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雙順反子表達載體、表達系統(tǒng)、制備方法及應用與流程

文檔序號:12097557閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.雙順反子表達載體,其特征在于:該載體包含在啟動子上游和Poly A下游插入的核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列以及IRES序列和篩選標記基因,其結(jié)構(gòu)為:MAR-啟動子-目的基因-IRES序列-篩選標記基因-Poly A-MAR。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達載體,其特征在于:所述啟動子選自SV40、CMV、EF-1α、CAG中的任意一種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達載體,其特征在于:所述核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列選自β-珠蛋白MAR序列、X-29序列、β-干擾素MAR序列、MAR 1-68中的任意一種;

所述β-珠蛋白MAR序列為GenBank:L22754.1,第840~2998位堿基;

所述X-29序列為GenBank:EF694970.1,第1~3337位堿基;

所述β-干擾素MAR序列為GenBank:M83137.1,第1~2201位堿基;

所述MAR 1-68為GenBank:EF694965.1,第1~3614位堿基。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達載體,其特征在于:所述IRES序列選自BIP IRES序列、HRV IRES序列、Apaf-1IRES序列中的任意一種;

所述BIP IRES序列為NCBI Reference Sequence:NM_005347.4,第40~407位堿基;

所述HRV IRES序列為NCBI Reference Sequence:NC_001617.1,第1~621位堿基;

所述Apaf-1IRES序列為NCBI Reference Sequence:NM_013229.2,第1~580位堿基。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達載體,其特征在于:所述篩選標記基因選自NPT或博來霉素抗性基因。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達載體,其特征在于:所述載體采用采用CMV啟動子,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列為β-珠蛋白MAR序列;IRES序列為HRV IRES序列,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;篩選標記基因為NPT抗性弱化基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

7.如權(quán)利要求6所述表達載體的制備方法,其特征在于:包括以下步驟:

1)分別采用NsiI和XmaI酶雙酶切SEQ ID NO:4所示序列和pIRES-Neo載體,回收酶切片段,連接、轉(zhuǎn)化后鑒定,得到pIRES-C1載體;

2)分別采用XmaI和XbaI酶雙酶切SEQ ID NO:5所示序列和pIRES-C1載體,回收酶切片段,連接、轉(zhuǎn)化后鑒定,得到pIRES-C2載體;

3)分別在pIRES-C2載體上CMV啟動子的NruI、MluI酶切位點之間以及poly A下游的XhoI、BstZ17I酶切位點之間插入β-珠蛋白MAR序列,即得。

8.包含如權(quán)利要求1~6中任一項所述表達載體的真核細胞表達系統(tǒng)。

9.如權(quán)利要求8所述表達系統(tǒng)的制備方法,其特征在于:包括以下步驟:

1)將目的基因插入表達載體的啟動子與IRES序列之間,構(gòu)建得到重組表達載體;

2)將重組表達載體轉(zhuǎn)染進入宿主細胞,經(jīng)篩選得到表達系統(tǒng)。

10.如權(quán)利要求1~6中任一項所述表達載體、權(quán)利要求8所述表達系統(tǒng)在制備包含目的蛋白的藥物中的應用。

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