本發(fā)明涉及生物化學(xué)與生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法。

背景技術(shù)：

隨著畜禽養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展，副產(chǎn)物隨之大量增加，這些副產(chǎn)物的深加工必須跟上養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展步伐，才能提高畜禽養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益，減少資源浪費，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)持續(xù)、快速、健康、穩(wěn)定地發(fā)展。因此，加強畜禽副產(chǎn)物的開發(fā)利用具有十分重要的意義。畜禽副產(chǎn)物的開發(fā)利用主要包括對畜禽的血液、骨、內(nèi)臟、皮毛、蹄等的綜合加工利用。目前，利用畜禽的副產(chǎn)品進(jìn)行生化制藥，己是與現(xiàn)代生物科技緊密結(jié)合的一項高科技產(chǎn)業(yè)，如何發(fā)展更多具有科技含量高、附加值高的畜禽副產(chǎn)品利用項目，已成為畜禽副產(chǎn)品研究、開發(fā)的重點。

畜禽骨骼由骨膜、骨質(zhì)、骨髓構(gòu)成，是蛋白質(zhì)和鈣質(zhì)組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，再構(gòu)成管狀，管內(nèi)充滿了含多種營養(yǎng)物質(zhì)的骨髓，如構(gòu)成腦組織的磷脂及防止老化的骨膠原、軟骨素等，鮮骨中含有蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)(如鈣、磷、鐵等)、骨膠原、軟骨素以及維生素A、B1、B2等。

畜骨蛋白是較為全價的可溶性蛋白質(zhì)，生物學(xué)效價高。骨蛋白的主要成分為膠原蛋白。畜骨中的蛋白質(zhì)提取主要是指對骨膠的提取。骨膠就是粉碎后的畜骨經(jīng)洗滌脫脂，加酸去雜，浸泡熬煮，濃縮成膠凍狀的物質(zhì)。骨膠的主要成分就是骨蛋白，它被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品工業(yè)中。

膠原多肽亦稱水解明膠，是膠原或明膠經(jīng)過蛋白酶等降解處理得到的分子量約為3000～20000Da，與明膠相比具有較強的水溶性，易被人體吸收的一類多肽混合物。膠原多肽具有較多的生理功能，例如抗高血壓、預(yù)防與治療骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松、治療胃潰瘍等疾病、抗衰老和抗氧化等。因此，膠原多肽在保健食品、化妝品等領(lǐng)域具有較廣泛的用途。

一般的膠原多肽生產(chǎn)方法按工藝類型分有種酸法、堿法、高溫?zé)峤夥ê兔阜?。酸法和堿法工藝簡單，成本低，但產(chǎn)品中含鹽量較高，相對分子質(zhì)量分布較寬，不適合生產(chǎn)高品質(zhì)的食品級膠原多肽，而且由于這兩種方法在生產(chǎn)過程中需要長時間浸泡，對設(shè)備的材質(zhì)要求都比較高。高溫?zé)峤夥óa(chǎn)品含鹽量低，但水解時間長，需帶壓操作，產(chǎn)品相對分子質(zhì)量分布不均且不易控制，也不適合生產(chǎn)高品質(zhì)的食品級膠原多肽。與前三種方法相比，酶法生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品的相對分子質(zhì)量分布較窄，易控制，而且衛(wèi)生環(huán)保。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種操作簡單、生產(chǎn)周期短、可提高資源利用率、提高畜禽養(yǎng)殖附加值的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法。

本發(fā)明提供的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法，包括如下步驟：

步驟一、軟骨預(yù)處理：將新鮮軟骨剔除骨膜，剝?nèi)埩舻募∪?、脂肪和筋膜，用生理鹽水沖洗去殘留的雜質(zhì)后稱重；

步驟二、軟骨粉的制備：經(jīng)步驟一處理后的軟骨軋成小塊，高壓蒸煮、去除油脂、干燥粉碎；

步驟三、脫脂處理：取一定量軟骨粉加入脫脂劑，攪拌脫脂處理，直到脫脂完全后濾去脫脂劑；

步驟四、脫鈣處理：經(jīng)步驟三脫脂后，加入脫鈣劑，攪拌脫鈣處理，直到軟骨變?nèi)彳浲该鳡詈鬄V去脫鈣劑；

步驟五、除雜沉淀：在軟骨中加入鹽酸胍，攪拌處理，去除糖蛋白雜質(zhì)，離心棄上清液，得沉淀物；

步驟六、膠原蛋白的制備：在沉淀物中加入醋酸胃蛋白酶消化后離心處理，取上清液加入氯化鈉溶液，過夜鹽析，離心得絮狀白色沉淀物；

步驟七：測定膠原蛋白含量：采用Woessner法測定步驟六中絮狀白色沉淀物的膠原蛋白含量，然后冷凍干燥；

步驟八：配制膠原蛋白液：將冷凍干燥后的膠原蛋白溶于0.5mol/L的乙酸溶液中，配成2mg/mL的膠原蛋白液；

步驟九：膠原蛋白多肽液半成品的制備：在步驟八配制的膠原蛋白液中加入堿性蛋白酶酶解，得酶解液；

步驟十：膠原蛋白多肽的制備：將酶解液過濾后采用凝膠分離技術(shù)進(jìn)行分離提純，收集出現(xiàn)蛋白質(zhì)峰的洗脫液，冷凍干燥。

在本發(fā)明提供的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法的一種較佳實施例中，所述步驟二具體為，將軟骨軋成5x5cm的小塊，放入殺菌鍋內(nèi)蒸煮1小時，蒸煮氣壓為0.1MPa，蒸煮溫度為121℃，將軟化后的軟骨用清水洗去多余的油脂，放入干燥箱中以70℃的溫度烘制5～6小時，烘制后用粉碎機粉碎成軟骨粉。

在本發(fā)明提供的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法的一種較佳實施例中，所述步驟三中，軟骨粉與脫脂劑的用料比為1：10，在25～30℃的溫度下攪拌脫脂處理2天，所述脫脂劑由氯仿、甲醇、水按比例混合而成，所述氯仿、甲醇、水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為1：2：0.8。

在發(fā)明提供的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法的一種較佳實施例中，所述步驟四中，軟骨粉與脫鈣劑的用料比為1：10，在25～30℃的溫度下攪拌脫鈣處理2天，所述脫鈣劑采用濃度為0.5mol/L的EDTA溶液。

在本發(fā)明提供的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法的一種較佳實施例中，所述步驟五中，鹽酸胍采用的濃度為4mol/L，且按每克軟骨加入10mL鹽酸胍，在25℃的溫度下攪拌處理2天后，在4℃、12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理30分鐘。

在本發(fā)明提供的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法的一種較佳實施例中，所述步驟六具體為，醋酸胃蛋白酶以10倍于沉淀物的體積加入，并在4℃的溫度下消化48小時，在4℃、12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理30分鐘后，取上清液加入20％的氯化鈉溶液，過夜鹽析，再以在4℃、12000rpm的轉(zhuǎn)速離心處理，得到絮狀白色沉淀物。

在本發(fā)明提供的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法的一種較佳實施例中，所述步驟六中，所述醋酸胃蛋白酶的濃度為0.5mol/L，pH值為2.5～3.0，其包括100mg/100mL的胃蛋白酶和20mg/100mL的疊氮鈉。

在本發(fā)明提供的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法的一種較佳實施例中，所述步驟九中，堿性蛋白酶的體積分?jǐn)?shù)為1.2％，pH值為10.0，并在60～65℃的溫度下酶解2小時。

在本發(fā)明提供的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法的一種較佳實施例中，所述步驟十具體為，將預(yù)處理過的SepHadex-G50裝入層析柱，用經(jīng)過超聲脫氣后的流速為0.9ml/min的超純水洗脫壓實，將酶解液經(jīng)過過濾器后裝入層析柱中以0.5ml/min的流速在室溫下進(jìn)行分離提純，收集出現(xiàn)蛋白質(zhì)峰的洗脫液，冷凍干燥。

本發(fā)明提供的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法的有益效果是：

本制備工藝操作步驟簡單方便，應(yīng)用廣泛，不僅可用于動物軟骨，還可用于動物骨骼和其它組織，利用堿性蛋白酶將軟骨膠原蛋白消化分解成多肽和氨基酸，其中多肽的分子量可達(dá)3000～20000Da，氨基酸的種類可達(dá)18種之多，總量可達(dá)40mg/100mL，提高了畜禽養(yǎng)殖附加值，其生成的產(chǎn)品可作為保健品，用于預(yù)防高血壓預(yù)防與治療骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松、治療胃潰瘍等疾病、抗衰老和抗氧化等方面；

本制備工藝不僅很好的開發(fā)和利用了動物骨骼，增加了對動物副產(chǎn)物的開發(fā)價值和空間，而且深化和豐富了膠原蛋白和膠原蛋白肽提取的方法，為膠原蛋白多肽應(yīng)用范圍的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中：

圖1是本發(fā)明提供的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法的一種實施例的工藝流程圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

請參閱圖1，是本發(fā)明提供的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法的一種實施例的工藝流程圖。

所述制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法S1包括如下步驟：

步驟S11、軟骨預(yù)處理：將新鮮軟骨剔除骨膜，剝?nèi)埩舻募∪狻⒅竞徒钅?，用生理鹽水沖洗去殘留的雜質(zhì)后稱重；

步驟S12、軟骨粉的制備：經(jīng)步驟一處理后的軟骨軋成小塊，高壓蒸煮、去除油脂、干燥粉碎；

具體地，將軟骨軋成5x5cm的小塊，放入殺菌鍋內(nèi)蒸煮1小時，蒸煮氣壓為0.1MPa，蒸煮溫度為121℃，將軟化后的軟骨用清水洗去多余的油脂，放入干燥箱中以70℃的溫度烘制5～6小時，烘制后用粉碎機粉碎成軟骨粉；

步驟S13、脫脂處理：取一定量軟骨粉加入脫脂劑，攪拌脫脂處理，直到脫脂完全后濾去脫脂劑；

具體地，軟骨粉與脫脂劑的用料比為1：10，在25～30℃的溫度下攪拌脫脂處理2天，所述脫脂劑由氯仿、甲醇、水按比例混合而成，所述氯仿、甲醇、水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為1：2：0.8；

步驟S14、脫鈣處理：經(jīng)步驟三脫脂后，加入脫鈣劑，攪拌脫鈣處理，直到軟骨變?nèi)彳浲该鳡詈鬄V去脫鈣劑；

具體地，軟骨粉與脫鈣劑的用料比為1：10，在25～30℃的溫度下攪拌脫鈣處理2天，所述脫鈣劑采用濃度為0.5mol/L的EDTA溶液；

步驟S15、除雜沉淀：在軟骨中加入鹽酸胍，攪拌處理，去除糖蛋白雜質(zhì)，離心棄上清液，得沉淀物；

具體地，鹽酸胍采用的濃度為4mol/L，且按每克軟骨加入10mL鹽酸胍，在25℃的溫度下攪拌處理2天后，在4℃、12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理30分鐘；

步驟S16、膠原蛋白的制備：在沉淀物中加入醋酸胃蛋白酶消化后離心處理，取上清液加入氯化鈉溶液，過夜鹽析，離心得絮狀白色沉淀物；

具體地，醋酸胃蛋白酶以10倍于沉淀物的體積加入，并在4℃的溫度下消化48小時，在4℃、12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理30分鐘后，取上清液加入20％的氯化鈉溶液，過夜鹽析，再以在4℃、12000rpm的轉(zhuǎn)速離心處理，得到絮狀白色沉淀物；

具體地，所述醋酸胃蛋白酶的濃度為0.5mol/L，pH值為2.5～3.0，其包括100mg/100mL的胃蛋白酶和20mg/100mL的疊氮鈉；

步驟S17：測定膠原蛋白含量：采用Woessner法測定步驟六中絮狀白色沉淀物的膠原蛋白含量，然后冷凍干燥；

步驟S18：配制膠原蛋白液：將冷凍干燥后的膠原蛋白溶于0.5mol/L的乙酸溶液中，配成2mg/mL的膠原蛋白液；

步驟S19：膠原蛋白多肽液半成品的制備：在步驟八配制的膠原蛋白液中加入堿性蛋白酶酶解，得酶解液；

具體地，堿性蛋白酶的體積分?jǐn)?shù)為1.2％，pH值為10.0，并在60～65℃的溫度下酶解2小時；

步驟S20：膠原蛋白多肽的制備：將酶解液過濾后采用凝膠分離技術(shù)進(jìn)行分離提純，收集出現(xiàn)蛋白質(zhì)峰的洗脫液，冷凍干燥；

具體地，將預(yù)處理過的SepHadex-G50裝入層析柱，用經(jīng)過超聲脫氣后的流速為0.9ml/min的超純水洗脫壓實，將酶解液經(jīng)過過濾器后裝入層析柱中以0.5ml/min的流速在室溫下進(jìn)行分離提純，收集出現(xiàn)蛋白質(zhì)峰的洗脫液，冷凍干燥。

本發(fā)明提供的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法S1的有益效果是：

本制備工藝操作步驟簡單方便，應(yīng)用廣泛，不僅可用于動物軟骨，還可用于動物骨骼和其它組織，利用堿性蛋白酶將軟骨膠原蛋白消化分解成多肽和氨基酸，其中多肽的分子量可達(dá)3000～20000Da，氨基酸的種類可達(dá)18種之多，總量可達(dá)40mg/100mL，提高了畜禽養(yǎng)殖附加值，其生成的產(chǎn)品可作為保健品，用于預(yù)防高血壓預(yù)防與治療骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松、治療胃潰瘍等疾病、抗衰老和抗氧化等方面；

本制備工藝不僅很好的開發(fā)和利用了動物骨骼，增加了對動物副產(chǎn)物的開發(fā)價值和空間，而且深化和豐富了膠原蛋白和膠原蛋白肽提取的方法，為膠原蛋白多肽應(yīng)用范圍的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其它相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍之內(nèi)。