本發(fā)明涉及一種細(xì)菌檢測方法，具體是一種食品中腸炎沙門氏菌的檢測方法。
背景技術(shù)：
沙門氏菌為腸桿菌科沙門氏菌屬，據(jù)其抗原結(jié)構(gòu)和生化試驗，目前已有2000余種血清型，其中以鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌較為多見。該菌為革蘭氏陰性桿菌，需氧，不產(chǎn)生芽胞，無莢膜，絕大多數(shù)有鞭毛，能運動。對外界的抵抗力較強，在水和土壤中能活數(shù)月，糞便中能活1～2個月，在冰凍土壤中能越冬。不耐熱，55℃、1h或60℃、10～20分鐘死亡，5%石炭酸或1：500升汞5分鐘內(nèi)即可將其殺滅。多種家畜（豬、牛、馬、羊）、家禽（雞、鴨、鵝）、魚類、飛鳥、鼠類及野生動物的腸腔及內(nèi)臟中能查到此類細(xì)菌。細(xì)菌由糞便排出，污染飲水、食物、餐具以及新鮮蛋品、冰蛋、蛋粉等，人進食后造成感染。致病食物以肉、血、內(nèi)臟及蛋類為主，值得注意的是該類細(xì)菌在食品中繁殖后，并不影響食物的色、香、味。沙門氏菌屬有的專對人類致病，有的只對動物致病，也有對人和動物都致病。沙門氏菌病是指由各種類型沙門氏菌所引起的對人類、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱。感染沙門氏菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發(fā)生食物中毒。據(jù)統(tǒng)計在世界各國的種類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。我國內(nèi)陸地區(qū)也以沙門氏菌為首位。由沙門氏菌引起的食源性疾病的全球公共健康問題。在歐洲ISO6579:2002和FSISMLG4.04中；檢測沙門氏菌是評估產(chǎn)品是否合格的必檢項目。在美國，通常是肉，禽，蛋產(chǎn)品中檢測出沙門氏菌。
由沙門氏菌引起了食源性疾病的全球公共健康問題。沙門氏菌是最常見的，新鮮家禽和豬的肉陽性標(biāo)本的比例，根據(jù)歐洲標(biāo)準(zhǔn)（歐盟委員會法規(guī)2073/2005）用于評價產(chǎn)品是否符合標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)分別檢測平均為5.5％和1.1％。此外，美國食品安全檢驗局采用FSIS的方法，檢測沙門氏菌。這兩個標(biāo)準(zhǔn)的用于檢測沙門氏菌培養(yǎng)方法（SCMS）需要長達5天，才能獲得結(jié)果。這些方法包括預(yù)培養(yǎng)，在選擇性瓊脂上選擇性分離，可疑菌落的生化鑒定和血清學(xué)確認(rèn)。該方法是雖然準(zhǔn)確，但費力，成本高，費時，且對短保質(zhì)期的產(chǎn)品無法檢測。目前，檢測沙門氏菌的方法檢測時間長，費用較高，不利于在基層單位推廣使用。因此，需要有新的方法能夠在一個短的時間內(nèi)檢測，最好能在24小時之內(nèi)，在一個給定的食物量中檢測食品中的病原體。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)構(gòu)簡單、使用方便的食品中腸炎沙門氏菌的檢測方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種食品中腸炎沙門氏菌的檢測方法，采用恒溫擴增方法，以腸炎沙門氏菌clpP基因特異序列為靶序列，SYBER Green I為熒光染料，隨后進行熒光定量檢測分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預(yù)處理：
在無菌環(huán)境下，將食品加入到BPW緩沖蛋白胨水中，培養(yǎng)溫度為32-34℃，培養(yǎng)時間為22-24h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復(fù)使用生理鹽水進行清洗，隨后提取基因組DNA和RNA；
（2）構(gòu)建恒溫擴增反應(yīng)體系：
DNA模板 2μL，SYBER Green I熒光染料 0.5μL，10×Buffer 3.0μL，DNA聚合酶 7U，氯化銨溶液 0.5μL，氯化鋁溶液0.5μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，碳酸酐酶 2U，脫氧肌苷溶液 2μL，其余用dd H2O補足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.7-1.9；
所述SYBER Green I熒光染料為90-110倍稀釋；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、蔗糖；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述氯化銨溶液的濃度為5-10mmol/L；
所述氯化鋁溶液的濃度為100-200mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.7-1.9；
所述脫氧肌酐溶液的濃度為30-40mmol/L；
（3）熒光定量反應(yīng)：
將恒溫擴增反應(yīng)體系加入到熒光定量機中，隨后進行擴增，95℃變性5min，90-94℃變性0.5-1.0min；60℃退火30s；70℃延伸1.0min；30個循環(huán)，最后72℃延伸5min；
（4）檢測分析：
根據(jù)熒光定量分析軟件進行定量分析，結(jié)果統(tǒng)計。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（1）中培養(yǎng)溫度為33℃，培養(yǎng)時間為23h。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（2）中所述DNA模板的OD260/OD280值為1.8。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（2）中所述SYBER Green I熒光染料為100倍稀釋。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（2）中所述氯化銨溶液的濃度為8mmol/L。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（2）中所述氯化鋁溶液的濃度為150mmol/L。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（2）中所述DNA引物的OD260/OD280值為1.8。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（2）中所述脫氧肌酐溶液的濃度為35mmol/L。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（3）中92℃變性0.8min。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明的檢測方法能準(zhǔn)確靈敏地檢測食品中的沙門氏菌，DNA最低檢測濃度為5ng，而且與其他細(xì)菌無交叉反應(yīng)，特異性好，同時樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成本低于傳統(tǒng)的檢測方法，而且本發(fā)明試劑保存時間長，無污染。本發(fā)明對解決大批量樣品的沙門氏菌的現(xiàn)場檢測技術(shù)具有重要的現(xiàn)實意義。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施方式對本專利的技術(shù)方案作進一步詳細(xì)地說明。
實施例1
一種食品中腸炎沙門氏菌的檢測方法，采用恒溫擴增方法，以腸炎沙門氏菌clpP基因特異序列為靶序列，SYBER Green I為熒光染料，隨后進行熒光定量檢測分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預(yù)處理：
在無菌環(huán)境下，將食品加入到BPW緩沖蛋白胨水中，培養(yǎng)溫度為32℃，培養(yǎng)時間為22h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復(fù)使用生理鹽水進行清洗，隨后提取基因組DNA和RNA；
（2）構(gòu)建恒溫擴增反應(yīng)體系：
DNA模板 2μL，SYBER Green I熒光染料 0.5μL，10×Buffer 3.0μL，DNA聚合酶 7U，氯化銨溶液 0.5μL，氯化鋁溶液0.5μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，碳酸酐酶 2U，脫氧肌苷溶液 2μL，其余用dd H2O補足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.7；
所述SYBER Green I熒光染料為90倍稀釋；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、蔗糖；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述氯化銨溶液的濃度為5mmol/L；
所述氯化鋁溶液的濃度為100mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.7；
所述脫氧肌酐溶液的濃度為30mmol/L；
（3）熒光定量反應(yīng)：
將恒溫擴增反應(yīng)體系加入到熒光定量機中，隨后進行擴增，95℃變性5min，90℃變性0.5min；60℃退火30s；70℃延伸1.0min；30個循環(huán)，最后72℃延伸5min；
（4）檢測分析：
根據(jù)熒光定量分析軟件進行定量分析，結(jié)果統(tǒng)計。
實施例2
一種食品中腸炎沙門氏菌的檢測方法，采用恒溫擴增方法，以腸炎沙門氏菌clpP基因特異序列為靶序列，SYBER Green I為熒光染料，隨后進行熒光定量檢測分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預(yù)處理：
在無菌環(huán)境下，將食品加入到BPW緩沖蛋白胨水中，培養(yǎng)溫度為32℃，培養(yǎng)時間為22h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復(fù)使用生理鹽水進行清洗，隨后提取基因組DNA和RNA；
（2）構(gòu)建恒溫擴增反應(yīng)體系：
DNA模板 2μL，SYBER Green I熒光染料 0.5μL，10×Buffer 3.0μL，DNA聚合酶 7U，氯化銨溶液 0.5μL，氯化鋁溶液0.5μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，碳酸酐酶 2U，脫氧肌苷溶液 2μL，其余用dd H2O補足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.7；
所述SYBER Green I熒光染料為95倍稀釋；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、蔗糖；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述氯化銨溶液的濃度為6mmol/L；
所述氯化鋁溶液的濃度為127mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.7；
所述脫氧肌酐溶液的濃度為33mmol/L；
（3）熒光定量反應(yīng)：
將恒溫擴增反應(yīng)體系加入到熒光定量機中，隨后進行擴增，95℃變性5min，91℃變性0.6min；60℃退火30s；70℃延伸1.0min；30個循環(huán)，最后72℃延伸5min；
（4）檢測分析：
根據(jù)熒光定量分析軟件進行定量分析，結(jié)果統(tǒng)計。
實施例3
一種食品中腸炎沙門氏菌的檢測方法，采用恒溫擴增方法，以腸炎沙門氏菌clpP基因特異序列為靶序列，SYBER Green I為熒光染料，隨后進行熒光定量檢測分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預(yù)處理：
在無菌環(huán)境下，將食品加入到BPW緩沖蛋白胨水中，培養(yǎng)溫度為33℃，培養(yǎng)時間為23h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復(fù)使用生理鹽水進行清洗，隨后提取基因組DNA和RNA；
（2）構(gòu)建恒溫擴增反應(yīng)體系：
DNA模板 2μL，SYBER Green I熒光染料 0.5μL，10×Buffer 3.0μL，DNA聚合酶 7U，氯化銨溶液 0.5μL，氯化鋁溶液0.5μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，碳酸酐酶 2U，脫氧肌苷溶液 2μL，其余用dd H2O補足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.8；
所述SYBER Green I熒光染料為100倍稀釋；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、蔗糖；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述氯化銨溶液的濃度為8mmol/L；
所述氯化鋁溶液的濃度為150mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.8；
所述脫氧肌酐溶液的濃度為35mmol/L；
（3）熒光定量反應(yīng)：
將恒溫擴增反應(yīng)體系加入到熒光定量機中，隨后進行擴增，95℃變性5min，92℃變性0.8min；60℃退火30s；70℃延伸1.0min；30個循環(huán)，最后72℃延伸5min；
（4）檢測分析：
根據(jù)熒光定量分析軟件進行定量分析，結(jié)果統(tǒng)計。
實施例4
一種食品中腸炎沙門氏菌的檢測方法，采用恒溫擴增方法，以腸炎沙門氏菌clpP基因特異序列為靶序列，SYBER Green I為熒光染料，隨后進行熒光定量檢測分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預(yù)處理：
在無菌環(huán)境下，將食品加入到BPW緩沖蛋白胨水中，培養(yǎng)溫度為34℃，培養(yǎng)時間為24h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復(fù)使用生理鹽水進行清洗，隨后提取基因組DNA和RNA；
（2）構(gòu)建恒溫擴增反應(yīng)體系：
DNA模板 2μL，SYBER Green I熒光染料 0.5μL，10×Buffer 3.0μL，DNA聚合酶 7U，氯化銨溶液 0.5μL，氯化鋁溶液0.5μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，碳酸酐酶 2U，脫氧肌苷溶液 2μL，其余用dd H2O補足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.9；
所述SYBER Green I熒光染料為105倍稀釋；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、蔗糖；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述氯化銨溶液的濃度為9mmol/L；
所述氯化鋁溶液的濃度為187mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.9；
所述脫氧肌酐溶液的濃度為38mmol/L；
（3）熒光定量反應(yīng)：
將恒溫擴增反應(yīng)體系加入到熒光定量機中，隨后進行擴增，95℃變性5min，93℃變性1.0min；60℃退火30s；70℃延伸1.0min；30個循環(huán)，最后72℃延伸5min；
（4）檢測分析：
根據(jù)熒光定量分析軟件進行定量分析，結(jié)果統(tǒng)計。
實施例5
一種食品中腸炎沙門氏菌的檢測方法，采用恒溫擴增方法，以腸炎沙門氏菌clpP基因特異序列為靶序列，SYBER Green I為熒光染料，隨后進行熒光定量檢測分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預(yù)處理：
在無菌環(huán)境下，將食品加入到BPW緩沖蛋白胨水中，培養(yǎng)溫度為34℃，培養(yǎng)時間為24h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復(fù)使用生理鹽水進行清洗，隨后提取基因組DNA和RNA；
（2）構(gòu)建恒溫擴增反應(yīng)體系：
DNA模板 2μL，SYBER Green I熒光染料 0.5μL，10×Buffer 3.0μL，DNA聚合酶 7U，氯化銨溶液 0.5μL，氯化鋁溶液0.5μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，碳酸酐酶 2U，脫氧肌苷溶液 2μL，其余用dd H2O補足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.7-1.9；
所述SYBER Green I熒光染料為110倍稀釋；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、蔗糖；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述氯化銨溶液的濃度為10mmol/L；
所述氯化鋁溶液的濃度為200mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.9；
所述脫氧肌酐溶液的濃度為40mmol/L；
（3）熒光定量反應(yīng)：
將恒溫擴增反應(yīng)體系加入到熒光定量機中，隨后進行擴增，95℃變性5min，94℃變性1.0min；60℃退火30s；70℃延伸1.0min；30個循環(huán)，最后72℃延伸5min；
（4）檢測分析：
根據(jù)熒光定量分析軟件進行定量分析，結(jié)果統(tǒng)計。
上面對本專利的較佳實施方式作了詳細(xì)說明，但是本專利并不限于上述實施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下作出各種變化。