本發(fā)明涉及一種非核糖體多肽活性產(chǎn)物的獲得方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

非核糖體多肽是通過非核糖體途徑合成的一系列低分子量、具有多種藥用價(jià)值的多肽類次生代謝產(chǎn)物，在化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性上都具有豐富多樣性。自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一千多種非核糖體多肽化合物，包含多種抗生素、毒素、免疫抑制劑、生物表面活性劑、激素和抗腫瘤物質(zhì)等。自然界中真菌能夠合成許多種真菌毒素，像是白僵菌素、類白僵菌素、恩鐮孢菌素等，這些天然物質(zhì)大都具有廣泛的生物學(xué)活性，如抗菌、殺蟲、除草、抗逆轉(zhuǎn)錄以及化學(xué)增敏等活性，還有一些被證明能夠抑制阿茲海默癥中老年斑的形成以及抑制新生腫瘤形成等。這些真菌毒素就是非核糖體多肽中重要的一大類。但是從自然界中獲得可合成以上物質(zhì)的野生菌非常困難且產(chǎn)量少。所以目前獲取工藝幾乎為通過化工獲取，化工方式的缺陷為產(chǎn)量低，工藝復(fù)雜，生物方式合成產(chǎn)量高，且可控，但菌株獲得困難。

以生物的方式指導(dǎo)合成非核糖體多肽需要經(jīng)由一類稱為非核糖體多肽合成酶來完成，它是一類大的多酶復(fù)合物，由一系列被稱為模塊的重復(fù)催化單位和結(jié)構(gòu)單位所組成，具有廣泛的催化底物特異性，適合于新型化合物分子的工程化生物合成。充分了解這些酶的催化機(jī) 制有利于通過人工途徑獲得非核糖體多肽，也是合成新型化合物的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種非核糖體多肽活性產(chǎn)物的獲得方法，通過合理設(shè)計(jì)并重新構(gòu)建基因工程菌，更有效地生產(chǎn)非核糖體多肽。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種非核糖體多肽活性產(chǎn)物的獲得方法，其包括：

以純化的Beauveria bassiana ATCC 7159菌株DNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分別擴(kuò)增出具有AscI位點(diǎn)的目標(biāo)基因片段G1和具有BsrGI位點(diǎn)的目標(biāo)基因片段G2，然后將G1連接到載體的NheI和PmlI位點(diǎn)之間，構(gòu)建質(zhì)粒P1，G2連接到另一個載體的NdeI和PmlI位點(diǎn)之間，構(gòu)建質(zhì)粒P2的步驟；和，

以P1和P2為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，擴(kuò)增出目標(biāo)基因片段G3的步驟；和，

將G3連接到P1的AscI和PmlI位點(diǎn)之間或P2的BsrGI和PmlI位點(diǎn)之間，獲得重組質(zhì)粒P3的步驟；和，

將P1、P2或P3與包含NpgA基因片段的質(zhì)粒P4共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 208288，得到基因工程菌的步驟；和

將基因工程菌進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，提取，得到非核糖體多肽活性產(chǎn)物的步驟。

作為優(yōu)選，1)構(gòu)建重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pE SC-URA：

①以純化的Beauveria bassiana ATCC 7159菌株DNA為模板，使用引物組合：

上游引物bbBeas-F:5’-aaGCTAGCatggagccgctcaaaaatgt-3’，

下游引物bbBeas-R:5’-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3’，

通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目標(biāo)基因片段C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)，擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95℃40秒，63℃40秒，72℃15.5分鐘，36個循環(huán)；

②利用限制性核酸內(nèi)切酶NheI和PmlI將步驟①擴(kuò)增得到的目標(biāo)基因片段連接到pESC-URA載體上的NheI和PmlI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA；

2)構(gòu)建重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA：

Ⅰ)以純化的Beauveria bassiana ATCC 7159菌株DNA為模板，使用引物組合：

上游引物bbBsls-F:5′-aaCATATGgagccacccaacaacgc-3′，

下游引物bbBsls-R:5′-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3′，

通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目標(biāo)基因片段C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)，擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95℃40秒，63℃40秒，72℃15.5分鐘，36個循環(huán)；

Ⅱ)利用限制性核酸內(nèi)切酶NdeI和PmlI將上述擴(kuò)增得到的基因片段連接到pESC-URA載體上的NdeI和PmlI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA；

3)通過以下A、B、C、D、E或F步驟構(gòu)建重組質(zhì)粒；

A

A1.以步驟1)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)inpESC-URA和步驟2)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)inpESC-URA為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，第一輪擴(kuò)增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

上游片段下游引物BbBEAS with T_2aT_2bC_3(BbBSLS)-R:5'-ggtgccgacttttgcaccatcgtcgtcgtccggg-3'，

下游片段上游引物BbBEAS with T_2aT_2bC_3(BbBSLS)-F:5'-cccggacgacgacgatggtgcaaaagtcggcacc-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

再以擴(kuò)增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴(kuò)增模板，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

得到目標(biāo)基因片段(AscI)bbBeas with T_2aT_2bC_3(bbBsls)；

A2.利用限制性核酸內(nèi)切酶AscI和PmlI將步驟A1中得到的目標(biāo)基因片段連接到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA的AscI和PmlI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MT_(bbBeas)T_2aT _2bC_3(bbBsls)in pESC-URA；

B

B1.以步驟1)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)inpESC-URA和步驟2)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，第一輪擴(kuò)增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

上游片段下游引物BbBEAS with T_2bC_3(BbBSLS)-R:5'-tctttcttgtcctggcctccaccaccattcaaag-3'，

下游片段上游引物BbBEAS with T_2bC_3(BbBSLS)-F:5'-ctttgaatggtggtggaggccaggacaagaaaga-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

再以擴(kuò)增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴(kuò)增模板，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

得到目標(biāo)基因片段(AscI)bbBeas with T_2bC_3(bbBsls)；

B2.利用限制性核酸內(nèi)切酶AscI和PmlI將步驟B1中得到的目標(biāo)基因片段連接到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA的AscI和PmlI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2a(bbBeas)T_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA；

C

C1.以步驟1)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)inpESC-URA和步驟2)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)inpESC-URA為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，第一輪擴(kuò)增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

上游片段下游引物BbBEAS with C_3(BbBSLS)-R:5'-gcatcggcggcgggaatgagttgaaacgcagtgt-3'，

下游片段上游引物BbBEAS with C_3(BbBSLS)-F:5'-acactgcgtttcaactcattcccgccgccgatgc-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

再以擴(kuò)增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴(kuò)增模板，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

得到目標(biāo)基因片段(AscI)bbBeas with C_3(bbBsls)；

C2.利用限制性核酸內(nèi)切酶AscI和PmlI將步驟C1中得到的目標(biāo)基因片段連接到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA的AscI和PmlI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2b(bbBeas)-C_3(bbBsls)in pESC-URA；

D

D1.以步驟1)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA和步驟2)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，第一輪擴(kuò)增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

上游片段下游引物BbBSLS with T_2aT_2bC_3(BbBEAS)-R:5'-ggcttctttttcttcgtctttttgatagctttgg-3'，

下游片段上游引物BbBSLS with T_2aT_2bC_3(BbBEAS)-F:5'-ccaaagctatcaaaaagacgaagaa aaagaagcc-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

再以擴(kuò)增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴(kuò)增模板，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

得到目標(biāo)基因片段(BsrGI)bbBsls with T_2aT_2bC_3(bbBeas)；

D2.利用限制性核酸內(nèi)切酶BsrGI和PmlI將步驟D1中得到的目標(biāo)基因片段連接到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-UR A的BsrGI和PmlI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MT_(bbBsls)T_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA；

E

E1.以步驟1)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA和步驟2)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，第一輪擴(kuò)增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

上游片段下游引物BbBSLS with T_2bC_3(BbBEAS)-R:5'-gacccttgcttcgcttgaccaccaccggccgaag-3'，

下游片段上游引物BbBSLS with T_2bC_3(BbBEAS)-F:5'-cttcggccggtggtggtcaagcgaagcaagggtc-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

再以擴(kuò)增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴(kuò)增模板，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

得到目標(biāo)基因片段(BsrGI)bbBsls with T_2bC_3(bbBeas)；

E2.利用限制性核酸內(nèi)切酶BsrGI和PmlI將步驟E1中得到的目標(biāo)基因片段連接到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-UR A的BsrGI和PmlI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2a(bbBsls)T_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA；

F

F1.以步驟1)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in p ESC-URA和步驟2)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，第一輪擴(kuò)增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

上游片段下游引物BbBSLS with C_3(BbBEAS)-R:5'-aaatcttcaacagacaagagctggaaggcagtgt-3'，

下游片段上游引物BbBSLS with C_3(BbBEAS)-F:5'-acactgccttccagctcttgtctgttgaagattt-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

再以擴(kuò)增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴(kuò)增模板，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

得到目標(biāo)基因片段(BsrGI)bbBsls with T_2bC_3(bbBeas)；

F2.利用限制性核酸內(nèi)切酶BsrGI和PmlI將步驟F1中得到的目標(biāo)基因片段連接到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-UR A的BsrGI和PmlI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2b(bbBsls)-C_3(bbBeas)in pESC-URA；

4)構(gòu)建重組質(zhì)粒NpgA in pESC-TRP：

α)以純化的Emericella nidulans ATCC 38163菌株DNA為模板，使用引物組合：

上游引物NpgA-NdeI-5:5'-aaCATATGgtgcaagacacatcaag-3’，

下游引物NpgA-PmeI-3:5'-aaGTTTAAACttaggataggcaatt-3’，

通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目標(biāo)基因片段NpgA，擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95℃40秒，63℃40秒，72℃1.1分鐘，30個循環(huán)；

β)利用限制性核酸內(nèi)切酶NdeI和PmeI將步驟α)擴(kuò)增得到的目標(biāo)基因片段連接到pESC-TRP載體上的NdeI和PmeI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒NpgA in pESC-TRP；

5)構(gòu)建工程菌株：

將步驟1)得到的重組質(zhì)粒、步驟2)得到的重組質(zhì)粒或步驟3)通過A、B、C、D、E或F得到的重組質(zhì)粒與步驟4)得到的重組質(zhì)粒NpgA in pESC-TRP共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株；

6)提取非核糖體多肽活性產(chǎn)物：

將步驟5)中獲得的工程菌株培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液并通過色譜分析柱進(jìn)行洗脫，得到非核糖體多肽活性產(chǎn)物。

再優(yōu)選地，3)的A、B、C、D、E和F步驟中，重疊延伸PCR技術(shù)的擴(kuò)增反應(yīng)的條件均為：第一輪：95℃40秒，63℃40秒，72℃2分鐘，30個循環(huán)；第二輪：95℃40秒，58℃40秒，72℃3分鐘，40個循環(huán)。

再優(yōu)選地，步驟5)中，通過聚乙二醇-醋酸鋰介導(dǎo)的方法將步驟3)通過A、B、C、D、E或F得到的重組質(zhì)粒與重組質(zhì)粒NpgA in pESC-TRP共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 208288中。

再優(yōu)選地，步驟6)中，將步驟5)中獲得的工程菌株培養(yǎng)在含有1％葡萄糖的YPD培養(yǎng)基中，在溫度30℃，轉(zhuǎn)速250rpm的條件下震蕩培養(yǎng)3天，得到培養(yǎng)液；

將培養(yǎng)液用等體積的乙酸乙酯提取，得到提取液；

將提取液進(jìn)行減壓蒸干后，放入MCI色譜分析柱中，進(jìn)行梯度洗脫，收集含有非核糖體多肽活性產(chǎn)物的組分用乙腈水溶液進(jìn)行洗脫純化，得到非核糖體多肽活性產(chǎn)物。

再優(yōu)選地，將提取液進(jìn)行減壓蒸干后，放入MCI色譜分析柱中，依次用體積比為0:100、20:80、50:50和100:0的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明通過合理設(shè)計(jì)并重新構(gòu)建基因工程菌，更有效地生產(chǎn)非核糖體多肽；

2、本發(fā)明方法具有產(chǎn)物可控的特點(diǎn)，穩(wěn)定生產(chǎn)非核糖體多肽、產(chǎn)物產(chǎn)率高、不受原料限制、操作過程易控制、生產(chǎn)成本低。

附圖說明

圖1為實(shí)施例18的質(zhì)譜圖；

圖2為實(shí)施例19的質(zhì)譜圖；

圖3為實(shí)施例20的質(zhì)譜圖；

圖4為實(shí)施例23的質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

下面，結(jié)合附圖以及具體實(shí)施方式，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：

實(shí)施例1

實(shí)施例1用于說明質(zhì)粒P1的構(gòu)建過程。

構(gòu)建重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)：

①以純化的Beauveria bassiana ATCC 7159菌株DNA為模板，使用引物組合：

上游引物bbBeas-F:5’-aaGCTAGCatggagccgctcaaaaatgt-3’，

下游引物bbBeas-R:5’-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3’，

通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目標(biāo)基因片段C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)(G2)，擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95℃40秒，63℃40秒，72℃15.5分鐘，36個循環(huán)；

②利用限制性核酸內(nèi)切酶NheI和PmlI將步驟①擴(kuò)增得到的目標(biāo)基因片段連接到pESC-URA載體上的NheI和PmlI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)。

其中，目標(biāo)基因片段C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)已編入國際基因 庫，登錄號為EU886196。

實(shí)施例2

實(shí)施例2用于說明質(zhì)粒P2的構(gòu)建過程。

構(gòu)建重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P2)：

Ⅰ)以純化的Beauveria bassiana ATCC 7159菌株DNA為模板，使用引物組合：

上游引物bbBsls-F:5′-aaCATATGgagccacccaacaacgc-3′，

下游引物bbBsls-R:5′-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3′，

通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目標(biāo)基因片段C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)(G2)，擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95℃40秒，63℃40秒，72℃15.5分鐘，36個循環(huán)；

Ⅱ)利用限制性核酸內(nèi)切酶NdeI和PmlI將上述擴(kuò)增得到的基因片段連接到pESC-URA載體上的NdeI和PmlI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P2)。

其中，目標(biāo)基因片段C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)已編入國際基因庫，登錄號為FJ439897。

實(shí)施例1～2中：Beauveria bassiana菌株購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)，編號為ATCC 7159；pESC-URA載體(pESC-URAVector)購自安捷倫科技公司(Agilent Technologies)，貨號為217454；DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶NheI、NdeI和PmlI購自寶生物工程(大連)有限公司；引物組合經(jīng)設(shè)計(jì)后由生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)。

實(shí)施例3～8

實(shí)施例3～8用于說明以P1和P2為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，擴(kuò)增出目標(biāo)基因片段G3的步驟；和，將G3連接到P1的AscI和PmlI位點(diǎn)之間，獲得重組質(zhì)粒P3的步驟。

實(shí)施例3

A1.以實(shí)施例1得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)inpESC-URA(P1)和實(shí)施例2得到的重組質(zhì)粒

C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P2)為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，第一輪擴(kuò)增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，上游片段下游引物BbBEAS with T_2aT_2bC_3(BbBSLS)-R:

5'-ggtgccgacttttgcaccatcgtcgtcgtccggg-3'，

下游片段上游引物BbBEAS with T_2aT_2bC_3(BbBSLS)-F:

5'-cccggacgacgacgatggtgcaaaagtcggcacc-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

再以擴(kuò)增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴(kuò)增模板，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：第一輪：95℃40秒，63℃40秒，72℃2分鐘，30個循環(huán)；第二輪：95℃40秒，58℃40秒，72℃3分鐘，40個循環(huán)；得到目標(biāo)基因片段(AscI)bbBeas with T_2bC_3(bbBsls)(G3)。

A2.利用限制性核酸內(nèi)切酶AscI和PmlI將步驟A1中得到的目標(biāo)基因片段連接到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)的AscI和PmlI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MT_(bbBeas)T_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P3)。

實(shí)施例4

B1.以實(shí)施例1得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)和實(shí)施例2得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P2)為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，第一輪擴(kuò)增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

上游片段下游引物BbBEAS with T_2bC_3(BbBSLS)-R:

5'-tctttcttgtcctggcctccaccaccattcaaag-3'，

下游片段上游引物BbBEAS with T_2bC_3(BbBSLS)-F:

5'-ctttgaatggtggtggaggccaggacaagaaaga-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

再以擴(kuò)增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴(kuò)增模板，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：第一輪：95℃40秒，63℃40秒，72℃2分鐘，30個循環(huán)；第二輪：95℃40秒，58℃40秒，72℃3分鐘，40個循環(huán)；得到目標(biāo)基因片段(AscI)bbBeas with T_2aT_2bC_3(bbBsls)(G3)。

B2.利用限制性核酸內(nèi)切酶AscI和PmlI將步驟B1中得到的目標(biāo)基因片段連接到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)的AscI和PmlI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2a(bbBeas)T_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P3)。

實(shí)施例5

C1.以實(shí)施例1得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)和實(shí)施例2得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P2)為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，第一輪擴(kuò)增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

上游片段下游引物BbBEAS with C_3(BbBSLS)-R:

5'-gcatcggcggcgggaatgagttgaaacgcagtgt-3'，

下游片段上游引物BbBEAS with C_3(BbBSLS)-F:

5'-acactgcgtttcaactcattcccgccgccgatgc-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

再以擴(kuò)增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴(kuò)增模板，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：第一輪：95℃40秒，63℃40秒，72℃2分鐘，30個循環(huán)；第二輪：95℃40秒，58℃40秒，72℃3分鐘，40個循環(huán)；得到目標(biāo)基因片段(AscI)bbBeas with C_3(bbBsls)(G3)。

C2.利用限制性核酸內(nèi)切酶AscI和PmlI將步驟C1中得到的目標(biāo)基因片段連接到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)的AscI和PmlI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2b(bbBeas)-C_3(bbBsls)in pESC-URA(P3)。

實(shí)施例6

D1.以實(shí)施例1得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)和實(shí)施例2得到的重組質(zhì)粒

C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P2)為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，第一輪擴(kuò)增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

上游片段下游引物BbBSLS with T_2aT_2bC_3(BbBEAS)-R:

5'-ggcttctttttcttcgtctttttgatagctttgg-3'，

下游片段上游引物BbBSLS with T_2aT_2bC_3(BbBEAS)-F:

5'-ccaaagctatcaaaaagacgaagaaaaagaagcc-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

再以擴(kuò)增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴(kuò)增模板，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：第一輪：95℃40秒，63℃40秒，72℃2分鐘，30個循環(huán)；第二輪：95℃40秒，58℃40秒，72℃3分鐘，40個循環(huán)；得到目標(biāo)基因片段(BsrGI)bbBsls with T_2aT_2bC_3(bbBeas)(G3)。

D2.利用限制性核酸內(nèi)切酶BsrGI和PmlI將步驟D1中得到的目標(biāo)基因片段連接到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA的BsrGI和PmlI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MT_(bbBsls)T_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P3)。

實(shí)施例7

E1.以實(shí)施例1得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)和實(shí)施例2得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P2)為模板，通過重疊延 伸PCR技術(shù)，進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，第一輪擴(kuò)增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

上游片段下游引物BbBSLS with T_2bC_3(BbBEAS)-R:

5'-gacccttgcttcgcttgaccaccaccggccgaag-3'，

下游片段上游引物BbBSLS with T_2bC_3(BbBEAS)-F:

5'-cttcggccggtggtggtcaagcgaagcaagggtc-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

再以擴(kuò)增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴(kuò)增模板，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：第一輪：95℃40秒，63℃40秒，72℃2分鐘，30個循環(huán)；第二輪：95℃40秒，58℃40秒，72℃3分鐘，40個循環(huán)；得到目標(biāo)基因片段(BsrGI)bbBsls with T_2bC_3(bbBeas)(G3)。

E2.利用限制性核酸內(nèi)切酶BsrGI和PmlI將步驟E1中得到的目標(biāo)基因片段連接到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA的BsrGI和PmlI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2a(bbBsls)T_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P3)。

實(shí)施例8

F1.以實(shí)施例1得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA(P1)和實(shí)施例2得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA(P2)為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，第一輪擴(kuò)增使用的引物為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

上游片段下游引物BbBSLS with C_3(BbBEAS)-R:

5'-aaatcttcaacagacaagagctggaaggcagtgt-3'，

下游片段上游引物BbBSLS with C_3(BbBEAS)-F:5'-acactgccttccagctcttgtctgttgaagattt-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

再以擴(kuò)增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴(kuò)增模板，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，使用引物組合為：

上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:

5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：第一輪：95℃40秒，63℃40秒，72℃2分鐘，30個循環(huán)；第二輪：95℃40秒，58℃40秒，72℃3分鐘，40個循環(huán)；得到目標(biāo)基因片段(BsrGI)bbBsls with C_3(bbBeas)(G3)。

F2.利用限制性核酸內(nèi)切酶BsrGI和PmlI將步驟F1中得到的目標(biāo)基因片段連接到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA的BsrGI和PmlI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2b(bbBsls)-C_3(bbBeas)in pESC-URA(P3)。

實(shí)施例3～8中：所使用的限制性核酸內(nèi)切酶AscI、BsrGI和PmlI均購自寶生物工程(大連)有限公司；引物組合經(jīng)設(shè)計(jì)后由生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)。

實(shí)施例9

實(shí)施例9用于說明質(zhì)粒P4的構(gòu)建過程。

構(gòu)建重組質(zhì)粒NpgA in pESC-TRP(P4)：

α)以純化的Emericella nidulans ATCC 38163菌株DNA為模板，使用引物組合：

上游引物NpgA-NdeI-5:5'-aaCATATGgtgcaagacacatcaag-3’，

下游引物NpgA-PmeI-3:5'-aaGTTTAAACttaggataggcaatt-3’，

通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目標(biāo)基因片段NpgA，擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95℃40秒，63℃40秒，72℃1.1分鐘，30個循環(huán)；

β)利用限制性核酸內(nèi)切酶NdeI和PmeI將步驟α)擴(kuò)增得到的目標(biāo)基因片段連接到pESC-TRP載體上的NdeI和PmeI位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒NpgA in pESC-TRP(P4)。

實(shí)施例9中：目標(biāo)基因片段NpgA已編入國際基因庫，登錄號為AAF12814；Emericella nidulans菌株購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)，編號為ATCC 38163；pESC-TRP載體(pESC-TRP Vector)購自安捷倫科技公司(Agilent Technologies)，貨號為217453；DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶NdeI和PmeI購自寶生物工程(大連)有限公司；引物組合經(jīng)設(shè)計(jì)后由生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)。

實(shí)施例10～17

實(shí)施例10～17用于說明將P1、P2或P3與包含NpgA基因片段的質(zhì)粒P4共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 208288，得到基因工程菌的步驟。

實(shí)施例10

通過聚乙二醇-醋酸鋰介導(dǎo)的方法將實(shí)施例1得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA與實(shí)施例9得到的重組質(zhì)粒NpgA in pESC-TRP共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株37。

實(shí)施例11

通過聚乙二醇-醋酸鋰介導(dǎo)的方法將實(shí)施例2得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA與實(shí)施例9得到的重組質(zhì)粒NpgA in pESC-TRP共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株42。

實(shí)施例12

通過聚乙二醇-醋酸鋰介導(dǎo)的方法將實(shí)施例3得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MT_(bbBeas)T_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA與實(shí)施例9得到的重組質(zhì)粒NpgA in pESC-TRP共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株201。

實(shí)施例13

通過聚乙二醇-醋酸鋰介導(dǎo)的方法將實(shí)施例4得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2a(bbBeas)T_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA與實(shí)施例9得到的重組質(zhì)粒NpgA in pESC-TRP共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株204。

實(shí)施例14

通過聚乙二醇-醋酸鋰介導(dǎo)的方法將實(shí)施例5得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2b(bbBeas)-C_3(bbBsls)in pESC-URA與實(shí)施例9得到的重組質(zhì)粒NpgA in pESC-TRP共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株203。

實(shí)施例15

通過聚乙二醇-醋酸鋰介導(dǎo)的方法將實(shí)施例6得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MT_(bbBsls)T_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA與實(shí)施例9得到的重 組質(zhì)粒NpgA in pESC-TRP共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株215。

實(shí)施例16

通過聚乙二醇-醋酸鋰介導(dǎo)的方法將實(shí)施例7得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2a(bbBsls)T_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA與實(shí)施例9得到的重組質(zhì)粒NpgA in pESC-TRP共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株205。

實(shí)施例17

通過聚乙二醇-醋酸鋰介導(dǎo)的方法將實(shí)施例8得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2b(bbBsls)-C_3(bbBeas)in pESC-URA與實(shí)施例9得到的重組質(zhì)粒NpgA in pESC-TRP共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株224。

實(shí)施例10～17中，標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 208288菌株購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)，編號為ATCC 208288。

實(shí)施例18～25

實(shí)施例18～25用于說明將基因工程菌進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，提取，得到非核糖體多肽活性產(chǎn)物的步驟，并對非核糖體多肽活性產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

實(shí)施例18

將實(shí)施例10中獲得的工程菌株37培養(yǎng)在2L含有1％葡萄糖的YPD培養(yǎng)基中，在溫度30℃，轉(zhuǎn)速250rpm的條件下震蕩培養(yǎng)3天，得到培養(yǎng)液；

所述YPD液體培養(yǎng)基中各組分用量分別是：10g/L酵母提取物； 20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖；滅菌。

將培養(yǎng)液用等體積的乙酸乙酯提取3次，合并提取液；

將提取液進(jìn)行減壓蒸干后，放入MCI色譜分析柱中，并依次用體積比為0:100、20:80、50:50和100:0的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，其中20:80的洗脫組分中包含目的化合物，收集含有目的化合物的洗脫組分。

對目的化合物的洗脫組分進(jìn)行洗脫純化，目的化合物的洗脫組分在HPLC上用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5μm,250×4.6mm)分離，用流速為1mL/min的添加有0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在30分鐘內(nèi)，乙腈-水的體積比由50:50逐漸提高到100:0；收集在8.3-8.8分鐘流出液，最終從工程菌株37的培養(yǎng)液中分離得到27.8mg/L純的目的化合物。

對目的化合物進(jìn)行檢測：

并用Agilent 6130單四極質(zhì)譜儀在210nm下進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并對該化合物進(jìn)行核磁共振和質(zhì)譜分析，核磁共振數(shù)據(jù)如表1所示：

表1實(shí)施例18的核磁共振數(shù)據(jù)

質(zhì)譜圖如圖1所示，得到目的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

化學(xué)式C₄₅H₅₇N₃O₉，實(shí)施例18中的得到的目的化合物為白僵菌素(Beauvericin)。

實(shí)施例19

將實(shí)施例11中獲得的工程菌株42培養(yǎng)并獲得目的化合物，其中菌株的培養(yǎng)發(fā)酵、目的化合物提取步驟與實(shí)施例18相同。

對目的化合物的洗脫組分進(jìn)行洗脫純化，目的化合物的洗脫組分在HPLC上用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5μm,250×4.6mm)分離，用流速為1mL/min的添加有0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在30分鐘內(nèi)，乙腈-水的體積比由80:20逐漸提高到100:0；收集在15.3-15.8分鐘流出液，最終從工程菌株42的培養(yǎng)液中分離得到10.6mg/L純的目的化合物。

對目的化合物進(jìn)行檢測，檢測步驟與實(shí)施例18相同，得到的核磁共振數(shù)據(jù)如表2所示：

表2實(shí)施例19的核磁共振數(shù)據(jù)

質(zhì)譜圖如圖2所示，得到目的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

化學(xué)式C₄₈H₈₄N₄O₁₂，實(shí)施例19中得到的目的化合物為球孢交酯(Bassianolide)。

實(shí)施例20

將實(shí)施例12中獲得的工程菌株201培養(yǎng)并獲得目的化合物，其中菌株的培養(yǎng)發(fā)酵、目的化合物提取步驟與實(shí)施例18相同。

對目的化合物的洗脫組分進(jìn)行洗脫純化，目的化合物的洗脫組分在HPLC上用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5μm,250×4.6mm)分離，用流速為1mL/min的添加有0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在30分鐘內(nèi)，乙腈-水的體積比由80:20逐漸提高到100:0；收集在13.0-13.5分鐘流出液，最終從工程菌株201的培養(yǎng)液中分離得到3.2mg/L純的目的化合物。

對目的化合物進(jìn)行檢測，檢測步驟與實(shí)施例18相同，得到的核磁共振數(shù)據(jù)如表3所示：

表3實(shí)施例20的核磁共振數(shù)據(jù)

質(zhì)譜圖如圖3所示，得到目的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

化學(xué)式C₆₀H₇₆N₄O₁₂，實(shí)施例20中得到的目的化合物為一種新的環(huán)狀化合物，稱為FX1。

實(shí)施例21

將實(shí)施例13中獲得的工程菌株204培養(yǎng)并獲得目的化合物，其中菌株的培養(yǎng)發(fā)酵、目的化合物提取步驟與實(shí)施例18相同。

對目的化合物的洗脫組分進(jìn)行洗脫純化，目的化合物的洗脫組分在HPLC上用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5μm,250×4.6mm)分 離，用流速為1mL/min的添加有0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在30分鐘內(nèi)，乙腈-水的體積比由80:20逐漸提高到100:0；收集在13.0-13.5分鐘流出液，最終從工程菌株204的培養(yǎng)液中分離得到3.8mg/L純的目的化合物。

對目的化合物進(jìn)行檢測，檢測步驟與實(shí)施例18相同，檢測結(jié)果與實(shí)施例21相同，亦得到目的化合物為新的環(huán)狀化合物，稱為FX1。

實(shí)施例22

將實(shí)施例14中獲得的工程菌株203培養(yǎng)并獲得目的化合物，其中菌株的培養(yǎng)發(fā)酵、目的化合物提取步驟均與實(shí)施例18相同。

對目的化合物的洗脫組分進(jìn)行洗脫純化，目的化合物的洗脫組分在HPLC上用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5μm,250×4.6mm)分離，用流速為1mL/min的添加有0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在30分鐘內(nèi)，乙腈-水的體積比由80:20逐漸提高到100:0；收集在13.0-13.5分鐘流出液，最終從工程菌株203的培養(yǎng)液中分離得到3.5mg/L純的目的化合物。

對目的化合物進(jìn)行檢測，檢測步驟與實(shí)施例18相同，檢測結(jié)果與實(shí)施例21相同，亦得到目的化合物為新的環(huán)狀化合物，稱為FX1。

實(shí)施例23

將實(shí)施例15中獲得的工程菌株215培養(yǎng)并獲得目的化合物，其中菌株的培養(yǎng)發(fā)酵、目的化合物提取步驟均與實(shí)施例18相同。

對目的化合物的洗脫組分進(jìn)行洗脫純化，目的化合物的洗脫組分在HPLC上用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5μm,250×4.6mm)分 離，用流速為1mL/min的添加有0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在30分鐘內(nèi)，乙腈-水的體積比由80:20逐漸提高到100:0；收集在10.0-10.5分鐘流出液，最終從工程菌株215的培養(yǎng)液中分離得到10.9mg/L純的目的化合物。

對目的化合物進(jìn)行檢測，檢測步驟與實(shí)施例18相同，得到的核磁共振數(shù)據(jù)如表4所示：

表4實(shí)施例23的核磁共振數(shù)據(jù)

質(zhì)譜圖如圖4所示，得到目的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

化學(xué)式C₃₆H₆₃N₃O₉，實(shí)施例23中得到的目的化合物為恩鐮孢菌C(Enniatin C)。

實(shí)施例24

將實(shí)施例16中獲得的工程菌株205培養(yǎng)并獲得目的化合物，其中菌株的培養(yǎng)發(fā)酵、目的化合物提取步驟均與實(shí)施例18相同。

對目的化合物的洗脫組分進(jìn)行洗脫純化，目的化合物的洗脫組分 在HPLC上用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5μm,250×4.6mm)分離，用流速為1mL/min的添加有0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在30分鐘內(nèi)，乙腈-水的體積比由80:20逐漸提高到100:0；收集在10.0-10.5分鐘流出液，最終從工程菌株205的培養(yǎng)液中分離得到10.1mg/L純的目的化合物。

對目的化合物進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果與實(shí)施例23相同，亦得到目的化合物恩鐮孢菌C(Enniatin C)。

實(shí)施例25

將實(shí)施例17中獲得的工程菌株224培養(yǎng)并獲得目的化合物，其中菌株的培養(yǎng)發(fā)酵、目的化合物提取、洗脫純化及檢測步驟均與實(shí)施例18相同。

對目的化合物的洗脫組分進(jìn)行洗脫純化，目的化合物的洗脫組分在HPLC上用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5μm,250×4.6mm)分離，用流速為1mL/min的添加有0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在30分鐘內(nèi)，乙腈-水的體積比由80:20逐漸提高到100:0；收集在10.0-10.5分鐘流出液，最終從工程菌株224的培養(yǎng)液中分離得到10.7mg/L純的目的化合物。

對目的化合物進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果與實(shí)施例23相同，亦得到目的化合物恩鐮孢菌C(Enniatin C)。

對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。