本發(fā)明涉及一種促進(jìn)甘薯黑斑病菌分生孢子穩(wěn)定萌發(fā)并獲得最佳觀察效果的方法，特別涉及一種利用甘薯葉片組織液促進(jìn)特定培養(yǎng)條件下甘薯黑斑病菌的分生孢子穩(wěn)定萌發(fā)并獲得最佳觀察效果的方法。
背景技術(shù)：
：甘薯黑斑病是甘薯大田栽培期及儲(chǔ)藏期的主要病害，每年由于該病造成的產(chǎn)量損失一般為5％～10％，危害嚴(yán)重時(shí)可達(dá)20％～50％，甚至更高。同時(shí)，病薯還會(huì)產(chǎn)生甘薯黑斑霉酮(ipomeamarone)和甘薯黑斑霉二酮(ipomeanine)等有毒物質(zhì)，人和家畜食用后可引起中毒，甚至死亡，因此甘薯黑斑病的防治成為甘薯病害防治的重點(diǎn)。甘薯黑斑病的防治主要是依賴(lài)于殺菌劑的使用，但是現(xiàn)有的殺菌劑存在藥劑品種單一、抗藥性風(fēng)險(xiǎn)增加的問(wèn)題，因此篩選新的防治藥劑成為甘薯黑斑病的研究方向。篩選新的防治藥劑的關(guān)鍵步驟之一就是進(jìn)行室內(nèi)的藥效評(píng)價(jià)，即通常利用抑制病原真菌孢子萌發(fā)試驗(yàn)(NY/T1156.1-2006)和抑制病原真菌菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn)(NY/T1156.2-2006)來(lái)評(píng)價(jià)藥劑的保護(hù)和治療作用。由于甘薯黑斑病菌(Ceratocystisfimbriata)的分生孢子在水滴中萌發(fā)率極低，無(wú)法滿(mǎn)足“藥效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)”中分生孢子穩(wěn)定萌發(fā)90％以上的試驗(yàn)要求，造成藥劑篩選工作無(wú)法進(jìn)行。因此建立一種簡(jiǎn)單、穩(wěn)定的提高甘薯黑斑病菌分生孢子萌發(fā)率的技術(shù)體系，是本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)問(wèn)題，也是農(nóng)藥生測(cè)和相關(guān)抗藥性研究的必要條件。目前關(guān)于如何保證侵染甘薯的黑斑病菌分生孢子萌發(fā)率在90％以上及保持穩(wěn)定萌發(fā)并獲得最佳觀察效果的方法國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均無(wú)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種促進(jìn)甘薯黑斑病菌分生孢子穩(wěn)定萌發(fā)并獲得最佳觀察效果的方法，該方法能夠使甘薯黑斑病菌分生孢子萌發(fā)率穩(wěn)定在90％以上，并確定了最佳觀察時(shí)間。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種促進(jìn)甘薯黑斑病菌分生孢子穩(wěn)定萌發(fā)并獲得最佳觀察效果的方法，所述的方法是將甘薯黑斑病菌菌株接種在P+S培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7-21d，再制備分生孢子懸浮液；在分生孢子懸浮液中加入甘薯葉片組織液，繼續(xù)培養(yǎng)，直至分生孢子懸浮液中的甘薯黑斑病菌分生孢子萌發(fā)并獲得最佳觀察效果，進(jìn)行鏡檢。所述的甘薯黑斑病菌菌株為甘薯長(zhǎng)喙殼(Ceratocystisfimbriata)CFSC-01，保藏編號(hào)：CGMCCNo.3.18030，保藏日期：2016年9月26日；保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。所述的P+S培養(yǎng)基的制備方法為：將馬鈴薯、甘薯去皮切塊，稱(chēng)取馬鈴薯塊20g、甘薯塊100g混合，加水煮爛，過(guò)濾，濾液中加入葡萄糖0.02g、瓊脂粉13g，再加水定容至1L。所述甘薯黑斑病菌株在P+S培養(yǎng)基上培養(yǎng)的條件為：24-26℃、黑暗條件下。所述制備分生孢子懸浮液的方法為：用無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)基表面的菌體即得。所述的分生孢子懸浮液中分生孢子濃度為1×106個(gè)/ml。所述的甘薯葉片組織液的制備方法為：將1g甘薯葉片組織加2ml水研磨離心后，取上清液，加水定容至2ml，得到甘薯葉片組織液，-20℃避光保存；使用時(shí)，室溫溶解，使用后重新置于-20℃避光保存，甘薯葉片組織液的有效期從制備完成開(kāi)始計(jì)，為3周。所述的甘薯葉片組織液的加入量為每1ml分生孢子懸浮液加入15-30μl甘薯葉片組織液。所述的繼續(xù)培養(yǎng)直至分生孢子懸浮液中的甘薯黑斑病菌分生孢子萌發(fā)并獲得最佳觀察效果的條件為：24-26℃、黑暗條件下，培養(yǎng)2.5-3h至分生孢子芽管長(zhǎng)度為2-4個(gè)分生孢子長(zhǎng)度。本發(fā)明的有益效果：1、本發(fā)明結(jié)合甘薯黑斑病菌的特性，通過(guò)反復(fù)的實(shí)驗(yàn)論證，最終得到一種促進(jìn)甘薯黑斑病菌分生孢子穩(wěn)定萌發(fā)的方法，該方法能夠使甘薯黑斑病菌分生孢子萌發(fā)率穩(wěn)定在90％以上，并確定了最佳觀察時(shí)間，滿(mǎn)足了殺菌劑藥劑篩選試驗(yàn)的必要條件。2、本發(fā)明的方法能夠保證同一批培養(yǎng)的菌株，在7-21d的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)任意時(shí)段制備的分生孢子懸浮液，均可達(dá)到90％以上的萌發(fā)率，滿(mǎn)足了使用同一批菌株在不同時(shí)間制備分生孢子懸浮液進(jìn)行大量藥劑篩選的需求，提高了藥劑篩選的效率和準(zhǔn)確性。3、本發(fā)明在分生孢子懸浮液中加入甘薯葉片組織液，能夠顯著提高甘薯黑斑病菌孢子萌發(fā)率，實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)甘薯葉片組織液的加入量達(dá)到每1ml分生孢子懸浮液加入15-30μl甘薯葉片組織液時(shí)，分生孢子懸浮液中分生孢子的萌發(fā)率穩(wěn)定在90％以上。4、本發(fā)明通過(guò)限定甘薯黑斑病菌的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，分生孢子萌發(fā)的培養(yǎng)條件，進(jìn)一步保證了甘薯黑斑病菌的生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的穩(wěn)定性。5、本發(fā)明明確了甘薯葉片組織液的保存條件和持效性，使整個(gè)操作進(jìn)一步簡(jiǎn)化高效。6、本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，為篩選防治甘薯黑斑病的殺菌劑提供了必要條件，為評(píng)估藥劑的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)以及其他需要借助分生孢子萌發(fā)來(lái)完成的試驗(yàn)順利進(jìn)行提供了保證。附圖說(shuō)明圖1為未加入甘薯葉片組織培養(yǎng)液的分生孢子懸浮液培養(yǎng)3h后的分生孢子萌發(fā)情況圖。圖2為加入甘薯葉片組織培養(yǎng)液(20μl/ml)的分生孢子懸浮液培養(yǎng)3h后的分生孢子萌發(fā)情況圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明實(shí)施例中所用到的甘薯新鮮葉片均采自甘薯品種商薯19。實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)材料的制備甘薯黑斑病菌株：甘薯長(zhǎng)喙殼(Ceratocystisfimbriata)CFSC-01，分離自四川帶病薯塊，純化、鑒定后保存；保藏編號(hào)：CGMCCNo.3.18030，保藏日期：2016年9月26日；保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。P+S培養(yǎng)基：將馬鈴薯、甘薯去皮切塊，稱(chēng)取馬鈴薯塊20g、甘薯塊100g混合，加水煮爛(此次的加水量不超過(guò)1L)，過(guò)濾，濾液中加入葡萄糖0.02g，瓊脂粉13g，再加水定容至1L。甘薯葉片組織液：將1g甘薯葉片組織加2ml水研磨離心后，取上清液，加水定容至2ml，得到甘薯葉片組織液，-20℃避光保存；使用時(shí)，室溫溶解，使用后重新置于-20℃避光保存。以下實(shí)施例中組織液為甘薯葉片組織液的簡(jiǎn)稱(chēng)。實(shí)施例2分生孢子在組織液刺激下萌發(fā)率和芽管長(zhǎng)度與時(shí)間的關(guān)系挑取甘薯黑斑病菌菌株，接種在P+S培養(yǎng)基的中心部位，25℃、黑暗條件下培養(yǎng)，然后分別選取培養(yǎng)10d和16d的甘薯黑斑病菌菌株，用無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)基表面的菌體，得到含有分生孢子的沖洗液，再用無(wú)菌水調(diào)整沖洗液中分生孢子濃度，顯微鏡鏡檢，最終配制成分生孢子濃度為1×106個(gè)/ml的分生孢子懸浮液。在兩種分生孢子懸浮液中分別加入甘薯葉片組織液，組織液的加入量均為每1ml分生孢子懸浮液加入20μl組織液。將加入組織液的分生孢子懸浮液在25℃、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)1h、2h、2.5h、3h、4h，對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的分生孢子懸浮液中分生孢子萌發(fā)的情況進(jìn)行鏡檢，結(jié)果見(jiàn)表1。表1分生孢子在組織液刺激下萌發(fā)率和芽管長(zhǎng)度與時(shí)間的關(guān)系根據(jù)表1的試驗(yàn)結(jié)果，25℃黑暗培養(yǎng)1h后，兩種分生孢子懸浮液的分生孢子萌發(fā)率分別為：25.69％和13.71％，芽管長(zhǎng)度可達(dá)到3/4個(gè)孢子長(zhǎng)度。培養(yǎng)2h后，兩種懸浮液的分生孢子萌發(fā)率分別為：97.00％和97.06％，芽管長(zhǎng)度可達(dá)到1.5個(gè)孢子長(zhǎng)度。培養(yǎng)2h后的分生孢子萌發(fā)率基本不再增加，但芽管長(zhǎng)度進(jìn)一步伸長(zhǎng)，2.5h后可達(dá)到2個(gè)孢子長(zhǎng)度；3h后可達(dá)到3-4個(gè)孢子長(zhǎng)度；4h后可達(dá)到5個(gè)孢子長(zhǎng)度以上?？紤]到實(shí)際應(yīng)用時(shí)，如果芽管長(zhǎng)度太長(zhǎng)，會(huì)相互交叉，不利于觀察計(jì)數(shù)，所以觀察孢子萌發(fā)情況的最佳時(shí)間應(yīng)該在25℃、黑暗培養(yǎng)2.5-3小時(shí)。實(shí)施例3甘薯葉片組織液濃度與分生孢子萌發(fā)率的關(guān)系挑取甘薯黑斑病菌菌株，接種在P+S培養(yǎng)基的中心部位，25℃、黑暗條件下培養(yǎng)8d，然后用無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)基表面的菌體，得到含有分生孢子的沖洗液，再用無(wú)菌水調(diào)整沖洗液中分生孢子濃度，顯微鏡鏡檢，最終配制成分生孢子濃度為1×106個(gè)/ml的分生孢子懸浮液。在分生孢子懸浮液中分別加入不同量的組織液，組織液的加入量為每1ml分生孢子懸浮液分別加入0、1、3、6、12、15、20、30μl組織液。將加入不同量組織液的分生孢子懸浮液在25℃、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)3h，對(duì)加入不同量組織液的分生孢子懸浮液中分生孢子萌發(fā)的情況進(jìn)行鏡檢(見(jiàn)圖1、2)。各重復(fù)調(diào)查分生孢子總數(shù)不少于200個(gè)，孢子芽管長(zhǎng)度大于孢子的短半徑視為萌發(fā)，分別記錄萌發(fā)數(shù)和分生孢子總數(shù)。同時(shí)，采用方差分析方法(新復(fù)極差法)對(duì)分生孢子萌發(fā)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2。表2分生分生孢子懸浮液中甘薯組織液的不同濃度與孢子萌發(fā)結(jié)果加入量(μl/ml)013612152030萌發(fā)率(％)0.3831.8846.0570.6783.7093.7294.4393.90方差分析結(jié)果fedcbaaa注：相同字母表示無(wú)差異，不相同字母表示差異顯著。根據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)組織液的加入量達(dá)到每1ml分生孢子懸浮液加入15-30μl組織液時(shí)，分生孢子萌發(fā)率超過(guò)90％，組織液加入量分別為15、20、30μl/ml時(shí)，萌發(fā)率分別為：93.72％、94.43％、93.90％，三個(gè)處理的萌發(fā)率無(wú)顯著差異。實(shí)施例4保持分生孢子萌發(fā)活力的條件篩選挑取甘薯黑斑病菌菌株，接種在P+S培養(yǎng)基的中心部位，25℃、黑暗條件下培養(yǎng)8d，然后將同一批次接種的菌株分開(kāi)放置，一部分繼續(xù)在25℃、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)，另一部分轉(zhuǎn)移至4℃、黑暗條件下培養(yǎng)。分別取在25℃和4℃黑暗條件下放置不同時(shí)間的菌株制備分生孢子懸浮液，即用無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)基表面的菌體，得到含有分生孢子的沖洗液，再用無(wú)菌水調(diào)整沖洗液中分生孢子濃度，顯微鏡鏡檢，最終配制成分生孢子濃度為1×106個(gè)/ml的分生孢子懸浮液。在分生孢子懸浮液中加入組織液，組織液的加入量為每1ml分生孢子懸浮液加入20μl組織液(另設(shè)不加入組織液的對(duì)照)，再在25℃、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)3h，對(duì)分生孢子懸浮液中孢子萌發(fā)的情況進(jìn)行鏡檢。各重復(fù)調(diào)查分生孢子總數(shù)不少于200個(gè)，孢子芽管長(zhǎng)度大于孢子的短半徑視為萌發(fā)，分別記錄萌發(fā)數(shù)和分生孢子總數(shù)，對(duì)分生孢子萌發(fā)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。表3不同培養(yǎng)條件下分生孢子的萌發(fā)率調(diào)查根據(jù)表3的試驗(yàn)結(jié)果，始終在25℃黑暗條件下培養(yǎng)的菌株，其分生孢子萌發(fā)活性保持時(shí)間較長(zhǎng)，從第8天開(kāi)始鏡檢，90％以上的萌發(fā)率可以保持兩周。在4℃黑暗條件下培養(yǎng)的菌株分生孢子萌發(fā)活性顯著降低，所有批次的分生孢子萌發(fā)率均低于90％。因此，為保證分生孢子具備穩(wěn)定的萌發(fā)活力，制備分生孢子懸浮液的菌株應(yīng)始終在25℃黑暗條件下培養(yǎng)，整個(gè)取樣期間從接種后的第8天起，不應(yīng)超過(guò)兩周。實(shí)施例5甘薯葉片組織液的持效性檢測(cè)(與實(shí)施例4同時(shí)進(jìn)行)在實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)發(fā)現(xiàn)始終在25℃、黑暗條件下培養(yǎng)的菌株，其分生孢子的萌發(fā)率在甘薯組織液的刺激下首次低于90％時(shí)(第14d)，開(kāi)展葉片組織液的持效性檢測(cè)(從第15d開(kāi)始)。在第15d當(dāng)天制備新的葉片組織液，使用兩種制備時(shí)間不同的組織液同時(shí)進(jìn)行實(shí)施例4的后續(xù)試驗(yàn)(實(shí)施例4試驗(yàn)開(kāi)始當(dāng)天制備的組織液稱(chēng)為初次制備組織液，實(shí)施例4試驗(yàn)進(jìn)行至15d時(shí)制備的組織液稱(chēng)為再次制備組織液)。比較兩種制備時(shí)間不同的組織液對(duì)分生孢子萌發(fā)率的影響，并采取t檢驗(yàn)對(duì)兩組數(shù)據(jù)的差異顯著性進(jìn)行分析。各重復(fù)調(diào)查分生孢子總數(shù)不少于200個(gè)，孢子芽管長(zhǎng)度大于孢子的短半徑視為萌發(fā)，分別記錄萌發(fā)數(shù)和分生孢子總數(shù)，對(duì)分生孢子萌發(fā)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表4。表4甘薯葉片組織液的持效性檢測(cè)結(jié)果根據(jù)表4的試驗(yàn)結(jié)果，使用兩種不同時(shí)間制備的組織液，分別處理25℃、黑暗條件下培養(yǎng)的菌株制備的分生孢子懸浮液，兩組分生孢子萌發(fā)率數(shù)據(jù)的t檢驗(yàn)P值為0.2283-0.8231，均大于0.05，故兩組數(shù)據(jù)間差異不顯著。4℃、黑暗條件下保存的菌株制備的分生孢子懸浮液，兩組分生孢子萌發(fā)率數(shù)據(jù)的t檢驗(yàn)P值為0.0535-0.1452，均大于0.05，故兩組數(shù)據(jù)間差異不顯著。由上述結(jié)果可知，相同培養(yǎng)溫度下，兩種相同量組織液刺激下的分生孢子萌發(fā)率隨時(shí)間變化的趨勢(shì)一致，同一天的萌發(fā)率數(shù)據(jù)差異不顯著，表明萌發(fā)率的變化只與菌株培養(yǎng)的時(shí)間有關(guān)，與組織液制備的時(shí)間無(wú)關(guān)。在其它條件不變的情況下，分生孢子萌發(fā)率并沒(méi)有因?yàn)楦适砣~片組織液的制備日期不同而出現(xiàn)顯著差異，表明甘薯葉片組織液儲(chǔ)存在-20℃的條件下，具備一定的持效期，持效期至少為3周。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3