技術(shù)特征：

1.一種非核糖體多肽活性產(chǎn)物的獲得方法，其特征在于，其包括：

以純化的Beauveria bassiana ATCC 7159菌株DNA為模板，通過聚合酶鏈式反應(yīng)分別擴增出具有AscI位點的目標(biāo)基因片段G1和具有B srGI位點的目標(biāo)基因片段G2，然后將G1連接到載體的NheI和PmlI位點之間，構(gòu)建質(zhì)粒P1，G2連接到另一個載體的NdeI和PmlI位點之間，構(gòu)建質(zhì)粒P2的步驟；和，

以P1和P2為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，擴增出目標(biāo)基因片段G3的步驟；和，

將G3連接到P1的AscI和PmlI位點之間或P2的BsrGI和PmlI位點之間，獲得重組質(zhì)粒P3的步驟；和，

將P1、P2或P3與包含NpgA基因片段的質(zhì)粒P4共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入標(biāo)準菌株ATCC 208288，得到基因工程菌的步驟；和

將基因工程菌進行培養(yǎng)發(fā)酵，提取，得到非核糖體多肽活性產(chǎn)物的步驟。

2.如權(quán)利要求1所述的非核糖體多肽活性產(chǎn)物的獲得方法，其特征在于包括以下步驟：

1)構(gòu)建重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA：

①以純化的Beauveria bassiana ATCC 7159菌株DNA為模板，使用引物組合：

上游引物bbBeas-F:5’-aaGCTAGCatggagccgctcaaaaatgt-3’，

下游引物bbBeas-R:5’-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3’，

通過聚合酶鏈式反應(yīng)擴增目標(biāo)基因片段C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)，擴增反應(yīng)的條件為：95℃40秒，63℃40秒，72℃15.5分鐘，36個循環(huán)；

②利用限制性核酸內(nèi)切酶NheI和PmlI將步驟①擴增得到的目標(biāo)基因片段連接到pESC-URA載體上的NheI和PmlI位點之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA；

2)構(gòu)建重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA：

Ⅰ)以純化的Beauveria bassiana ATCC 7159菌株DNA為模板，使用引物組合：

上游引物bbBsls-F:5′-aaCATATGgagccacccaacaacgc-3′，

下游引物bbBsls-R:5′-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3′，

通過聚合酶鏈式反應(yīng)擴增目標(biāo)基因片段C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)，擴增反應(yīng)的條件為：95℃40秒，63℃40秒，72℃15.5分鐘，36個循環(huán)；

Ⅱ)利用限制性核酸內(nèi)切酶NdeI和PmlI將上述擴增得到的基因片段連接到pESC-URA載體上的NdeI和PmlI位點之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA；

3)通過以下A、B、C、D、E或F步驟構(gòu)建重組質(zhì)粒；

A

A1.以步驟1)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pE SC-URA和步驟2)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pES C-URA為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，進行兩輪擴增，第一輪擴增使用的引物為：

上游片段上游引物

BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

上游片段下游引物

BbBEAS with T_2aT_2bC_3(BbBSLS)-R:5'-ggtgccgacttttgcaccatcgtcgtcgtccggg-3'，

下游片段上游引物

BbBEAS with T_2aT_2bC_3(BbBSLS)-F:5'-cccggacgacgacgatggtgcaaaagtcggcacc-3'，

下游片段下游引物

BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

再以擴增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴增模板，進行第二輪擴增，使用引物組合為：

上游片段上游引物

BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

下游片段下游引物

BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

得到目標(biāo)基因片段(AscI)bbBeas with T_2aT_2bC_3(bbBsls)；

A2.利用限制性核酸內(nèi)切酶AscI和PmlI將步驟A1中得到的目標(biāo)基因片段連接到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA的AscI和PmlI位點之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MT_(bbBeas)T_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA；

B

B1.以步驟1)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pE SC-URA和步驟2)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pES C-URA為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，進行兩輪擴增，第一輪擴增使用的引物為：

上游片段上游引物

BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

上游片段下游引物

BbBEAS with T_2bC_3(BbBSLS)-R:5'-tctttcttgtcctggcctccaccaccattcaaag-3'，

下游片段上游引物

BbBEAS with T_2bC_3(BbBSLS)-F:5'-ctttgaatggtggtggaggccaggacaagaaaga-3'，

下游片段下游引物

BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

再以擴增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴增模板，進行第二輪擴增，使用引物組合為：

上游片段上游引物

BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

下游片段下游引物

BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

得到目標(biāo)基因片段(AscI)bbBeas with T_2bC_3(bbBsls)；

B2.利用限制性核酸內(nèi)切酶AscI和PmlI將步驟B1中得到的目標(biāo)基因片段連接到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA的AscI和PmlI位點之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2a(bbBeas)T_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA；

C

C1.以步驟1)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pE SC-URA和步驟2)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pES C-URA為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，進行兩輪擴增，第一輪擴增使用的引物為：

上游片段上游引物

BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

上游片段下游引物

BbBEAS with C_3(BbBSLS)-R:5'-gcatcggcggcgggaatgagttgaaacgcagtgt-3'，

下游片段上游引物

BbBEAS with C_3(BbBSLS)-F:5'-acactgcgtttcaactcattcccgccgccgatgc-3'，

下游片段下游引物

BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

再以擴增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴增模板，進行第二輪擴增，使用引物組合為：

上游片段上游引物

BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，

下游片段下游引物

BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；

得到目標(biāo)基因片段(AscI)bbBeas with C_3(bbBsls)；

C2.利用限制性核酸內(nèi)切酶AscI和PmlI將步驟C1中得到的目標(biāo)基因片段連接到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA的AscI和PmlI位點之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2b(bbBeas)-C_3(bbBsls)in pESC-URA；

D

D1.以步驟1)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pE SC-URA和步驟2)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pES C-URA為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，進行兩輪擴增，第一輪擴增使用的引物為：

上游片段上游引物

BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

上游片段下游引物

BbBSLS with T_2aT_2bC_3(BbBEAS)-R:5'-ggcttctttttcttcgtctttttgatagctttgg-3'，

下游片段上游引物

BbBSLS with T_2aT_2bC_3(BbBEAS)-F:5'-ccaaagctatcaaaaagacgaagaaaaagaagcc-3'，

下游片段下游引物

BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

再以擴增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴增模板，進行第二輪擴增，使用引物組合為：

上游片段上游引物

BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

下游片段下游引物

BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

得到目標(biāo)基因片段(BsrGI)bbBsls with T_2aT_2bC_3(bbBeas)；

D2.利用限制性核酸內(nèi)切酶BsrGI和PmlI將步驟D1中得到的目標(biāo)基因片段連接到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA的BsrGI和PmlI位點之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MT_(bbBsls)T_2aT_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA；

E

E1.以步驟1)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pE SC-URA和步驟2)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pES C-URA為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，進行兩輪擴增，第一輪擴增使用的引物為：

上游片段上游引物

BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

上游片段下游引物

BbBSLS with T_2bC_3(BbBEAS)-R:5'-gacccttgcttcgcttgaccaccaccggccgaag-3'，

下游片段上游引物

BbBSLS with T_2bC_3(BbBEAS)-F:5'-cttcggccggtggtggtcaagcgaagcaagggtc-3'，

下游片段下游引物

BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

再以擴增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴增模板，進行第二輪擴增，使用引物組合為：

上游片段上游引物

BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

下游片段下游引物

BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

得到目標(biāo)基因片段(BsrGI)bbBsls with T_2bC_3(bbBeas)；

E2.利用限制性核酸內(nèi)切酶BsrGI和PmlI將步驟E1中得到的目標(biāo)基因片段連接到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA的BsrGI和PmlI位點之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2a(bbBsls)T_2bC_3(bbBeas)in pESC-URA；

F

F1.以步驟1)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBeas)in pES C-URA和步驟2)得到的重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)，進行兩輪擴增，第一輪擴增使用的引物為：

上游片段上游引物

BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

上游片段下游引物

BbBSLS with C_3(BbBEAS)-R:5'-aaatcttcaacagacaagagctggaaggcagtgt-3'，

下游片段上游引物

BbBSLS with C_3(BbBEAS)-F:5'-acactgccttccagctcttgtctgttgaagattt-3'，

下游片段下游引物

BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

再以擴增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作為擴增模板，進行第二輪擴增，使用引物組合為：

上游片段上游引物

BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，

下游片段下游引物

BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；

得到目標(biāo)基因片段(BsrGI)bbBsls with T_2bC_3(bbBeas)；

F2.利用限制性核酸內(nèi)切酶BsrGI和PmlI將步驟F1中得到的目標(biāo)基因片段連接到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2bC_3(bbBsls)in pESC-URA的BsrGI和PmlI位點之間，得到重組質(zhì)粒C₁A₁T₁C₂A₂MTT_2aT_2b(bbBsls)-C_3(bbBeas)in pESC-URA；

4)構(gòu)建重組質(zhì)粒NpgA in pESC-TRP：

α)以純化的Emericella nidulans ATCC 38163菌株DNA為模板，使用引物組合：

上游引物NpgA-NdeI-5:5'-aaCATATGgtgcaagacacatcaag-3’，

下游引物NpgA-PmeI-3:5'-aaGTTTAAACttaggataggcaatt-3’，

通過聚合酶鏈式反應(yīng)擴增目標(biāo)基因片段NpgA，擴增反應(yīng)的條件為：95℃40秒，63℃40秒，72℃1.1分鐘，30個循環(huán)；

β)利用限制性核酸內(nèi)切酶NdeI和PmeI將步驟α)擴增得到的目標(biāo)基因片段連接到pESC-TRP載體上的NdeI和PmeI位點之間，得到重組質(zhì)粒NpgA in pESC-TRP；

5)構(gòu)建工程菌株：

將步驟1)得到的重組質(zhì)粒、步驟2)得到的重組質(zhì)?；虿襟E3)通過A、B、C、D、E或F得到的重組質(zhì)粒與步驟4)得到的重組質(zhì)粒N pgA in pESC-TRP共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入標(biāo)準菌株ATCC 208288中，獲得工程菌株；

6)提取非核糖體多肽活性產(chǎn)物：

將步驟5)中獲得的工程菌株培養(yǎng)進行培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液并通過色譜分析柱進行洗脫，得到非核糖體多肽活性產(chǎn)物。

3.如權(quán)利要求2所述的非核糖體多肽活性產(chǎn)物的獲得方法，其特征在于：3)的A、B、C、D、E和F步驟中，重疊延伸PCR技術(shù)的擴增反應(yīng)的條件均為：第一輪：95℃40秒，63℃40秒，72℃2分鐘，30個循環(huán)；第二輪：95℃40秒，58℃40秒，72℃3分鐘，40個循環(huán)。

4.如權(quán)利要求2所述的非核糖體多肽活性產(chǎn)物的獲得方法，其特征在于：步驟5)中，通過聚乙二醇-醋酸鋰介導(dǎo)的方法將步驟3)通過A、B、C、D、E或F得到的重組質(zhì)粒與重組質(zhì)粒NpgA in pESC-TRP共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入標(biāo)準菌株ATCC 208288中。

5.如權(quán)利要求2所述的非核糖體多肽活性產(chǎn)物的獲得方法，其特征在于：步驟6)中，將步驟5)中獲得的工程菌株培養(yǎng)在含有1％葡萄糖的YPD培養(yǎng)基中，在溫度30℃，轉(zhuǎn)速250rpm的條件下震蕩培養(yǎng)3天，得到培養(yǎng)液；

將培養(yǎng)液用等體積的乙酸乙酯提取，得到提取液；

將提取液進行減壓蒸干后，放入MCI色譜分析柱中，進行梯度洗脫，收集含有非核糖體多肽活性產(chǎn)物的組分用乙腈水溶液進行洗脫純化，得到非核糖體多肽活性產(chǎn)物。

6.如權(quán)利要求5所述的非核糖體多肽活性產(chǎn)物的獲得方法，其特征在于：將提取液進行減壓蒸干后，放入MCI色譜分析柱中，依次用體積比為0:100、20:80、50:50和100:0的甲醇水溶液進行梯度洗脫。