1.一種制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法,其特征在于:包括如下步驟:
步驟一、軟骨預(yù)處理:將新鮮軟骨剔除骨膜,剝?nèi)埩舻募∪?、脂肪和筋膜,用生理鹽水沖洗去殘留的雜質(zhì)后稱重;
步驟二、軟骨粉的制備:經(jīng)步驟一處理后的軟骨軋成小塊,高壓蒸煮、去除油脂、干燥粉碎;
步驟三、脫脂處理:取一定量軟骨粉加入脫脂劑,攪拌脫脂處理,直到脫脂完全后濾去脫脂劑;
步驟四、脫鈣處理:經(jīng)步驟三脫脂后,加入脫鈣劑,攪拌脫鈣處理,直到軟骨變?nèi)彳浲该鳡詈鬄V去脫鈣劑;
步驟五、除雜沉淀:在軟骨中加入鹽酸胍,攪拌處理,去除糖蛋白雜質(zhì),離心棄上清液,得沉淀物;
步驟六、膠原蛋白的制備:在沉淀物中加入醋酸胃蛋白酶消化后離心處理,取上清液加入氯化鈉溶液,過夜鹽析,離心得絮狀白色沉淀物;
步驟七:測定膠原蛋白含量:采用Woessner法測定步驟六中絮狀白色沉淀物的膠原蛋白含量,然后冷凍干燥;
步驟八:配制膠原蛋白液:將冷凍干燥后的膠原蛋白溶于0.5mol/L的乙酸溶液中,配成2mg/mL的膠原蛋白液;
步驟九:膠原蛋白多肽液半成品的制備:在步驟八配制的膠原蛋白液中加入堿性蛋白酶酶解,得酶解液;
步驟十:膠原蛋白多肽的制備:將酶解液過濾后采用凝膠分離技術(shù)進(jìn)行分離提純,收集出現(xiàn)蛋白質(zhì)峰的洗脫液,冷凍干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法,其特征在于:所述步驟二具體為,將軟骨軋成5x5cm的小塊,放入殺菌鍋內(nèi)蒸煮1小時(shí),蒸煮氣壓為0.1MPa,蒸煮溫度為121℃,將軟化后的軟骨用清水洗去多余的油脂,放入干燥箱中以70℃的溫度烘制5~6小時(shí),烘制后用粉碎機(jī)粉碎成軟骨粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法,其特征在于:所述步驟三中,軟骨粉與脫脂劑的用料比為1:10,在25~30℃的溫度下攪拌脫脂處理2天,所述脫脂劑由氯仿、甲醇、水按比例混合而成,所述氯仿、甲醇、水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為1:2:0.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法,其特征在于:所述步驟四中,軟骨粉與脫鈣劑的用料比為1:10,在25~30℃的溫度下攪拌脫鈣處理2天,所述脫鈣劑采用濃度為0.5mol/L的EDTA溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法,其特征在于:所述步驟五中,鹽酸胍采用的濃度為4mol/L,且按每克軟骨加入10mL鹽酸胍,在25℃的溫度下攪拌處理2天后,在4℃、12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理30分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法,其特征在于:所述步驟六具體為,醋酸胃蛋白酶以10倍于沉淀物的體積加入,并在4℃的溫度下消化48小時(shí),在4℃、12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理30分鐘后,取上清液加入20%的氯化鈉溶液,過夜鹽析,再以在4℃、12000rpm的轉(zhuǎn)速離心處理,得到絮狀白色沉淀物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法,其特征在于:所述步驟六中,所述醋酸胃蛋白酶的濃度為0.5mol/L,pH值為2.5~3.0,其包括100mg/100mL的胃蛋白酶和20mg/100mL的疊氮鈉。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法,其特征在于:所述步驟九中,堿性蛋白酶的體積分?jǐn)?shù)為1.2%,pH值為10.0,并在60~65℃的溫度下酶解2小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備畜禽軟骨膠原蛋白多肽的方法,其特征在于:所述步驟十具體為,將預(yù)處理過的SepHadex-G50裝入層析柱,用經(jīng)過超聲脫氣后的流速為0.9ml/min的超純水洗脫壓實(shí),將酶解液經(jīng)過過濾器后裝入層析柱中以0.5ml/min的流速在室溫下進(jìn)行分離提純,收集出現(xiàn)蛋白質(zhì)峰的洗脫液,冷凍干燥。