本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及WU多瘤病毒重組抗原及其制備方法和應用。

背景技術(shù)：

WU多瘤病毒(WU polyomavirus,WUPyV)是2007年美國和澳大利亞科學家從1個3歲肺炎患兒的呼吸道標本中發(fā)現(xiàn)的一種新的多瘤病毒。研究發(fā)現(xiàn)，WUPyV廣泛分布于世界各地，在人體多種組織、體液及分泌物中檢測到WUPyV的存在，大量的分子生物學和有限的血清學研究結(jié)果表明，WUPyV主要經(jīng)呼吸道感染嬰幼兒及年幼兒童，并在部分病例引起嚴重下呼吸道疾病，如重癥肺炎等，由于多數(shù)研究未設(shè)立無癥狀對照組且WUPyV感染多呈現(xiàn)多種病毒混合感染的模式，其與人類呼吸道感染間的確切關(guān)系有待通過進一步研究予以明確。

1、WUPyV的分子生物學特點：

WUPyV全基因長度為5229bp(或5228bp)，是一閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，GC含量39％。基因組包括一個早期編碼區(qū)，編碼大T抗原(LTAg)、小T抗原(STAg)，在另一條鏈上包括一個晚期編碼區(qū)，編碼衣殼蛋白VP1、VP2和VP3，早期編碼區(qū)和晚期編碼區(qū)被非編碼調(diào)控區(qū)分開(見圖1)。

DNA的合成與轉(zhuǎn)錄均起始于調(diào)控區(qū)，呈相反的兩個方向進行，分別控制早期和晚期基因的轉(zhuǎn)錄和DNA的復制。

Venter等研究認為WUPyV的基因變異主要在VP1區(qū)，VP2及STAg基因較少變異，調(diào)節(jié)區(qū)末端—VP2始端(287-722nt)是WUPyV最大保守區(qū)域。本課題組在華南地區(qū)率先檢出WUPyV，基因組鑒定結(jié)果表明，廣東株(GenBank序列號GQ926975～926980)與Gaynor、韓國、我國浙江、北京地區(qū)檢測鑒定的WUPyV株具有高度同源性。

2、研究現(xiàn)狀：

迄今為止，尚未分離出完整的WUPyV顆粒，無體內(nèi)外病毒繁殖的報道，也無相應的細胞系或動物模型可用，根據(jù)基因組預測的基因編碼開放閱讀框能否在病毒感染目標期間進行真實表達有待證實。

絕大多數(shù)WUPyV從嬰幼兒、低齡兒童呼吸道分泌物中檢出，成人呼吸道中檢出率非常低。免疫功能低下者體內(nèi)WUPyV檢出率不同報道不同。Neske等發(fā)現(xiàn)約89％健康獻血人群體內(nèi)存在WUPyV IgG抗體。

WUPyV檢測目前完全依賴分子生物學方法。

WUPyV血清學研究報道較少，目前主要表達了VP1衣殼蛋白，對VP2、VP3和STAg蛋白表達的研究尚未見報道。也就是說，人類對WUPyV的認識極其有限，大多研究限于流行病學研究。已知WUPyV主要感染嬰幼兒人群以及免疫功能低下人群，但是該病毒的傳播途徑、潛伏組織或器官、潛伏期、進入細胞的方式、人體感染病毒后的免疫反應方式、病毒的致病性以及是否象其他多瘤病毒一樣引起人體腫瘤等諸多問題尚待明確，特別是其致病性，是首先需要進行明確的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種具備高靈敏度和特異性的WU多瘤病毒重組抗原及其制備方法和應用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種WU多瘤病毒重組抗原，包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

上述的WU多瘤病毒重組抗原由核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的WU多瘤病毒VP2核酸片段和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的WU多瘤病毒STAg核酸片段表達得到。

本發(fā)明還提供一種WU多瘤病毒重組抗原的制備方法，包括如下步驟：

步驟1、將核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的WU多瘤病毒VP2核酸片段和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的WU多瘤病毒STAg核酸片段鏈接，得VP2-STAg核酸片段；

步驟2、將VP2-STAg核酸片段裝入PGEX-20T質(zhì)粒，得PGEX-20T-VP2-STAg重組質(zhì)粒；

步驟3、將PGEX-20T-VP2-STAg重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，并誘導PGEX-20T-VP2-STAg重組質(zhì)粒表達蛋白，蛋白純化后即得WU多瘤病毒重組抗原。

本發(fā)明還提供所述的WU多瘤病毒重組抗原在制備預防或治療WU多瘤病毒感染的疫苗或藥物上的應用。

本發(fā)明的有益效果在于：將WU多瘤病毒VP2核酸片段和WU多瘤病毒STAg核酸片段鏈接后的嵌合片段構(gòu)建表達載體，表達出的重組蛋白敏感性好、特異性高，本發(fā)明制備方法制得的WU多瘤病毒重組抗原具有良好的抗原性，可用于WUPyV感染患兒抗體的檢測，也可用于人群WUPyV感染的流行病學調(diào)查。

附圖說明

圖1為WU多瘤病毒的基因組結(jié)構(gòu)模式圖(Gaynor,2007)。

圖2為本發(fā)明實施例WU多瘤病毒VP2核酸片段引物所得PCR產(chǎn)物圖譜。

圖3為本發(fā)明實施例WU多瘤病毒STAg核酸片段引物所得PCR產(chǎn)物圖譜。

圖4為本發(fā)明實施例PGEX-20T-VP2-STAg重組質(zhì)粒的鑒定圖譜。

圖5為本發(fā)明實施例GST-Resin純化柱純化蛋白抗原SDS-PAGE、免疫印跡鑒定結(jié)果。

具體實施方式

為詳細說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、所實現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實施方式并配合附圖予以說明。

本發(fā)明最關(guān)鍵的構(gòu)思在于：將WU多瘤病毒VP2核酸片段和WU多瘤病毒STAg核酸片段鏈接后的嵌合片段構(gòu)建表達載體，表達出的重組蛋白敏感性好、特異性高。

本發(fā)明提供一種WU多瘤病毒重組抗原，包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

上述的WU多瘤病毒重組抗原由核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的WU多瘤病毒VP2核酸片段和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的WU多瘤病毒STAg核酸片段表達得到。

本發(fā)明還提供一種重組載體，包含SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供一種WU多瘤病毒重組抗原的制備方法，包括如下步驟：

步驟1、將核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的WU多瘤病毒VP2核酸片段和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的WU多瘤病毒STAg核酸片段鏈接，得VP2-STAg核酸片段；

步驟2、將VP2-STAg核酸片段裝入PGEX-20T質(zhì)粒，得PGEX-20T-VP2-STAg重組質(zhì)粒；

步驟3、將PGEX-20T-VP2-STAg重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，并誘導PGEX-20T-VP2-STAg重組質(zhì)粒表達蛋白，蛋白純化后即得WU多瘤病毒重組抗原。

其中，步驟1中，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的WU多瘤病毒VP2核酸片段由堿基序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物組制得，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的WU多瘤病毒STAg核酸片段由堿基序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物組制得。

上述方法具體包括如下步驟：

步驟1、將堿基序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物組進行PCR反應，得WU多瘤病毒VP2核酸片段；將堿基序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物組進行PCR反應，得WU多瘤病毒STAg核酸片段；

步驟2、利用T4DNA連接酶將步驟1所得WU多瘤病毒VP2核酸片段和WU多瘤病毒STAg核酸片段進行平端鏈接，鏈接后用堿基序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.8的引物組進行擴增，得VP2-STAg核酸片段；

步驟3、VP2-STAg核酸片段和PGEX-20T質(zhì)粒分別用BamHⅠ和Xbal進行雙酶切，然后利用T4DNA連接酶進行連接反應，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、篩選后得PGEX-20T-VP2-STAg重組質(zhì)粒；

步驟4、將PGEX-20T-VP2-STAg重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E,coli菌株BL21的感受態(tài)細胞，IPTG誘導后表達重組蛋白，蛋白純化后即得WU多瘤病毒重組抗原。

本發(fā)明還提供所述的WU多瘤病毒重組抗原在制備預防或治療WU多瘤病毒感染的疫苗或藥物上的應用。

實施例

WUPyV VP2-STAg嵌合蛋白的設(shè)計、表達及鑒定

根據(jù)本實驗室樣本GD-WU816克隆的WUPyV基因序列(GQ926979.1)設(shè)計VP2核酸片段，目的是要避開VP3的核酸重疊序列，增加VP2抗原的特異性；同樣，設(shè)計STAg核酸片段，目的是要避開LTAg的核酸重疊序列，增加LTAg抗原的特異性。再將VP2核酸片段和STAg核酸片段鏈接在一起，得到VP2-STAg嵌合蛋白抗原的核酸片段序列。

1、VP2核酸片段引物：(GQ926979.0序列，574-1002nt)429bp

F(SEQ ID NO.5，含有BamHⅠ切點)：

5’-CGCGGATCCCGCATGGGCATATTGCTTGCTGTGCCTGAA-3’；

R(SEQ ID NO.6)：

5’-TCCTGGGTAGGGGGCGTGGAGG-3’

VP2核酸片段的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)：

atgggca tattgcttgc tgtgcctgaa ataattgctg catctgtagc tggaggagca gaggcactat caattgctgg atctggagct gcaatagcaa ctggtgaagg tttagctgct cttggtgggc ttacagagtc agcagcacta ttaggggaaa ctgttgaaat atctgaagca gctgctactg tactaacaaa agtacctgag cttgtaactg taacacaagg tgtaacagca gctgtacaag ggggtgcagg tcttgtaggt ggtatatata cagctttagc agcagatcgc cctggggacc tgcctgcgag taccccaaca ggaagtccaa gtggactaca tccccccgca ggatacaatc cccaaggagg tggacttaat atccagtcca tccacaagcc cctccacgcc ccctacccag ga

VP2核酸片段所得氨基酸序列(SEQ ID NO.1，143AA)：

MGILLAVPEI IAASVAGGAE ALSIAGSGAA IATGEGLAAL GGLTESAALL GETVEISEAA ATVLTKVPEL VTVTQGVTAA VQGGAGLVGG IYTALAADRP GDLPASTPTG SPSGLHPPAG YNPQGGGLNI QSIHKPLHAP YPG

分子量：13564.41Daltons

PCR反應體系及產(chǎn)物獲得：PCR反應的總體積為25μl，其中模板1μl，上下游引物各3pmol，10mmol/L dNTP混合物0.5μl，10×High Fidelity PCR buffer with MgCl2 2.5μl，高保真PCR酶混合物0.15μl，用無菌水補足至25μl。PCR反應參數(shù)均為94℃預變性3min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸90sec，共循環(huán)30次；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下迅速切下目的產(chǎn)物片段，將凝膠切碎，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收DNA，按照說明書進行操作，方法同前，用30μl滅菌去離子水洗脫，-20℃保存?zhèn)溆谩CR產(chǎn)物圖譜見圖2。PCR產(chǎn)物經(jīng)商業(yè)化序列測定正確。

2、STAg核酸片段引物：(GQ926979.0序列，4573-5157nt)585bp

F(SEQ ID NO.7)：

5’-ATGGATAAAACTTTGTCCAGAAATGAA-3’

R(SEQ ID NO.8，含有Xbal切點)：

5’-CTAGGTCTAGACTATTACCTGGTTAAGCCAACCCC-3’

STAg核酸片段的核苷酸序列(SEQ ID NO.4，585bp)：

atggataaaactttgtccagaaatgaagcaaaagaacttatgcagctgctgggtcttgatatgacctgctggggaaatttaccactaatgagaacaaaataccttagcaaatgcaaagaatttcatcctgacaaagggggaaatgaggaaaaaatgaaaaagcttaattctttatatttaaaactgcaagagtgtgttagtacagtgcaccaactaaatgaagaagaagatgaagtgtggagctcttcacaggtagaatgcacagaattgtgctgtaactttccccctagaaagtacaggcttgttggagaagtttatggtgatgtttttgaagagtatattttaaaagactgggacatatgcttaaaggggttttattatttgtgtaattgtttttactgctttttagacaagcgccacaagcaaaaatataaaatatttagaaaacctccaatgtggatagagtgttactgctacaggtgctatagagagtggtttggctttgaaattagtgcagaaacatttttttactggaaaaagattatatttcttacaaccatgcaaggggttggcttaaccaggtaa

STAg核酸片段所得氨基酸序列(SEQ ID NO.2，195AA)：

MDKTLSRNEAKELMQLLGLDMTCWGNLPLMRTKYLSKCKEFHPDKGGNEEKMKKLNSLYLKLQECVSTVHQLNEEEDEVWSSSQVECTELCCNFPPRKYRLVGEVYGDVFEEYILKDWDICLKGFYYLCNCFYCFLDKRHKQKYKIFRKPPMWIECYCYRCYREWFGFEISAETFFYWKKIIFLTTMQGVGLTR

分子量：23466.41Daltons

PCR反應體系及產(chǎn)物獲得：PCR反應的總體積為25μl，其中模板1μl，上下游引物各3pmol，10mmol/L dNTP混合物0.5μl，10×High Fidelity PCR buffer with MgCl2 2.5μl，高保真PCR酶混合物0.15μl，用無菌水補足至25μl。PCR反應參數(shù)均為94℃預變性3min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸90sec，共循環(huán)30次；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下迅速切下目的產(chǎn)物片段，將凝膠切碎，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收DNA，按照說明書進行操作，方法同前，用30μl滅菌去離子水洗脫，-20℃保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物圖譜見圖3。PCR產(chǎn)物經(jīng)商業(yè)化序列測定正確。

3、VP2核酸片段與STAg核酸片段的鏈接及表達載體構(gòu)建：

利用T4DNA連接酶進行常規(guī)平端鏈接，按試劑盒說明書操作。鏈接后用VP2上游引物(含有BamHⅠ切點)和STAg下游引物(含有Xbal切點)進行VP2-STAg核酸片段擴增，得到1101bp嵌合片段。雙酶切后常規(guī)方法裝入PGEX-20T質(zhì)粒。

重組質(zhì)粒的獲得

(1)PCR產(chǎn)物和PGEX-20T質(zhì)粒酶切

目的DNA VP2-STAg核酸片段及質(zhì)粒DNA分別用BamHⅠ和Xbal進行雙酶切，反應體系20μl：10×Buffer MC(MVLTI-CORETM Buffer)2μl，Acetylated BSA(10μg/μl)0.2μl，PCR DNA/質(zhì)粒DNA 5μl，BamHⅠ0.3μl，Xbal 0.3μl，加入滅菌去離子水12.2μl，37℃，4.5h。反應結(jié)束后進行1％的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察酶切結(jié)果并切下雙酶切的條帶，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收DNA，方法同前。

(2)PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒DNA連接

利用T4DNA連接酶進行連接反應，VP2-STAg DNA和質(zhì)粒DNA按照10：1～3：1的比例混合，反應體系10μl：質(zhì)粒DNA 2.5μl，VP2-STAg DNA 6.0μl，10×T4 DNA Ligase Buffer 1.0μl，T4 DNA Ligase 0.5μl，16℃連接過夜。連接物存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

(3)轉(zhuǎn)化

取5μl連接產(chǎn)物加入冰上預冷的TOP10感受態(tài)細胞中，充分混勻，冰上30min，同時用質(zhì)粒DNA加入感受態(tài)細胞中作為陽性對照，感受態(tài)細胞作陰性對照。42℃熱休克90sec，取出后迅速冰浴2min，加入LB培養(yǎng)液300μl，37℃振蕩培養(yǎng)1h。將轉(zhuǎn)化混合物平鋪于含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)過夜。

(4)重組質(zhì)粒的篩選、檢測

挑取LB-氨芐青霉素篩選平板上的單克隆菌落，接種于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，用天根的質(zhì)粒小提試劑盒說明書進行操作，提取質(zhì)粒，用60μl滅菌去離子水洗脫，利用BamHⅠ和Xbal內(nèi)切酶酶切檢測，篩選重組質(zhì)粒。構(gòu)建的PGEX-20T-VP2-STAg表達質(zhì)粒酶切鑒定如圖4。

4、PGEX-20T-VP2-STAg抗原表達及純化：

常規(guī)方法將PGEX-20T-VP2-STAg重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E,coli菌株BL21(DE3)的感受態(tài)細胞，IPTG誘導后表達GST-VP2-STAg重組抗原，分子量約為63.5KD(GST約為26.44KD)。

(1)重組蛋白的誘導表達

取1μl篩選陽性的重組質(zhì)粒加入預冷的25μl表達菌株BL21(DE3)的感受態(tài)細胞，混合均勻后冰浴30min，然后42℃熱休克90sec，迅速冰上靜置2min，加入300μl LB培養(yǎng)液，37℃振蕩1h，將轉(zhuǎn)化混合物平鋪于含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取3-4個克隆菌落于5ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，37℃，振蕩培養(yǎng)3h，測定OD600在0.6左右，取出2ml菌液作為誘導菌的對照，37℃振搖；取出2ml菌液于滅菌試管中加入2μl 1mol/L IPTG(IPTG終濃度1mmol/L)，37℃振搖3h，離心收菌，棄盡液體，向沉淀中加入50μl無菌去離子水混勻，加入50μl 2×Loading Buffer混勻，沸水中煮5min，12000g離心10min；取10μl上清進行SDS-PAGE(10％分離膠，6％濃縮膠)?？捡R斯亮蘭R-250染色30min；脫色液脫色至背景清晰，利用計算機凝膠掃描儀系統(tǒng)掃描成像。

(2)Western-Blot檢測表達產(chǎn)物

將誘導的全菌進行SDS-PAGE；按照Bio-Rad公司的產(chǎn)品說明書，使凝膠靠近電極陰極一側(cè)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜靠近陽極一側(cè)，轉(zhuǎn)移緩沖液為480mmol/L Tris-390mmol/L-1mmol/LSDS-甘氨酸-20％甲醇，100mA電轉(zhuǎn)移1h，使蛋白由凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，電轉(zhuǎn)結(jié)束后，取出PVDF膜用3％脫脂奶室溫搖床封閉2h，以封閉非特異性結(jié)合位點，加入鼠抗GST單克隆抗體(5μl/ml)，于搖床室溫反應1h，用洗滌液室溫搖床洗膜4次，每次5min，加入3％脫脂奶稀釋的羊抗鼠IgG(Sigma公司生產(chǎn))(按照1：5000稀釋)于搖床室溫反應1h，同前洗膜，加入北京宜安泰醫(yī)療技術(shù)公司生產(chǎn)的試劑2和過氧化脲(100：10)，室溫搖床反應5min，用蒸餾水沖洗終止顯色反應。經(jīng)GST-Resin純化柱純化蛋白抗原SDS-PAGE、免疫印跡鑒定結(jié)果如圖5。

5、VP2-STAg重組抗原的初步應用：

將純化的WUPyV VP2-STAg重組抗原包被板條，采用常規(guī)ELISA實驗，檢測WUPyV感染陽性(PCR核酸檢測陽性)患者的血清標本，以及健康的兒童對照血清標本和成人對照血清標本。與VP2、STAg抗原比對結(jié)果見表1：WUPyV VP2-STAg、VP2、STAg重組蛋白的IgG抗體檢測比對結(jié)果。

表1

數(shù)據(jù)顯示，VP2-STAg重組蛋白具有良好的抗原性，可用于WUPyV感染患兒IgG抗體的檢測，檢出率為34.62％，兒童對照組IgG抗體檢出率為52.50％，隨著年齡的增長WUPyV IgG抗體檢出率成人可達70％以上。提示W(wǎng)UPyV抗體可能具有保護功能，只有當嬰幼兒初次感染W(wǎng)UPyV時容易患病。VP2-STAg重組蛋白的敏感性和特異性均高于單獨使用VP2、STAg重組蛋白的檢測，

綜上所述，本發(fā)明制備方法制得的WU多瘤病毒重組抗原具有良好的抗原性，可用于WUPyV感染患兒IgG抗體的檢測，檢出率為34.62％，兒童IgG抗體檢出率為52.50％，隨著年齡的增長WUPyV IgG抗體檢出率成人可達70％以上。

以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等同變換，或直接或間接運用在相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市福田區(qū)人民醫(yī)院

<120> WU多瘤病毒重組抗原及其制備方法和應用

<130> 2016

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 143

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gly Ile Leu Leu Ala Val Pro Glu Ile Ile Ala Ala Ser Val Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ala Glu Ala Leu Ser Ile Ala Gly Ser Gly Ala Ala Ile Ala

20 25 30

Thr Gly Glu Gly Leu Ala Ala Leu Gly Gly Leu Thr Glu Ser Ala Ala

35 40 45

Leu Leu Gly Glu Thr Val Glu Ile Ser Glu Ala Ala Ala Thr Val Leu

50 55 60

Thr Lys Val Pro Glu Leu Val Thr Val Thr Gln Gly Val Thr Ala Ala

65 70 75 80

Val Gln Gly Gly Ala Gly Leu Val Gly Gly Ile Tyr Thr Ala Leu Ala

85 90 95

Ala Asp Arg Pro Gly Asp Leu Pro Ala Ser Thr Pro Thr Gly Ser Pro

100 105 110

Ser Gly Leu His Pro Pro Ala Gly Tyr Asn Pro Gln Gly Gly Gly Leu

115 120 125

Asn Ile Gln Ser Ile His Lys Pro Leu His Ala Pro Tyr Pro Gly

130 135 140

<210> 2

<211> 194

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Asp Lys Thr Leu Ser Arg Asn Glu Ala Lys Glu Leu Met Gln Leu

1 5 10 15

Leu Gly Leu Asp Met Thr Cys Trp Gly Asn Leu Pro Leu Met Arg Thr

20 25 30

Lys Tyr Leu Ser Lys Cys Lys Glu Phe His Pro Asp Lys Gly Gly Asn

35 40 45

Glu Glu Lys Met Lys Lys Leu Asn Ser Leu Tyr Leu Lys Leu Gln Glu

50 55 60

Cys Val Ser Thr Val His Gln Leu Asn Glu Glu Glu Asp Glu Val Trp

65 70 75 80

Ser Ser Ser Gln Val Glu Cys Thr Glu Leu Cys Cys Asn Phe Pro Pro

85 90 95

Arg Lys Tyr Arg Leu Val Gly Glu Val Tyr Gly Asp Val Phe Glu Glu

100 105 110

Tyr Ile Leu Lys Asp Trp Asp Ile Cys Leu Lys Gly Phe Tyr Tyr Leu

115 120 125

Cys Asn Cys Phe Tyr Cys Phe Leu Asp Lys Arg His Lys Gln Lys Tyr

130 135 140

Lys Ile Phe Arg Lys Pro Pro Met Trp Ile Glu Cys Tyr Cys Tyr Arg

145 150 155 160

Cys Tyr Arg Glu Trp Phe Gly Phe Glu Ile Ser Ala Glu Thr Phe Phe

165 170 175

Tyr Trp Lys Lys Ile Ile Phe Leu Thr Thr Met Gln Gly Val Gly Leu

180 185 190

Thr Arg

<210> 3

<211> 429

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgggcatat tgcttgctgt gcctgaaata attgctgcat ctgtagctgg aggagcagag 60

gcactatcaa ttgctggatc tggagctgca atagcaactg gtgaaggttt agctgctctt 120

ggtgggctta cagagtcagc agcactatta ggggaaactg ttgaaatatc tgaagcagct 180

gctactgtac taacaaaagt acctgagctt gtaactgtaa cacaaggtgt aacagcagct 240

gtacaagggg gtgcaggtct tgtaggtggt atatatacag ctttagcagc agatcgccct 300

ggggacctgc ctgcgagtac cccaacagga agtccaagtg gactacatcc ccccgcagga 360

tacaatcccc aaggaggtgg acttaatatc cagtccatcc acaagcccct ccacgccccc 420

tacccagga 429

<210> 4

<211> 585

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggataaaa ctttgtccag aaatgaagca aaagaactta tgcagctgct gggtcttgat 60

atgacctgct ggggaaattt accactaatg agaacaaaat accttagcaa atgcaaagaa 120

tttcatcctg acaaaggggg aaatgaggaa aaaatgaaaa agcttaattc tttatattta 180

aaactgcaag agtgtgttag tacagtgcac caactaaatg aagaagaaga tgaagtgtgg 240

agctcttcac aggtagaatg cacagaattg tgctgtaact ttccccctag aaagtacagg 300

cttgttggag aagtttatgg tgatgttttt gaagagtata ttttaaaaga ctgggacata 360

tgcttaaagg ggttttatta tttgtgtaat tgtttttact gctttttaga caagcgccac 420

aagcaaaaat ataaaatatt tagaaaacct ccaatgtgga tagagtgtta ctgctacagg 480

tgctatagag agtggtttgg ctttgaaatt agtgcagaaa cattttttta ctggaaaaag 540

attatatttc ttacaaccat gcaaggggtt ggcttaacca ggtaa 585

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcggatccc gcatgggcat attgcttgct gtgcctgaa 39

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcctgggtag ggggcgtgga gg 22

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggataaaa ctttgtccag aaatgaa 27

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctaggtctag actattacct ggttaagcca acccc 35