1.一種診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的引物組,其特征在于,所述引物組由內(nèi)外兩套引物組成,外套引物由外套上游引物和外套下游引物組成,內(nèi)套引物由內(nèi)套上游引物和內(nèi)套下游引物組成,各引物的核苷酸序列如下所示:
外套上游引物:5’-AGRCCAGACTGGTGGCCNTAYGA-3’,其為SEQ ID NO:1序列;
外套下游引物:5’-TTYACCACTTCTGTTCTCA-3’,其為SEQ ID NO:2序列;
內(nèi)套上游引物:5’-TCRWCAACCAAYGAGATAGGG-3’,其為SEQ ID NO:3序列;
內(nèi)套下游引物:5’-CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC-3’,其為SEQ ID NO:4序列;
其中,兼并堿基R表示A或G堿基,N表示A、C、G或T堿基,Y表示T或C堿基,W表示A或T堿基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的引物組在制備診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株試劑中的應(yīng)用。
3.一種診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒包含權(quán)利要求1所述的引物組。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的試劑盒,其特征在于,外套上游引物和外套下游引物的摩爾比為1:1;內(nèi)套上游引物和內(nèi)套下游引物的摩爾比為1:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒還包括陰性對照、陽性對照、2×PCR Mixture。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的試劑盒,其特征在于,所述陰性對照為無DNA酶的ddH2O;所述陽性對照為含有豬瘟病毒E2基因片段的克隆質(zhì)粒pEASY-T1-CSFV671,陽性對照pEASY-T1-CSFV671質(zhì)粒的終濃度范圍為1.0×106copies/μl~1.0×107copies/μl;所述豬瘟病毒E2基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的試劑盒,其特征在于,所述克隆質(zhì)粒采用以下方法制備得到:利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列擴(kuò)增豬瘟病毒E2基因片段,回收片段與pEASY-T1載體連接,篩選陽性克隆,測序正確的克隆質(zhì)粒命名為pEASY-T1-CSFV671。
8.根據(jù)權(quán)利要求3-7任一項(xiàng)所述的診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的試劑盒在制備診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株試劑中的應(yīng)用。
9.一種如權(quán)利要求3-7任一項(xiàng)所述的診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的試劑盒的使用方法,其特征在于,包括以下步驟:
a.采集經(jīng)豬瘟疫苗免疫的同一頭母豬分娩的所有同窩仔豬的臍帶血,同窩仔豬的臍帶血混合后作為樣品;
b.提取步驟a中的樣品的RNA;
c.以步驟b得到的RNA為模板,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒通過逆轉(zhuǎn)錄,得到cDNA;
d.以步驟c得到的cDNA為模板,采用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;
e.以步驟d得到的第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋液為模板,采用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物序列經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;
f.采用瓊脂糖凝膠電泳法對第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析:①有擴(kuò)增產(chǎn)物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為272bp,且陰性對照和陽性對照均成立,則表明所檢測的臍帶血樣品中有豬瘟病毒野毒感染;②沒有擴(kuò)增產(chǎn)物,且陰性對照和陽性對照均成立,則表明所檢測的臍帶血樣品中沒有豬瘟病毒野毒感染,豬瘟疫苗免疫成功。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的診斷豬臍帶血豬瘟病毒野毒株的試劑盒的使用方法,其特征在于,第一輪PCR擴(kuò)增時,PCR反應(yīng)體系以25μL計為:
10umol/LSEQ ID NO:1所示的上游引物:0.5μL;
10umol/LSEQ ID NO:2所示的下游引物:0.5μL;
2×PCR Mixture:12.5μL;
200ng/μL的cDNA模板:2μL;
ddH2O:補(bǔ)足至25μL;
第二輪PCR擴(kuò)增時,PCR反應(yīng)體系以25μL計為:
10umol/LSEQ ID NO:3所示的上游引物:0.5μL;
10umol/LSEQ ID NO:4所示的下游引物:0.5μL;
2×PCR Mixture:12.5μL;
第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋液:2μL;
ddH2O:補(bǔ)足至25μL;
所述第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋液為第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用ddH2O做10倍稀釋得到的稀釋液;
第一輪PCR和第二輪PCR反應(yīng)條件均為:95℃預(yù)變性5min;94℃變性20Sec,57℃退火30Sec,72℃延伸30Sec,共35個循環(huán);然后72℃延伸10min,最后4℃保護(hù),結(jié)束反應(yīng)。