一步表明母豬的豬瘟疫苗免疫效果且免疫程序很好。B廠家豬瘟疫苗相對還是很好的能夠有效阻斷豬瘟病毒通過血胎屏障侵襲胎兒，這與我國對豬瘟的防控采用全群免疫有關(guān)。實施例4C廠家母豬豬場，豬瘟疫苗均在生產(chǎn)前21天免疫接種，母豬的選擇隨機分組，為了進一步評估豬瘟疫苗對母豬的保護力效果和仔豬感染情況，故隨機采集14窩分娩母豬的仔豬臍帶血，按照實施1所述的方法進行豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的診斷，評估豬瘟疫苗的免疫效果，仔豬感染豬瘟病毒的情況。結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，陽性對照擴增出272bp條帶，陰性對照無272bp條帶擴增，編號3、8、10、11、13的臍帶血樣品中擴增出272bp條帶，表明3、8、10、11、13的臍帶血樣品的臍帶血中存在豬瘟病毒，表明母豬存在豬瘟病毒的排毒和仔豬可能感染的現(xiàn)象，進一步表明母豬的豬瘟疫苗免疫效果存在問題，建議C場加強母豬的豬瘟疫苗免疫或調(diào)整免疫程序，對仔豬做好豬瘟疫苗緊急免疫以防疾病的發(fā)生。實施例5特異性研究分別提取豬瘟病毒野毒株(CSFV-S)、疫苗株C株(CSFV-C)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGE)、豬流行性腹瀉病毒(PED)、輪狀病毒(PoRV)、牛病毒性黏膜腹瀉病毒(BVDV)和羊邊界病毒(BDV)的核酸為模板，以實施例1所述的方法進行巢式PCR分析，驗證SEQIDNO:1-SEQIDNO:4所示的上游引物和下游引物的特異性。結(jié)果如圖5所示，從圖5中可以看出，本發(fā)明PCR方法能特異性擴增出豬瘟病毒野毒株CSFV-S，而其它常見病毒，如CSFV-C、PRRSV、CSFV、TGE、PED、PoRV、BVDV和BDV病毒樣品均未擴增出基因片段，且設(shè)計合成的引物對之間以及引物與其他病毒之間無交叉反應(yīng)，表明本發(fā)明使用的引物特異性高，適合作為巢式PCR引物。實施例6靈敏度研究用實施例1所述的方法對10倍梯度稀釋的陽性對照質(zhì)粒pEASY-T1-CSFV671為模板進行檢測。結(jié)果見圖6，圖6表明，該PCR方法對陽性對照的DNA模板的最低檢出量約為1000個拷貝。實施例7重復(fù)性研究提取不同批次豬瘟病毒野毒株的基因組RNA，按照實施例1所述的方法進行樣品處理，得到的cDNA用本發(fā)明的試劑盒進行特異性擴增，產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳后觀察，評價不同批次樣品的擴增重復(fù)性好壞，結(jié)果見圖7，結(jié)果表明本發(fā)明的試劑盒對不同批次的樣品均能有效擴增，擴增重復(fù)性較好。綜上可見，本發(fā)明設(shè)計巢式PCR特異性引物組以及構(gòu)成的試劑盒可以快速診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株，與豬瘟病毒疫苗株、牛病毒性黏膜腹瀉病毒和羊邊界病毒及其它常見豬病無非特異性擴增。該檢測方法簡單、快速、特異性好、靈敏度高、可重復(fù)性好，檢測結(jié)果真實可靠。所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解：以上任何實施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開的范圍(包括權(quán)利要求)被限于這些例子；在本發(fā)明的思路下，以上實施例或者不同實施例中的技術(shù)特征之間也可以進行組合，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡明它們沒有在細節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。序列表<110>湖南新南方養(yǎng)殖服務(wù)有限公司<120>一種診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的引物組、含有該引物組的試劑盒及其應(yīng)用<130>FI160459-ND<160>5<170>PatentInversion3.5<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>1agrccagactggtggccntayga23<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>2ttyaccacttctgttctca19<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3tcrwcaaccaaygagataggg21<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>4cacagyccraayccraagtcatc23<210>5<211>272<212>DNA<213>CSFVE2基因序列<400>5tcrwcaaccaaygagatagggccactaggggctgaaggtctcactaccacttggaaagaa60tacaaccacggcctgcagctggacgacgggaccgtcagggccatttgcactgcagggtct120ttcaaagttacagcacttaatgtggttagtaggaggtacctagcatcattacataagagg180gctttgcccacctcagttacatttgaactcctatttgatgggaccaccccagcagttgag240gaaatgggagatgacttyggrttyggrctgtg272當前第1頁1 2 3