本發(fā)明涉及一種雙順反子表達(dá)載體，同時還涉及包含該表達(dá)載體的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、制備方法及應(yīng)用，屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
：。
背景技術(shù)：
：：生物制藥是21世紀(jì)的高科技產(chǎn)業(yè)，其中治療性重組蛋白的是生物制藥的一個重要部分，目前在全世界的年產(chǎn)值(包括重組抗體)突破1千多億美元。眾多周知，原核及低等真核生物缺乏復(fù)雜的翻譯后修飾功能，因此相關(guān)治療性重組蛋白需要在高等真核細(xì)胞中表達(dá)以具備活性，而這其中近70％采用中國倉鼠卵巢(Chinesehamsterovary，CHO)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。但是CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)也存在目的蛋白表達(dá)水平低、高產(chǎn)穩(wěn)定細(xì)胞篩選周期長、細(xì)胞培養(yǎng)成本高等缺陷，這嚴(yán)重制約著重組蛋白藥物的生產(chǎn)。而影響重組蛋白在CHO細(xì)胞中表達(dá)的因素眾多，表達(dá)載體就是其中一個重要因素。此外，在CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，高水平持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株往往難以得到，這是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的隨機(jī)整合，使有些轉(zhuǎn)基因發(fā)生沉默或者表達(dá)水平降低，因此需要從大量細(xì)胞克隆株中分離出穩(wěn)定高效表達(dá)的克隆細(xì)胞株，這也給基因工程產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)帶來了很大困擾(Astudyofmonoclonalantibody-producingCHOcelllines:whatmakesastablehighproducer？Biotechnol.Bioeng.2009)。核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列(matrixattachmentregion，MAR)是限制酶消化后仍附著在核基質(zhì)上的DNA序列，長度為300～3000bp，富含AT堿基對(＞60％)，以及幾個短的“共有序列”，如A-box(AATAAAYAAA)、T-box(TTWTWTTWTT)、DNA鏈解旋序列(AATATATTT或AATATT)、拓?fù)洚悩?gòu)酶II結(jié)合位點(diǎn)(GTNWAYATTNATNNR)等。研究表明，MAR序列能提高CHO表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平，同時降低轉(zhuǎn)化株轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平差異(Genome-widepredictionofmatrixattachmentregionsthatincreasegeneexpressioninmammaliancells.Nat.Methods.2007；PositionaleffectsofthematrixattachmentregionontransgeneexpressioninstablytransfectedCHOcells.CellBiol.Int.2010)。已有研究證明，MAR提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)與載體上的其他調(diào)控原件(regulatoryelements)有關(guān)，如MAR與不同啟動子組合對提高重組蛋白的表達(dá)水平不一等(ImpactofUsingDifferentPromotersandMatrixAttachmentRegionsonRecombinantProteinExpressionLevelandStabilityinStablyTransfectedCHOCells.MolBiotechnol.2014)。調(diào)控原件如選擇標(biāo)記(selectionmarker)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internalribosomeentrysite，IRES)等對轉(zhuǎn)基因的表達(dá)也有不同作用(ImprovedrecombinantproteinyieldusingacodondeoptimizedDHFRselectablemarkerinaCHEF1expressionplasmid.BiotechnolProg.2010；IRES-mediatedTricistronicvectorsforenhancinggenerationofhighmonoclonalantibodyexpressingCHOcelllines.JBiotechnol.2012)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種雙順反子表達(dá)載體，該載體能同時表達(dá)目的基因和標(biāo)記基因，提高陽性細(xì)胞克隆篩選率，同時載體上包含MAR序列，能克服轉(zhuǎn)基因沉默，提高目的蛋白表達(dá)水平，以及后續(xù)單克隆細(xì)胞株篩選的有效性。同時，本發(fā)明還提供一種雙順反子表達(dá)載體的制備方法。最后，本發(fā)明再提供一種包含上述表達(dá)載體的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、制備方法及應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：雙順反子表達(dá)載體，包含在啟動子上游和PolyA下游插入的核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列(matrixattachmentregion，MAR)，以及IRES序列(internalribosomeentrysite，內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列)和篩選標(biāo)記基因。通過在啟動子與IRES序列之間插入目的基因，可構(gòu)成目的基因-IRES序列-篩選標(biāo)記基因依次連接的雙順反子序列。表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)為：MAR-啟動子-目的基因-IRES序列-篩選標(biāo)記基因-PolyA-MAR。所述啟動子選自SV40、CMV、EF-1α、CAG等中的任意一種。優(yōu)選為CMV啟動子，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。所述核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列選自β-珠蛋白MAR序列(GenBank：L22754.1，第840～2998位堿基)、X-29序列(GenBank：EF694970.1，第1～3337位堿基)、β-干擾素MAR序列(GenBank：M83137.1，第1～2201位堿基)、MAR1-68(GenBank：EF694965.1，第1～3614位堿基)等中的任意一種。優(yōu)選為β-珠蛋白MAR序列。所述IRES序列選自Immunoglobulinheavychainbindingprotein(BIP)(NCBIReferenceSequence：NM_005347.4，第40～407位堿基)、Humanrhinovirus(HRV)(NCBIReferenceSequence：NC_001617.1，第1～621位堿基)、Apoptoticprotease-activatingfactor1(Apaf-1)(NCBIReferenceSequence：NM_013229.2，第1～580位堿基)等中的任意一種。優(yōu)選為HRVIRES序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。所述篩選標(biāo)記基因選自新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neomycinphosphotransferase，NPT)、博來霉素(zeocin/zeomycin)抗性基因等中的任意一種。優(yōu)選為NPT抗性弱化基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。優(yōu)選的，雙順反子表達(dá)載體具體采用CMV啟動子，核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列為β-珠蛋白MAR序列，IRES序列為HRVIRES序列，篩選標(biāo)記基因?yàn)镹PT抗性弱化基因。雙順反子表達(dá)載體可采用常規(guī)方法制備。以上優(yōu)選基因序列的表達(dá)載體的制備，具體包括以下步驟：1)分別采用NsiI和XmaI酶雙酶切SEQIDNO:4所示序列和pIRES-Neo載體，回收酶切片段，連接、轉(zhuǎn)化后鑒定，得到pIRES-C1載體；2)分別采用XmaI和XbaI酶雙酶切SEQIDNO:5所示序列和pIRES-C1載體，回收酶切片段，連接、轉(zhuǎn)化后鑒定，得到pIRES-C2載體；3)分別在pIRES-C2載體上CMV啟動子的NruI、MluI酶切位點(diǎn)之間以及polyA下游的XhoI、BstZ17I酶切位點(diǎn)之間插入β-珠蛋白MAR序列，即得。真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，包含上述雙順反子表達(dá)載體。真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的制備，包括以下步驟：1)將目的基因插入雙順反子表達(dá)載體的啟動子與IRES序列之間，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體；2)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞，經(jīng)篩選得到表達(dá)系統(tǒng)。步驟2)中宿主細(xì)胞選自DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S等中的任意一種。優(yōu)選為CHO-S細(xì)胞。步驟2)中轉(zhuǎn)染的方法包括磷酸鈣法、電轉(zhuǎn)法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等，優(yōu)選為電轉(zhuǎn)法。上述雙順反子表達(dá)載體、真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在制備包含目的蛋白的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明中雙順反子表達(dá)載體包含核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列、內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列和篩選標(biāo)記基因，通過在啟動子與IRES序列之間插入目的基因，可構(gòu)成目的基因-IRES序列-篩選標(biāo)記基因依次連接的雙順反子序列。表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)為：MAR-啟動子-目的基因-IRES序列-篩選標(biāo)記基因-PolyA-MAR。該載體利用一個啟動子實(shí)現(xiàn)目的基因和篩選標(biāo)記的同時表達(dá)，可減少由于不同表達(dá)框存在導(dǎo)致的假陽性細(xì)胞克隆，提高陽性細(xì)胞克隆篩選率，并克服傳統(tǒng)載體目的基因與篩選標(biāo)記基因表達(dá)不均衡的問題。同時載體上包含MAR序列，能克服轉(zhuǎn)基因沉默，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因在宿主細(xì)胞中的高效、長期表達(dá)。采用優(yōu)化序列構(gòu)建的雙順反子表達(dá)載體可顯著弱化下游篩選標(biāo)記的表達(dá)，更易于獲得高表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞克隆，同時提高后續(xù)單克隆細(xì)胞株篩選的有效性。附圖說明圖1為實(shí)施例1中pIRES-Neo載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為pIRES-C1載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為pIRES-C2載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4為pIRES-C3載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖5為EPO在CHO-S細(xì)胞中的表達(dá)水平；圖6為EPO在不同載體下篩選的單細(xì)胞克隆的表達(dá)水平比較；圖7為EPO在不同載體下的平均表達(dá)水平比較；圖8為EPO在不同載體下的陽性克隆率比較。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例僅對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。除所列舉的實(shí)施例外，還可以有其他的實(shí)施方式，但是凡采用等同替換或等效變換獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1雙順反子表達(dá)載體的構(gòu)建，具體步驟如下：1、pIRES-C1載體的構(gòu)建(替換pIRES-Neo載體上的IRES序列)1)合成IRES序列設(shè)計(jì)并人工合成IRES序列(如SEQIDNO:4所示)，具體交由通用生物基因(安徽)有限公司完成。為便于克隆及保證序列完整性，合成IRES序列時，5'端引入AGCATGCATCTAGGGCGGCCA序列，其中AGC為保護(hù)堿基，ATGCAT為NsiI酶切位點(diǎn)，CTAGGGCGGCCA序列為載體pIRES-Neo上的部分序列(GenBank：U89673.1，第1283～1294位堿基)；3′端引入CCCCGGGATA(Genbank：U89673.1，第1885～1894位堿基)，其中ATA為酶切保護(hù)堿基，CCCGGG為XmaI酶切位點(diǎn)。2)構(gòu)建pIRES-C1載體用NsiI/XmaI雙酶切合成的IRES序列，同時用NsiI/XmaI雙酶切pIRES-Neo質(zhì)粒DNA(pIRES-Neo質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖見圖1)。瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果，凝膠回收酶切后的IRES序列片段和pIRES-Neo線性質(zhì)粒DNA。合成IRES序列的雙酶切體系為：合成IRES序列10μL(1μg/μL)，10×NEBuffer2.13μL，NsiI/XmaI(10U/μL)各1.0μL，補(bǔ)足水至30μL，酶切條件為：37℃，酶切3min。pIRES-Neo質(zhì)粒的雙酶切體系為：pIRES-Neo質(zhì)粒5μL(1μg/μL)，10×NEBuffer2.12μL，NsiI/I/XmaI(10U/μL)各0.5μL，補(bǔ)足水至20μL；酶切條件為：37℃，酶切3min。取酶切后的IRES序列片段和pIRES-Neo線性質(zhì)粒DNA(摩爾比5:1)，使用NEB公司TM的連接試劑盒，25℃連接5min。將連接產(chǎn)物加入到E.coliJM109菌株感受態(tài)細(xì)胞懸液中轉(zhuǎn)化，取150μL轉(zhuǎn)化菌液接種到含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落繼代培養(yǎng)。提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(NsiI/I/XmaI)驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證，構(gòu)建正確的質(zhì)粒命名為pIRES-C1(結(jié)構(gòu)示意圖見圖2)。2、pIRES-C2載體的構(gòu)建(替換pIRES-C1載體上的篩選標(biāo)記為NPT抗性弱化基因)1)合成NPT抗性弱化基因設(shè)計(jì)并人工合成NPT抗性弱化基因(如SEQIDNO:5所示)，具體交由通用生物基因(安徽)有限公司完成。為便于克隆及保證序列完整性，合成NPT抗性弱化基因時，5′端引入AACCCCGGGATAATTCCTGCAGCCAAT序列，其中AAC為保護(hù)堿基，CCCGGG為XmaI酶切位點(diǎn)，ATAATTCCTGCAGCCAAT為載體pIRES-Neo上的部分序列(GenBank：U89673.1，第1892～1909位堿基)；3′端引入GGGGATCAATTCTCTAGAGCT序列，其中GCT為保護(hù)堿基，TCTAGA為XbaI酶切位點(diǎn)，GGGGATCAATTC為載體pIRES-Neo上的部分序列(GenBank：U89673.1，第2714～2725位堿基)。2)構(gòu)建pIRES-C2載體用XmaI/XbaI雙酶切合成的NPT抗性弱化基因，同時用XmaI/XbaI雙酶切pIRES-C1質(zhì)粒DNA，再用NEB公司TM的連接試劑盒25℃連接5min，酶切、連接的體系及條件基本同步驟1)。將連接產(chǎn)物加入到E.coliJM109菌株感受態(tài)細(xì)胞懸液中轉(zhuǎn)化，取150μL轉(zhuǎn)化菌液接種到含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落繼代培養(yǎng)。提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切(XmaI/XbaI)驗(yàn)證，取酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證，構(gòu)建正確的質(zhì)粒命名為pIRES-C2(結(jié)構(gòu)示意圖見圖3)。3、pIRES-C3載體的構(gòu)建(在pIRES-C2載體的啟動子CMV的上游及polyA的下游插入β-珠蛋白MAR序列)1)合成β-珠蛋白MAR序列根據(jù)β-珠蛋白MAR序列(GenBank：L22754.1，第840～2998位)設(shè)計(jì)引物P1、P2、P3、P4。在引物P1、P2的5′端分別引入NruI、MluI酶切位點(diǎn)，P3、P4的5′端分別引入XhoI、BstZ17I酶切位點(diǎn)，引物序列如下(下劃線為酶切位點(diǎn))：P1：5′-GTCTCGCGAAATATATCTCCTGATAAAATGTCTA-3′；P2：5′-AGCACGCGTGGATCCTCCCATTTCGGCCTCCTG-3′；P3：5′-GTCCTCGAGAATATATCTCCTGATAAAATGTCTA-3′；P4：5′-GTCGTATACGGATCCTCCCATTTCGGCCTCCTG-3′。提取人外周血基因組DNA作為模板，分別用引物P1/P2、P3/P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系見下表1。表1PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃3min，94℃40s，58℃30s，72℃40s，每個退火溫度4個循環(huán)，最后55℃，30個循環(huán)，72℃3min。瓊脂糖凝膠電泳回收擴(kuò)增產(chǎn)物，送生物公司測序驗(yàn)證。結(jié)果表明，兩個體系擴(kuò)增出的DNA片段均與GenBank登錄的β-珠蛋白MAR序列一致。2)構(gòu)建啟動子CMV上游含β-珠蛋白MAR序列的表達(dá)載體用NruI/MluI雙酶切引物P1/P2擴(kuò)增出的β-珠蛋白MAR序列，同時用NruI/MluI雙酶切pIRES-C2質(zhì)粒DNA。瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果，凝膠回收酶切后的β-珠蛋白MAR序列片段和pIRES-C2線性質(zhì)粒DNA。β-珠蛋白MAR序列的雙酶切體系為：β-珠蛋白MAR序列10μL(1μg/μL)，10×NEBuffer3.13μL，NruI/MluI(10U/μL)各1.0μL，補(bǔ)足水至30μL；酶切條件為：37℃，酶切3min。pIRES-C2質(zhì)粒的雙酶切體系為：pIRES-C2質(zhì)粒5μL(1μg/μL)，10×NEBuffer3.12μL，NruI/MluI(10U/μL)各0.5μL，補(bǔ)足水至20μL；酶切條件為：37℃，酶切3min。取酶切后的β-珠蛋白MAR序列片段和pIRES-C2線性質(zhì)粒DNA(摩爾比5:1)，使用NEB公司TM的連接試劑盒，25℃連接5min。將連接產(chǎn)物加入到E.coliJM109菌株感受態(tài)細(xì)胞懸液中轉(zhuǎn)化，取150μL轉(zhuǎn)化菌液接種到含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落繼代培養(yǎng)。提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切(NruI/MluI)驗(yàn)證，取酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證，構(gòu)建正確的質(zhì)粒命名為pIRES-C3M。3)構(gòu)建啟動子CMV上游及polyA下游均含β-珠蛋白MAR序列的表達(dá)載體用XhoI/BstZ17I雙酶切P3/P4擴(kuò)增出的β-珠蛋白MAR序列，同時用XhoI/BstZ17I雙酶切pIRES-C3M質(zhì)粒DNA。瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果，凝膠回收酶切后的β-珠蛋白MAR序列片段和pIRES-C3M線性質(zhì)粒DNA。使用NEB公司TM的連接試劑盒，25℃連接5min。將連接產(chǎn)物加入到E.coliJM109菌株感受態(tài)細(xì)胞懸液中轉(zhuǎn)化，取150μL轉(zhuǎn)化菌液接種到含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落繼代培養(yǎng)。提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切(XhoI/BstZ17I)驗(yàn)證，取酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證，構(gòu)建正確的質(zhì)粒命名為pIRES-C3(結(jié)構(gòu)示意圖見圖4)。實(shí)施例2真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建，具體步驟如下：1、構(gòu)建含EPO外源基因的雙順反子表達(dá)載體1)合成EPO序列根據(jù)NCBI公布的EPO序列(GenBank：JN849371.1，第1～582位堿基)，人工合成EPO序列(5′端和3′端分別引入EcoRI、BamHI酶切位點(diǎn))，具體交由通用生物基因(安徽)有限公司完成。2)構(gòu)建含EPO序列的雙順反子表達(dá)載體用EcoRI/BamHI雙酶切引物人工合成的EOP序列，同時用EcoRI/BamHI雙酶切pIRES-C3質(zhì)粒DNA。瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果，凝膠回收酶切后的EPO序列片段和pIRES-C3線性質(zhì)粒DNA。EPO序列的雙酶切體系為：EPO序列片段10μL(1μg/μL)，10×NEBuffer2.13μL，EcoRI/BamHI酶(10U/μL)各1.0μL，補(bǔ)足水至30μL；酶切條件為：37℃，酶切3min。pIRES-C3質(zhì)粒的雙酶切體系為：：pIRES-C3質(zhì)粒5μL(1μg/μL)，10×NEBuffer2.12μL，EcoRI/BamHI(10U/μL)各0.5μL，補(bǔ)足水至20μL；酶切條件為：37℃，酶切3min。取酶切后的EPO序列片段和pIRES-C3線性質(zhì)粒DNA(摩爾比5:1)，使用NEB公司TM的連接試劑盒，25℃連接5min。將連接產(chǎn)物加入到E.coliJM109菌株感受態(tài)細(xì)胞懸液中轉(zhuǎn)化，取150μL轉(zhuǎn)化菌液接種到含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落繼代培養(yǎng)。提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切(EcoRI/BamHI)驗(yàn)證，取酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證，構(gòu)建正確的質(zhì)粒命名為pIRES-C3-EPO。2、構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)選擇生長狀態(tài)良好的CHO-S細(xì)胞接種到6孔培養(yǎng)板上，待鋪板密度達(dá)到約80％進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體操作步驟如下：10μLlipofectamine2000+240μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基，在37℃孵箱中靜置5min，將無血清Opti-MEM培養(yǎng)基與250μL(5μg)表達(dá)載體pIRES-C3-EPO混合，37℃孵箱中靜置20min；同時用PBS將6孔培養(yǎng)板上的細(xì)胞清洗三遍，加入2mL無血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基；然后將脂質(zhì)體與含pIRES-C3-EPO質(zhì)粒DNA的混合液逐滴輕滴入孔中，盡快輕輕搖晃培養(yǎng)平板使其混勻；放入5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)6h后，將無血清DMEM培養(yǎng)基更換成DMEM完全培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。48h后在轉(zhuǎn)染孔中加入600μg/mL的G418藥物，每48h換成新鮮D/F完整培養(yǎng)基，從第五天開始細(xì)胞大量死亡。篩選兩周后將G418濃度調(diào)整到維持濃度300μg/mL繼續(xù)培養(yǎng)。藥物篩選完成后，對細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法單克隆化操作。約兩個星期單克隆細(xì)胞在孔中長至80％，一天后取細(xì)胞上清做ELISA檢測，檢測結(jié)果見圖5。由圖5可知，挑選的10個克隆中，2#和6#克隆的產(chǎn)率最佳，分別為123.2mg/L和136.3mg/L。試驗(yàn)例參照實(shí)施例2中方法構(gòu)建含EPO外源基因的pIRES-Neo-EPO表達(dá)載體，經(jīng)同一操作后獲得數(shù)量近似的單克隆細(xì)胞株，對陽性單克隆群進(jìn)行ELISA檢測，并比較克隆株的表達(dá)量，各自篩選得到十個穩(wěn)定細(xì)胞株，對10株細(xì)胞的EPO表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，利用本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)的EPO表達(dá)水平明顯高于傳統(tǒng)的表達(dá)系統(tǒng)，pIRES-C3-EPO表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的CHO-S細(xì)胞的EPO表達(dá)量平均為105.12mg/L，而傳統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)的EPO表達(dá)量僅為29.35mg/L(見圖6和圖7)。此外，本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)的陽性克隆率為71.74％，而傳統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)的陽性克隆率為13.7％，即假陽性率顯著低于傳統(tǒng)的表達(dá)系統(tǒng)(P＜0.05)(見圖8)。實(shí)施例及試驗(yàn)例中所用大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109、pIRES-Neo質(zhì)粒載體、細(xì)胞系試劑、工具酶等均為市售商品。內(nèi)切酶及NEBuffer均購自美國NewEnglandBiolabsLTD(NEB)，pIRES-Neo質(zhì)粒載體購自Clontech生物公司。<110>新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院<120>雙順反子表達(dá)載體、表達(dá)系統(tǒng)、制備方法及應(yīng)用<170>PatentInversion3.5<211>599<212>DNA<213>序列<221>CMV啟動子<222>(1)..(599)<400>1agatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtca60ttagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcct120ggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagta180acgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccac240ttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggt300aaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcag360tacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaat420gggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaat480gggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgcc540ccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctct599<211>621<212>DNA<213>序列<221>HRVIRES序列<222>(1)..(621)<400>2ttaaaactgggagtgggttgttcccactcactccacccatgcggtgttgtactctgttat60tacggtaactttgtacgccagtttttcccacccttccccataatgtaacttagaagtttg120tacaatatgaccaataggtgacaatcatccagactgtcaaaggtcaagcacttctgtttc180cccggtcaatgaggatatgctttacccaaggcaaaaaccttagagatcgttatccccaca240ctgcctacacagagcccagtaccatttttgatataattgggttggtcgctccctgcaaac300ccagcagtagacctggcagatgaggctggacattccccactggcgacagtggtccagcct360gcgtggctgcctgctcacccttcttgggtgagaagcctaattattgacaaggtgtgaaga420gccgcgtgtgctcagtgtgcttcctccggcccctgaatgtggctaaccttaaccctgcag480ccgttgcccataatccaatgggtttgcggtcgtaatgcgtaagtgcgggatgggaccaac540tactttgggtgtccgtgtttcctgtttttcttttgattgcattttatggtgacaatttat600agtgtatagattgtcatcatg621<211>795<212>DNA<213>序列<221>NPT抗性弱化基因<222>(1)..(795)<400>3atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattc60ggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtca120gcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactg180caggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtg240ctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcag300gatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg360cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgc420atcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaa480gagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgac540ggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaat600ggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggac660atagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttc720ctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttctt780AACgagttcttctga795<211>652<212>DNA<213>序列<221>合成IRES序列<222>(1)..(652)<400>4agcatgcatctagggcggccattaaaactgggagtgggttgttcccactcactccaccca60tgcggtgttgtactctgttattacggtaactttgtacgccagtttttcccacccttcccc120ataatgtaacttagaagtttgtacaatatgaccaataggtgacaatcatccagactgtca180aaggtcaagcacttctgtttccccggtcaatgaggatatgctttacccaaggcaaaaacc240ttagagatcgttatccccacactgcctacacagagcccagtaccatttttgatataattg300ggttggtcgctccctgcaaacccagcagtagacctggcagatgaggctggacattcccca360ctggcgacagtggtccagcctgcgtggctgcctgctcacccttcttgggtgagaagccta420attattgacaaggtgtgaagagccgcgtgtgctcagtgtgcttcctccggcccctgaatg480tggctaaccttaaccctgcagccgttgcccataatccaatgggtttgcggtcgtaatgcg540taagtgcgggatgggaccaactactttgggtgtccgtgtttcctgtttttcttttgattg600cattttatggtgacaatttatagtgtatagattgtcatcatgccccgggata652<211>843<212>DNA<213>序列<221>合成NPT抗性弱化基因<222>(1)..(843)<400>5aaccccgggataattcctgcagccaatatgattgaacaagatggattgcacgcaggttct60ccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgc120tctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagacc180gacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggcc240acgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactgg300ctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgag360aaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc420ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggt480cttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttc540gccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcc600tgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccgg660ctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagag720cttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcg780cagcgcatcgccttctatcgccttcttAACgagttcttctgaggggatcaattctctaga840gct843<211>34<212>DNA<213>序列<221>引物P1<222>(1)..(34)<400>6GTCTCGCGAaatatatctcctgataaaatgtcta34<211>33<212>DNA<213>序列<221>引物P2<222>(1)..(33)<400>7AGCACGCGTGGATCCTCCCATTTCGGCCTCCTG33<211>34<212>DNA<213>序列<221>引物P3<222>(1)..(34)<400>8GTCCTCGAGAATATATCTCCTGATAAAATGTCTA34<211>33<212>DNA<213>序列<221>引物P3<222>(1)..(33)<400>9GTCGTATACGGATCCTCCCATTTCGGCCTCCTG33當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3