本發(fā)明屬于食品發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用混合菌劑強(qiáng)化傳統(tǒng)食醋固態(tài)發(fā)酵的方法及一株用于食醋固態(tài)發(fā)酵的瑞士乳桿菌。

背景技術(shù)：

我國傳統(tǒng)食醋釀造過程多采用自然發(fā)酵方式，發(fā)酵過程乳酸菌、醋酸菌等微生物代謝產(chǎn)生了多種有機(jī)酸、多糖等成分，賦予產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味。我國傳統(tǒng)食醋生產(chǎn)多以大曲作為發(fā)酵劑起始發(fā)酵，分別經(jīng)過酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵兩個階段，仍然存在發(fā)酵周期較長，原料利用率偏低，產(chǎn)品質(zhì)量批次不穩(wěn)定等問題。

乳酸菌是食醋固態(tài)釀造中一類重要的功能性微生物，能代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸等有機(jī)酸。乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸(以乳酸為主)酸性柔和，具有特定的芳香氣味，不僅能夠緩和食醋中乙酸的刺激性氣味，使其口感更加圓潤，且提高食醋的品質(zhì)。其中瑞士乳桿菌、乳酸片球菌還是公認(rèn)的益生菌，能夠代謝產(chǎn)生胞外多糖和γ-氨基丁酸等重要生理活性物質(zhì)。但在食醋固態(tài)釀造過程中，隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行醋醅酸度逐漸升高，并且發(fā)酵溫度達(dá)到45℃以上，部分乳酸菌因不耐受環(huán)境變化豐度逐漸降低，導(dǎo)致其功能不能充分發(fā)揮。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種利用混合菌劑強(qiáng)化傳統(tǒng)食醋固態(tài)發(fā)酵的方法及其應(yīng)用。所述混合菌劑由瑞士乳桿菌、異常漢遜酵母、解淀粉芽孢桿菌和乳酸片球菌組成，用于食醋固態(tài)發(fā)酵，可提高發(fā)酵效率和原料利用率，改善產(chǎn)品品質(zhì)。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種利用混合菌劑強(qiáng)化傳統(tǒng)食醋固態(tài)發(fā)酵的方法，包括：在食醋固態(tài)發(fā)酵的酒精發(fā)酵階段，添加由瑞士乳桿菌、異常漢遜酵母和解淀粉芽孢桿菌的菌劑組成的混合菌劑1；在食醋固態(tài)發(fā)酵的醋酸發(fā)酵階段，添加由瑞士乳桿菌和乳酸片球菌的菌劑組成的混合菌劑2。

進(jìn)一步地，在食醋固態(tài)發(fā)酵的酒精發(fā)酵階段，添加由瑞士乳桿菌、異常漢遜酵母和解淀粉芽孢桿菌的菌劑組成的混合菌劑1，分1-3次添加，每次添加比例為每公斤酒醪添加1-10g混合菌劑1；在食醋固態(tài)發(fā)酵的醋酸發(fā)酵階段，添加由瑞士乳桿菌和乳酸片球菌的菌劑組成的混合菌劑2，分1-3次添加，每次添加比例為每公斤醋醅添加1-10g混合菌劑2。

進(jìn)一步地，所述瑞士乳桿菌是由本發(fā)明提供的一株瑞士乳桿菌CGMCC No.12062，該菌株分離自中國傳統(tǒng)食醋發(fā)酵醋醅，菌落特征如下：菌落較小，菌落圓形，乳白色，邊緣整齊，兼性厭氧；革蘭氏陽性，無芽孢；最適生長溫度范圍30℃-47℃，生長pH范圍3.0-7.0，該菌株應(yīng)用于食醋固態(tài)發(fā)酵，能在食醋發(fā)酵條件下正常生長并代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、胞外活性多糖、氨基酸、γ-氨基丁酸。

該瑞士乳桿菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所(郵編100101)，保藏編號為CGMCC No.12062，保藏時間為2016年01月14日，分類命名為瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)。

進(jìn)一步地，所述混合菌劑的制備方法如下：

(1)瑞士乳桿菌培養(yǎng)：將瑞士乳桿菌按照1％-10％接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，在30℃-37℃靜置培養(yǎng)20-24h，形成種子培養(yǎng)液；將種子培養(yǎng)液以1％-10％的接種量接入乳酸菌增殖培養(yǎng)基中，在30℃-37℃靜置培養(yǎng)20-24h，離心收集乳酸菌菌體，將保護(hù)劑與乳酸菌菌體均勻混合放置在40-45℃的培養(yǎng)箱中熱激1-10s，然后利用噴霧冷凍干燥制得菌劑；瑞士乳桿菌的活菌數(shù)約為10⁹～10¹¹CFU/g菌劑。

(2)乳酸片球菌培養(yǎng)：將乳酸片球菌按照1％-10％接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，在30℃-37℃靜置培養(yǎng)20-24h，形成種子培養(yǎng)液；將種子培養(yǎng)液以1％-10％的接種量接入乳酸菌增殖培養(yǎng)基的接種量接入增殖培養(yǎng)基中，在30℃-37℃靜置培養(yǎng)20-24h，離心收集乳酸菌菌體，將保護(hù)劑與乳酸菌菌體均勻混合放置在40-45℃的培養(yǎng)箱中熱激1-10s，然后利用噴霧冷凍干燥制得菌劑；乳酸片球菌的活菌數(shù)約為10⁹～10¹¹CFU/g菌劑。

(3)解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)：將解淀粉芽孢桿菌按照1％-10％接種量接種到解淀粉芽孢桿菌增殖培養(yǎng)基中，在35℃-37℃搖床250r/min培養(yǎng)20-24h后形成種子培養(yǎng)液；將種子培養(yǎng)液以1％-10％的接種量接入上述解淀粉芽孢桿菌增殖培養(yǎng)基中，在35℃-37℃搖床250r/min培養(yǎng)20-24h，離心收集菌體，將保護(hù)劑與菌體均勻混合放置在40-45℃的培養(yǎng)箱中熱激1-10s，然后利用噴霧冷凍干燥制得菌劑；解淀粉芽孢桿菌的活菌數(shù)約為10⁸～10¹⁰CFU/g菌劑。

(4)異常漢遜酵母培養(yǎng)：將異常漢遜酵母按照1％-10％接種量接種到異常漢遜酵母增殖培養(yǎng)基，在30℃-37℃搖床250r/min培養(yǎng)20-24h形成種子培養(yǎng)液；將種子培養(yǎng)液以1％-10％的接種量接入異常漢遜酵母增殖培養(yǎng)基中，在30℃-37℃靜置培養(yǎng)20-24h，離心收集菌體，將保護(hù)劑與菌體均勻混合放置在40-45℃的培養(yǎng)箱中熱激1-10s，然后利用噴霧冷凍干燥制得菌劑；異常漢遜酵母的活菌數(shù)約為10⁸～10¹⁰CFU/g菌劑。

(5)由以上步驟制得的瑞士乳桿菌、異常漢遜酵母和解淀粉芽孢桿菌的菌劑，按質(zhì)量比(1-2):1:1混合即為混合菌劑1；由以上步驟制得的瑞士乳桿菌和乳酸片球菌的菌劑，按質(zhì)量比1:1混合即為混合菌劑2。

進(jìn)一步地，所述保護(hù)劑與菌體混合比例為15-20:1(V:m)。

進(jìn)一步地，噴霧冷凍干燥的保護(hù)劑為乳糖和麥芽糊精；更進(jìn)一步地，所述乳糖濃度為50-60g/L，所述麥芽糊精濃度為100-120g/L。

進(jìn)一步地，所述乳酸菌增殖培養(yǎng)基的組成：葡萄糖2％，蛋白胨1％，牛肉提取物1％，酵母提取物0.5％，無水乙酸鈉0.5％，吐溫80 0.1％(v/v)，檸檬酸銨0.2％，磷酸氫二鉀0.2％，硫酸鎂0.058％，硫酸錳0.025％，麥芽汁20％-30％，余量為水，調(diào)節(jié)pH為6.2-6.8。

進(jìn)一步地，所述解淀粉芽孢桿菌增殖培養(yǎng)基的組成：葡萄糖10％，蛋白胨3％，酵母膏1％，K₂HPO₄ 0.5％，余量為水。

進(jìn)一步地，所述異常漢遜酵母增殖培養(yǎng)基的組成：稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000ml煮沸半個小時，紗布過濾，再加10-20g葡萄糖,自然pH。

本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：

(1)本發(fā)明優(yōu)選了一株瑞士乳桿菌CGMCC No.12062，該菌株耐高溫，耐酸，并且高產(chǎn)活性多糖和γ-氨基丁酸，將瑞士乳桿菌、異常漢遜酵母、解淀粉芽孢桿菌和乳酸片球菌按比例組成混合菌劑添加到傳統(tǒng)固態(tài)食醋發(fā)酵過程中，不僅縮短發(fā)酵周期，發(fā)酵效率提高10％-30％，原料利用率提高1％-5％。

(2)混合菌劑應(yīng)用于傳統(tǒng)食醋發(fā)酵過程中，在保持傳統(tǒng)食醋風(fēng)味的基礎(chǔ)上，改善食醋的品質(zhì)。提高食醋產(chǎn)品中重要生理活性成分的含量，食醋產(chǎn)品總酸≥7.0g/100mL，其乳酸含量≥2.7g/100mL，活性多糖的含量≥3g/100mL。

(3)瑞士乳桿菌和乳酸片球菌是公認(rèn)的益生菌，還可以利用谷氨酸鈉生產(chǎn)少量的γ-氨基丁酸，γ-氨基丁酸作為一種非蛋白氨基酸具有促進(jìn)睡眠，緩解焦慮的功效，在固態(tài)傳統(tǒng)發(fā)酵食醋中應(yīng)用，淋出食醋中γ-氨基丁酸量約為0.20-0.25g/100mL。同時也能提高食醋中γ-氨基丁酸和乳酸鈉含量，乳酸鈉作為防腐劑可以抑制食醋雜菌生長繁殖，食用更為健康，也使食醋口感更佳圓潤、柔和，同時提高了食醋的保健價值。

附圖說明

圖1：瑞士乳桿菌耐溫生長曲線。

圖2：瑞士乳桿菌耐溫產(chǎn)總酸(以乳酸計)。

圖3：瑞士乳桿菌耐酸生長曲線。

圖4：瑞士乳桿菌耐酸產(chǎn)總酸(以乳酸計)。

圖5：不同麥芽汁濃度對瑞士乳桿菌活菌數(shù)的影響；其中，A：MRS；B：MRS+10％麥芽汁；C：MRS+20％麥芽汁；D：MRS+30％麥芽汁；E：MRS+40％麥芽汁。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例中涉及到的百分號“％”，若未特別說明，指質(zhì)量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶質(zhì)的克數(shù)，液體之間的百分比，是指在25℃時溶液的體積比例。

實(shí)施例1：一株瑞士乳桿菌的獲得及混合菌劑的制備。

瑞士乳桿菌CGMCC No.12062的獲得：

(1)菌株的初步篩選：從山西老陳醋發(fā)酵階段的醋醅中，采用雙層平板法，稀釋涂布于pH4.0的MRS培養(yǎng)基平板(利用乳酸調(diào)節(jié)pH值)，在37℃和45℃兩個溫度壓力下培養(yǎng)48h，挑選能在45℃下正常生長且有透明圈的菌落進(jìn)行多次劃線純化，直至培養(yǎng)皿中微生物菌落形態(tài)完全一致，挑取單一菌落到MRS培養(yǎng)基，培養(yǎng)12小時后獲得初篩菌種，保藏菌株甘油管，于-20℃冰箱凍存一天，放入-80℃冰箱長期保藏。

其中，MRS培養(yǎng)基：葡萄糖2％，蛋白胨1％，牛肉提取物1％，酵母提取物0.5％，無水乙酸鈉0.5％，吐溫80 0.1％(v/v)，檸檬酸銨0.2％，磷酸氫二鉀0.2％，硫酸鎂0.058％，硫酸錳0.025％，余量為水，pH為6.2-6.8。

(2)菌株的再次篩選：將初篩菌種進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，接入MRS培養(yǎng)基37℃靜置發(fā)酵48h，利用冰乙醇過夜沉淀的方法提取粗多糖，苯酚硫酸法測定多糖含量，選取多糖產(chǎn)量高的菌株乳酸菌AAF1-5，乳酸菌AAF1-5多糖含量為215.0±0.1mg/L。提取乳酸菌AAF1-5基因組DNA，PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA序列，將測序結(jié)果上傳Genbank比對，鑒定該菌株為瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)。

篩選獲得的瑞士乳桿菌AAF1-5保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC No.12062，保藏日期為2016年3月28日，分類命名為瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)。

混合菌劑的制備：

(1)瑞士乳桿菌培養(yǎng)：將瑞士乳桿菌按照1％-10％接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，在30℃-37℃靜置培養(yǎng)20-24h，形成種子培養(yǎng)液；將種子培養(yǎng)液以1％-10％的接種量接入乳酸菌增殖培養(yǎng)基中，在30℃-37℃靜置培養(yǎng)20-24h，離心收集乳酸菌菌體，將保護(hù)劑與乳酸菌菌體均勻混合放置在40-45℃的培養(yǎng)箱中熱激1-10s，然后利用噴霧冷凍干燥制得菌劑；瑞士乳桿菌的活菌數(shù)約10⁹～10¹¹CFU/g菌劑；

(2)乳酸片球菌培養(yǎng)：將乳酸片球菌按照1％-10％接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，在30℃-37℃靜置培養(yǎng)20-24h，形成種子培養(yǎng)液；將種子培養(yǎng)液以1％-10％的接種量接入乳酸菌增殖培養(yǎng)基中，在30℃-37℃靜置培養(yǎng)20-24h，離心收集乳酸菌菌體，將保護(hù)劑與乳酸菌菌體均勻混合放置在40-45℃的培養(yǎng)箱中熱激1-10s，然后利用噴霧冷凍干燥制得菌劑；乳酸片球菌的活菌數(shù)約為10⁹～10¹¹CFU/g菌劑；

(3)解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)：將解淀粉芽孢桿菌按照1％-10％接種量接種到解淀粉芽孢桿菌增殖培養(yǎng)基中，在35℃-37℃搖床250r/min培養(yǎng)20-24h后形成種子培養(yǎng)液；將種子培養(yǎng)液以1％-10％的接種量接入上述解淀粉芽孢桿菌增殖培養(yǎng)基中，在35℃-37℃搖床250r/min培養(yǎng)20-24h，離心收集菌體，將保護(hù)劑與菌體均勻混合放置在40-45℃的培養(yǎng)箱中熱激1-10s，然后利用噴霧冷凍干燥制得菌劑；解淀粉芽孢桿菌的活菌數(shù)約為10⁸～10¹⁰CFU/g菌劑；

(4)異常漢遜酵母培養(yǎng)：將異常漢遜酵母按照1％-10％接種量接種到異常漢遜酵母增殖培養(yǎng)基中，在30℃-37℃搖床250r/min培養(yǎng)20-24h形成種子培養(yǎng)液；將種子培養(yǎng)液以1％-10％的接種量接入異常漢遜酵母增殖培養(yǎng)基中，在30℃-37℃靜置培養(yǎng)20-24h，離心收集菌體，將保護(hù)劑與菌體均勻混合放置在40-45℃的培養(yǎng)箱中熱激1-10s，然后利用噴霧冷凍干燥制得菌劑；異常漢遜酵母的活菌數(shù)約為10⁸～10¹⁰CFU/g菌劑；

其中，乳酸菌增殖培養(yǎng)基：葡萄糖2％，蛋白胨1％，牛肉提取物1％，酵母提取物0.5％，無水乙酸鈉0.5％，吐溫80 0.1％(v/v)，檸檬酸銨0.2％，磷酸氫二鉀0.2％，硫酸鎂0.058％，硫酸錳0.025％，麥芽汁20％-30％，余量為水，調(diào)節(jié)pH為6.2-6.8。

其中，解淀粉芽孢桿菌增殖培養(yǎng)基：葡萄糖10％，蛋白胨3％，酵母膏1％，K₂HPO₄0.5％，余量為水。

其中，異常漢遜酵母增殖培養(yǎng)基：稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000ml煮沸半個小時，紗布過濾，再加10-20g葡萄糖,自然pH。

其中，噴霧冷凍干燥的保護(hù)劑為：50-60g/L乳糖和100-120g/L麥芽糊精。所述保護(hù)劑與菌體混合比例為15-20:1(V:m)。

(5)混合菌劑的制備：由以上步驟制得的瑞士乳桿菌、異常漢遜酵母和解淀粉芽孢桿菌的菌劑，按質(zhì)量比(1-2):1:1混合即為混合菌劑1。由以上步驟制得的瑞士乳桿菌和乳酸片球菌的菌劑，按質(zhì)量比1:1混合即為混合菌劑2。

下面的實(shí)施例以簡化的方式敘述，對實(shí)施例1中已敘述的內(nèi)容，下面的實(shí)施例中重復(fù)內(nèi)容可能不再具體敘述，但視為與實(shí)施例1相同。

實(shí)施例2：在食醋發(fā)酵過程中酒精發(fā)酵階段添加混合菌劑1。

(1)混合菌劑1的制備：按照實(shí)施例1所述混合菌劑的制備方法分別制備瑞士乳桿菌(CGMCC No.12062)、異常漢遜酵母(CCTCC AY 93050，商業(yè)機(jī)構(gòu)購買)和解淀粉芽孢桿菌(CCTCC AB 205140，商業(yè)機(jī)構(gòu)購買)的菌劑，按質(zhì)量比(1～2):1:1混合即為混合菌劑1。

(2)原料處理：將高粱粉碎為6-8瓣后，加入溫水，煮料1.5-2h后，每100kg高粱加入62.5kg大曲粉(工廠購買)混勻。

(3)酒精發(fā)酵：將上述原料放入酒缸(高約1.5m)，進(jìn)行稀醪酒精發(fā)酵，前4天敞口發(fā)酵，后8天封口發(fā)酵，共12天。發(fā)酵車間利用空調(diào)保持溫度為18℃，入缸初始溫度約20-25℃，發(fā)酵第二天溫度約26-28℃時，按上述的方法制備的混合菌劑1分1-3次添加，每次按照每公斤酒醪稱取1-10g的混合菌劑1，加入無菌水恒溫振蕩15min，進(jìn)行復(fù)水活化，添加菌劑與酒醪混合均勻。第3天最高溫度可達(dá)30℃。發(fā)酵終止酒精度約為8.9°(v/v)，酸度約1g/100mL。

此外，設(shè)置常規(guī)發(fā)酵的正常組作為對照，不添加本發(fā)明所述的混合菌劑。

(4)醋酸發(fā)酵：將酒醪中加入麩皮、稻殼等，混勻制成醋醅，每100kg高粱原料加50kg麩皮，初始酒度約4°(v/v)；將醋醅分裝至醋缸(高約0.5m)，第2天進(jìn)行翻醅混勻，缸口上蓋草墊，28-30℃啟動發(fā)酵，每天翻醅一次(倒缸)。

表1醋酸發(fā)酵過程中醋醅品溫變化

由表1可看出實(shí)驗(yàn)組和正常組品溫的變化不明顯，強(qiáng)化組品溫快結(jié)束時比正常組高。第6天，按高粱質(zhì)量的5％加入食鹽終止發(fā)酵(滅火)，防止醋酸過氧化(如醋酸發(fā)酵效果較好，溫度自然降低，則不用加鹽)。發(fā)酵結(jié)束后強(qiáng)化組酸度約7.05±0.30g/100g醋醅，與正常組相比酸度沒有提高，乳酸含量2.3±0.08g/100g醋醅，提高了150g/100g醋醅，相比正常組提高3.15％。

(5)淋醋：采用套淋工藝，每批醋醅套淋三次。將上一批淡醋液(第二次套淋液)混合后，加熱至沸騰，按1斤高粱9斤水的比例浸泡醋醅6-8h，自然控干，所得醋液進(jìn)行后續(xù)曬醋工藝，剩余醋醅進(jìn)行第二次淋醋，第二次淋醋所得淡醋液用于下批淋醋，以此類推。

(6)滅菌：97°濕熱滅菌25分鐘。

(7)罐裝：將滅菌的食醋進(jìn)行裝罐，測得食醋產(chǎn)品活性多糖相對含量提高了30％。食醋產(chǎn)品用量0.4mL時，DPPH·的清除率為56％，其半清除率(EC50)為21.6±0.12mg/mL。

表2罐裝食醋對DPPH自由基清除率

實(shí)施例3：在食醋發(fā)酵過程中醋酸發(fā)酵階段添加混合菌劑2。

(1)混合菌劑2的制備：按照實(shí)施例1所述混合菌劑的制備方法分別制備瑞士乳桿菌(CGMCC No.12062)和乳酸片球菌(CICC No.10346，商業(yè)機(jī)構(gòu)購買)的菌劑，按質(zhì)量比1:1混合即為混合菌劑2。

(2)原料處理：將高粱粉碎為6-8瓣后，加入溫水，煮料1.5-2h后，每100kg，高粱加入62.5kg大曲粉混勻。

(3)酒精發(fā)酵：將上述原料放入酒缸(高約1.5m)，進(jìn)行稀醪酒精發(fā)酵，前4天敞口發(fā)酵，后8天封口發(fā)酵，共12天。發(fā)酵車間利用空調(diào)保持溫度為18℃，入缸初始溫度約20-25℃，第4天最高溫度可達(dá)30℃。發(fā)酵終止酒精度約為8.9°(v/v)，酸度約1g/100mL。

(4)醋酸發(fā)酵：將酒醪中加入麩皮，混勻制成醋醅，每100kg高粱原料加50kg麩皮，初始酒度約4°(v/v)；將醋醅分裝至醋缸(高約0.5m)，混合菌劑2按食醋發(fā)酵過程中溫度的變化添加，在醋酸發(fā)酵起始溫度為28℃-30℃時可以添加，待醋酸發(fā)酵第2-3天后溫度上升約為38℃-40℃時也可以添加，總共分1-3次添加，每次按照每公斤醋醅稱取1-10g的混合菌劑2，加入無菌水恒溫振蕩15min，進(jìn)行復(fù)水活化，接入菌劑與翻醅進(jìn)行反復(fù)混勻。缸口上蓋草墊，每天翻醅一次(倒缸)。

此外，設(shè)置常規(guī)發(fā)酵的正常組作為對照，不添加本發(fā)明所述的混合菌劑。對比結(jié)果如表3所示。

表3醋酸發(fā)酵過程中醋醅品溫變化

由表3可看出強(qiáng)化組第2天醅溫約40℃，第3天溫度最高，約45℃，第6天溫度降至35℃，測定總酸發(fā)現(xiàn)比原來不加菌劑發(fā)酵周期提前了2天達(dá)到酸度約7.04g/100g醋醅。第6天，按高粱質(zhì)量的5％加入食鹽終止發(fā)酵(滅火)，防止醋酸過氧化(如醋酸發(fā)酵效果較好，溫度自然降低，則不用加鹽)。發(fā)酵結(jié)束酸度約7.11±0.32g/100g醋醅，與正常組相比酸度提高8.3％，乳酸含量2.7g/100g醋醅，提高了350mg/100g醋醅，相比正常提高7.15％。

(5)淋醋：采用套淋工藝，每批醋醅套淋三次。將上一批淡醋液(第二次套淋液)混合后，加熱至沸騰，按1斤高粱9斤水的比例浸泡醋醅6-8h，自然控干，所得醋液進(jìn)行后續(xù)曬醋工藝，剩余醋醅進(jìn)行第二次淋醋，第二次淋醋所得淡醋液用于下批淋醋，以此類推。

(6)滅菌：97℃濕熱滅菌25分鐘。

(7)罐裝：將滅菌的食醋進(jìn)行裝罐，測得食醋產(chǎn)品活性多糖相對含量提高了53％。食醋產(chǎn)品用量0.2ml時，DPPH·的清除率為56％，其半清除率(EC50)為10.8±0.02mg/ml(具體如表4所示)。

表4罐裝食醋對DPPH自由基清除率

實(shí)施例4：在食醋發(fā)酵過程中酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵兩階段都添加混合菌劑。

(1)混合菌劑的制備：按照實(shí)施例1所述混合菌劑的制備方法分別制備瑞士乳桿菌(CGMCC No.12062)、異常漢遜酵母(CCTCC AY 93050，商業(yè)機(jī)構(gòu)購買)和解淀粉芽孢桿菌(CCTCC AB 205140，商業(yè)機(jī)構(gòu)購買)的菌劑，按質(zhì)量比(1-2):1:1混合即為混合菌劑1。按照實(shí)施例1所述混合菌劑的制備方法分別制備瑞士乳桿菌(CGMCC No.12062)和乳酸片球菌(CICC No.10346，商業(yè)機(jī)構(gòu)購買)的菌劑，按質(zhì)量比1:1混合即為混合菌劑2。

(2)原料處理：將高粱粉碎為6-8瓣后，加入溫水，煮料1.5-2h后，每100kg高粱加入62.5kg大曲粉混勻。

(3)酒精發(fā)酵：將上述原料放入酒缸(高約1.5m)，進(jìn)行稀醪酒精發(fā)酵，前4天敞口發(fā)酵，后8天封口發(fā)酵，共12天。發(fā)酵車間利用空調(diào)保持溫度為18℃，入缸初始溫度約20-25℃，發(fā)酵第二天溫度約26-28℃時，按上述的方法制備的混合菌劑1分1-3次添加，每次按照每公斤酒醪稱取1-10g的混合菌劑1，加入無菌水恒溫振蕩15min，進(jìn)行復(fù)水活化，添加菌劑與酒醪混合均勻。第3天最高溫度可達(dá)30℃。發(fā)酵終止酒精度約為8.9°(v/v)，酸度約1g/100mL。

(4)醋酸發(fā)酵：將酒醪中加入麩皮，混勻制成醋醅，每100kg高粱原料加50kg麩皮，初始酒度約4°(v/v)；將醋醅分裝至醋缸(高約0.5m)，混合菌劑2按食醋發(fā)酵過程中溫度的變化添加，在醋酸發(fā)酵起始溫度為28℃-30℃時可以添加，待醋酸發(fā)酵第2-3天后溫度上升約為38℃-40℃時也可以添加，總共分1-3次添加，每次按照每公斤醋醅稱取1-10g的混合菌劑2，加入無菌水恒溫振蕩15min，進(jìn)行復(fù)水活化，接入菌劑與翻醅進(jìn)行反復(fù)混勻。缸口上蓋草墊，每天翻醅一次(倒缸)。

此外，設(shè)置常規(guī)發(fā)酵的正常組作為對照，不添加本發(fā)明所述的混合菌劑。對比結(jié)果如表5所示。

表5不同發(fā)酵條件醋醅品溫變化

由表5可知，醋酸發(fā)酵品溫第3天溫度最高，約45℃，第5天乙醇基本耗盡，第5天溫度降至35℃，測定總酸比原來不加菌劑發(fā)酵周期提前了2天達(dá)到酸度約7.1g/100g醋醅。第6天，按高粱質(zhì)量的5％加入食鹽終止發(fā)酵(滅火)，防止醋酸過氧化(如醋酸發(fā)酵效果較好，溫度自然降低，則不用加鹽)。發(fā)酵結(jié)束酸度約7.16±0.22g/100g醋醅，與正常組相比酸度提高8.3％，乳酸含量3.0g/100g醋醅，提高了500mg/100g醋醅，相比正常提高約15％。

(5)淋醋：采用套淋工藝，每批醋醅套淋三次。將上一批淡醋液(第二次套淋液)混合后，加熱至沸騰，按1斤高粱9斤水的比例浸泡醋醅6-8h，自然控干，所得醋液進(jìn)行后續(xù)曬醋工藝，剩余醋醅進(jìn)行第二次淋醋，第二次淋醋所得淡醋液用于下批淋醋，以此類推。

(6)滅菌：97℃濕熱滅菌25分鐘。

(7)罐裝：將滅菌的食醋進(jìn)行裝罐，測得食醋產(chǎn)品活性多糖相對含量提高了63％。食醋產(chǎn)品用量0.2ml時，對DPPH·的清除率為60％。其半清除率(EC50)為8.5±0.02mg/ml(具體如表6所示)。

表6食醋產(chǎn)品對DPPH自由基清除率

以上對本發(fā)明的一個實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進(jìn)等，均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。