本發(fā)明涉及一種利用賴氨酸芽孢桿菌控制白酒中氨基甲酸乙酯的方法，屬于酒類釀造以及食品安全領域。
背景技術：
氨基甲酸乙酯(EC)具有遺傳毒性和致癌性，為2A類致癌物。EC廣泛存在于多種發(fā)酵食品(面包、酸奶、醬、醋、奶酪)和酒精飲料(如黃酒、啤酒、葡萄酒、清酒等釀造酒；威士忌、白蘭地、巴西甘蔗酒等蒸餾酒)中，為人們的日常飲食帶來了極大的安全隱患。
白酒是我國特有的一種蒸餾酒，并深得消費者喜愛。年產(chǎn)量達到1300萬噸左右。白酒作為我國特色的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，其EC控制的問題還有待于深入開展，也缺乏限量標準。目前，歐美主要國家糧食蒸餾酒威士忌限量標準為150μg/L。研究報道我國不同白酒中均存在EC，且部分白酒EC含量在150μg/L左右。因此，中國白酒EC問題嚴重，亟待控制解決。
發(fā)酵食品中的EC普遍被認為來源于氨甲酰類化合物與乙醇的反應，主要有四種途徑：(1)由尿素途徑生成EC；(2)由氰化物途徑生成EC；(3)瓜氨酸等前體物質醇解生成EC；(4)添加劑途徑生成EC。白酒發(fā)酵過程中尿素是EC產(chǎn)生的主要前體。
已有報道采用能夠同時降解尿素和氨基甲酸乙酯的耐乙醇雙功能酶在黃酒生產(chǎn)中的應用，但是由于黃酒酒度較低，而白酒酒度一般在46％(v/v)以上，即使低度酒酒度也在30％(v/v)以上，任何酶分子屬于蛋白，蛋白在該體系中都會失活，因此該方法無法應用于白酒中。
酵母是尿素產(chǎn)生的關鍵微生物。目前通過低產(chǎn)尿素酵母的選育與應用，降低了白酒生產(chǎn)中EC的產(chǎn)生。但是，白酒發(fā)酵由于為群體發(fā)酵過程，多種酵母均能代謝產(chǎn)生尿素，因此單一改造某一種酵母難以實現(xiàn)對尿素產(chǎn)生的控制，因此直接采用國際現(xiàn)有控制酵母低產(chǎn)的方法仍難以進行有效控制，而采用尿素降解的方式則更有有利。但是由于白酒屬于群體發(fā)酵，且發(fā)酵環(huán)境惡劣，常規(guī)的尿素降解菌由于無法耐受惡劣環(huán)境而發(fā)揮作用；同時，由于白酒屬于嗜好性食品，風味是影響產(chǎn)品品質的關鍵特點。常規(guī)的尿素降解菌可能會對白酒產(chǎn)品的風味品質有所影響，而造成不利因素。
目前有關于采用紡錘形賴氨酸芽孢桿菌降解醬油中EC的應用報道，但是該菌來源于小鼠腸道，僅能耐受15％NaCl的高滲環(huán)境，而無法應用于白酒釀造中的高酸、高醇和高溫的環(huán)境，無法保證在白酒生產(chǎn)中有效降低EC濃度，同時該菌的風味特征也不清晰，無法保證對白酒品質不造成負向影響，并且該菌的安全性無法保證。
技術實現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明從白酒釀造酒醅中篩選到一株能夠耐受白酒釀造惡劣環(huán)境，同時產(chǎn)生有利風味物質的球形賴氨酸芽孢桿菌，該菌能夠有效降解尿素以及EC，將該菌在白酒釀造中應用，可以有效降解白酒酒醅中的尿素和EC的含量，最終降低白酒中的EC的含量。
本發(fā)明的第一個目的是提供一株能夠降解尿素和EC的球形賴氨酸芽孢桿菌，來源于中國白酒高溫大曲，其分類命名為球形賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sphaericus)，已于2016年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.13046。
所述球形賴氨酸芽孢桿菌菌株的特征是：
(1)耐高溫(60℃)，耐酸(pH 3.4)，耐乙醇(10％)，能夠在白酒釀造過程中的脅迫條件(制曲最高溫度達50～60℃；發(fā)酵酒醅pH 3.5～4.0之間；乙醇最高達7％左右)生長，可發(fā)酵麩皮、大麥、小麥、高粱一種或其組合制成的液體和固態(tài)培養(yǎng)基，產(chǎn)生醇類、酸類等風味成分。
(2)應用于中國白酒釀造中，生產(chǎn)白酒品質提高。
(3)應用于中國白酒釀造中，可使白酒發(fā)酵酒醅中尿素含量降低20％-50％，EC含量降低10％-30％，白酒中EC濃度降低20％-50％。
本發(fā)明的第二個目的是提供含有所述CGMCC NO.13046菌株的微生物菌劑。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述微生物菌劑含有CGMCC NO.13046菌體的活細胞、冷凍干燥得到的CGMCC NO.13046干菌體、固定化的CGMCC NO.13046細胞、CGMCC NO.13046的液體菌劑、CGMCC NO.13046的固體菌劑，或者以其他任何形式存在的CGMCC NO.13046菌株。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述微生物菌劑中還含有任何可以應用于食品或者食品制備的任意種屬的菌株，比如地衣芽孢桿菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌等等。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述微生物菌劑中還含有任意能用于食品的載體。
本發(fā)明第三個目的是提供所述菌株在降低酒類產(chǎn)品中EC和/或尿素的應用。
在一種實施方式中，所述應用是將球形賴氨酸芽孢桿菌添加到酒類產(chǎn)品的制備過程中。
在一種實施方式中，所述酒類產(chǎn)品包括釀造酒、蒸餾酒。
在一種實施方式中，所述酒類產(chǎn)品為白酒；所述方法是將CGMCC NO.13046菌株以液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物形式接種于白酒大曲、堆積醅或窖池發(fā)酵酒醅中；菌株以單獨接種或與其他微生物按不同混合比例接種。
在一種實施方式中，固體培養(yǎng)物是固體菌劑。
在一種實施方式中，菌株液體培養(yǎng)物總接種量為0.1％～20％(v/w)，菌株固體培養(yǎng)物總接種量為0.1％～20％(w/w)。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明對白酒酒醅中分離、篩選獲得一株耐高溫(60℃)，耐酸(pH 3.4)，耐乙醇(10％)，能夠在白酒釀造過程中的脅迫條件(制曲最高溫度達50～60℃；發(fā)酵酒醅pH 3.5～4.0之間；乙醇最高達7％左右)下生存并發(fā)揮功能的球形賴氨酸芽孢桿菌CGMCC NO.13046，這株球形賴氨酸芽孢桿菌能夠同時降解尿素和EC，從而降低白酒中EC的含量，同時又能夠促進白酒風味。
本發(fā)明針對中國白酒釀造中存在的主要問題，獲得了同時降解尿素與EC的球形賴氨酸芽孢桿菌，并提供了功能菌株在中國白酒中的應用工藝。不但對于實現(xiàn)白酒行業(yè)技術水平與行業(yè)競爭力的提升具有重要的意義，而且對于白酒品質安全，促進白酒的可持續(xù)性發(fā)展具有明顯的應用價值。
生物材料保藏
球形賴氨酸芽孢桿菌，分類學命名為球形賴氨酸芽孢桿菌Lysinibacillus sphaericus，于2016年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.13046。
具體實施方式
實施例1球形賴氨酸芽孢桿菌降解尿素能力
液體種子培養(yǎng)物的制備：在無菌條件下挑1環(huán)CGMCC NO.13046菌株于裝有100ml液體種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，置搖床上以旋轉轉速為100rpm、37℃培養(yǎng)24h，即制得一級液體種子培養(yǎng)物。
一級液體種子培養(yǎng)物分別以體積百分比為1％的接種量接種到裝有已滅菌的100mL高粱混合浸出液體培養(yǎng)基(額外添加尿素，使其初始尿素濃度為500mg/L)的250mL搖瓶中，37℃靜置培養(yǎng)5d。結果顯示，5d后尿素濃度從初始的500mg/L降為10mg/L，降解率為98％。
其中：
種子液培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏10，葡萄糖10，NaCl 5，pH 7.0，1×105Pa滅菌20min。
高粱混合浸出液體培養(yǎng)基：高粱200g，加水800mL，于100℃蒸煮10min。過濾取上清液，pH6.2。1×105Pa滅菌20min。
實施例2球形賴氨酸芽孢桿菌降解EC能力
液體種子培養(yǎng)物的制備：在無菌條件下挑1環(huán)CGMCC NO.13046菌株于裝有100ml液體種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，置搖床上以旋轉轉速為100rpm、37℃培養(yǎng)24h，即制得一級液體種子培養(yǎng)物。
一級液體種子培養(yǎng)物分別以體積百分比為1％的接種量接種到裝有已滅菌的100mL高粱混合浸出液體培養(yǎng)基(在培養(yǎng)基中額外添加EC，使其初始EC濃度為200ug/L)的250mL搖瓶中，37℃靜置培養(yǎng)6d。結果顯示，發(fā)酵末期EC濃度降為46ug/L，降解率為63％。
其中：
種子液培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏10，葡萄糖10，NaCl 5，pH 7.0，1×105Pa滅菌20min。
高粱混合浸出液體培養(yǎng)基：高粱200g，加水800mL，于100℃蒸煮10min。過濾取上清液，pH6.2。1×105Pa滅菌20min。
實施例3球形賴氨酸芽孢桿菌風味代謝能力
步驟1：液體種子培養(yǎng)物的制備：在無菌條件下挑1環(huán)CGMCC NO.13046菌株于裝有100ml液體種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，置搖床上以旋轉轉速為100rpm、37℃培養(yǎng)24h，即制得一級液體種子培養(yǎng)物。
種子液培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏10，葡萄糖10，NaCl 5，pH 7.0，1×105Pa滅菌20min。
步驟2：一級液體種子培養(yǎng)物分別以體積百分比為1％的接種量接種到裝有已滅菌的100mL大麥和小麥混合浸出液體培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37℃靜置培養(yǎng)6d。
大麥和小麥混合浸出液體培養(yǎng)基：大麥和小麥分別100g，加水800mL，于100℃蒸煮10min。過濾取上清液，pH6.2。1×105Pa滅菌20min。
步驟3：對CGMCC NO.13046菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進行分析：取步驟2得到的發(fā)酵液以8000rpm離心8分鐘。8mL上清液進行HS-SPME和GC-MS分析，產(chǎn)生乙偶姻、2,3-丁二醇、2-甲基丙酸、3-甲基丁酸、己酸、辛酸等。其中酸類物質是白酒中重要的風味成分，可增加白酒的柔和性，其中己酸是濃香型白酒的主體香己酸乙酯的前體。乙偶姻呈奶油香氣，2,3-丁二醇也是白酒中重要香氣成分。
實施例4球形賴氨酸芽孢桿菌單獨在芝麻香型白酒生產(chǎn)中的應用
步驟1：液體種子培養(yǎng)物的制備：在無菌條件下挑1環(huán)CGMCC NO.13046菌于裝有100ml液體種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，置搖床上以旋轉轉速為100rpm、37℃培養(yǎng)24h，即制得一級液體種子培養(yǎng)物。
二級種子培養(yǎng)物的制備：將一級液體種子培養(yǎng)物以10％接種量接種于裝有2L液體種子培養(yǎng)基的5L搖瓶中，置搖床上以旋轉轉速為100rpm、37℃培養(yǎng)24h，即制得二級液體種子培養(yǎng)物。
上述種子液培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏10，葡萄糖10，NaCl 5，pH 7.0，1×105Pa滅菌20min。
步驟2：二級液體種子培養(yǎng)物以體積百分比為1％的接種量接種到裝有已滅菌的麩皮固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10d，制成固態(tài)麩曲。
麩皮固體培養(yǎng)基：采用粉碎后的麩皮，添加40％的水，100℃蒸煮30min。
步驟3：將上述固態(tài)麩曲混在經(jīng)過蒸酒后的酒醅和新糧、高溫大曲粉中進行堆積發(fā)酵。用曲量為投料量的20％，堆積時間2d。
步驟4：芝麻香堆積酒醅入窖發(fā)酵35d。
以未添加菌株的芝麻香型白酒正常發(fā)酵生產(chǎn)過程為對照，發(fā)酵35d后，對照酒醅(芝麻香型白酒正常發(fā)酵酒醅)中尿素為207mg/kg，EC濃度為146μg/kg；試驗樣品酒醅(添加由CGMCC NO.13046固體麩曲生產(chǎn)的酒醅)中尿素為128mg/kg，EC濃度為96μg/kg，尿素降低38％，EC降低34％。
實施例5球形賴氨酸芽孢桿菌混合菌株在濃香型白酒生產(chǎn)工藝中的應用
步驟1：液體種子培養(yǎng)物的制備：在無菌條件下用接種環(huán)挑1-2環(huán)CGMCC NO.13046菌于裝有100ml液體種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，置搖床上以旋轉轉速為100rpm、37℃培養(yǎng)24h，即制得一級液體種子培養(yǎng)物。
二級種子培養(yǎng)物的制備：10％接種量接種于裝有2l液體種子培養(yǎng)基的5l搖瓶中，置搖床上以旋轉轉速為100rpm、37℃培養(yǎng)24h，即制得二級液體種子培養(yǎng)物。
上述種子液培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏10，葡萄糖10，NaCl 5，pH 7.0，1×105Pa滅菌20min。
步驟2：球形賴氨酸芽孢桿菌的二級液體種子培養(yǎng)物以相同比例，總接種量1％(v/w)的共同接種到裝有已滅菌的麩皮固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10d，制成固態(tài)麩曲。
麩皮固體培養(yǎng)基：采用粉碎后的麩皮，添加40％的水，100℃蒸煮30min。
步驟3：將固體麩曲按照5％的接種量均勻拌入到大茬酒醅中，入窖發(fā)酵60d。
以未添加菌株的濃香型白酒發(fā)酵生產(chǎn)為對照，
發(fā)酵60d后，對照大茬酒醅(濃香型白酒正常發(fā)酵的大茬酒醅)中尿素為134mg/kg，EC濃度為124μg/kg；試驗樣品大茬酒醅(添加由CGMCC NO.13046制成固體麩曲生產(chǎn)的大茬酒醅)中尿素為81mg/kg，EC濃度為84μg/kg，尿素降低40％，EC降低32％。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。