本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種篩選高二羥基兒茶素茶樹的類黃酮3′,5′-羥化酶基因功能標記及其應(yīng)用、應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
：兒茶素類（catechins）是茶樹茶類黃酮（flavonoids）的主體成分，占綠茶干重的8-26%(Chen&Zhou,2005)，成茶的幾乎所有特性如滋味、湯色和香氣等都直接或間接與兒茶素有關(guān)（Wangetal.,2000）。兒茶素具有抗氧化、抗誘變、抗癌、抗心血管疾病、紫外線輻射保護作用、抗糖尿病、抗菌消炎、減肥和帕金森病的治療等作用（夏濤和高麗萍,2009），屬于黃烷-3-醇類化合。兒茶素是2-苯基苯并吡喃的衍生物，根據(jù)兒茶素B環(huán)的羥基數(shù)目、C環(huán)上2,3位同分異構(gòu)體、C環(huán)上3位是否連接沒食子酸等可以劃分為若干種組分。根據(jù)兒茶素B環(huán)的羥基數(shù)目，兒茶素主要可以分為B環(huán)雙羥基和三羥基兒茶素，其中表兒茶素(EC)和表兒茶素沒食子酸酯(ECG)屬于B環(huán)二羥基兒茶素，而表沒食子兒茶素(EGC)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)屬于B環(huán)三羥基兒茶素。類黃酮3′,5′-羥化酶(flavonoid3′,5′-hydroxylase，F(xiàn)3′5′H)是茶樹黃烷-3-醇合成中的重要酶類。F3′5′H屬于CYP75A亞家族，可以分別催化黃酮、黃烷酮、二氫黃酮醇和黃酮醇轉(zhuǎn)化為3′,4′,5′三羥基化產(chǎn)物，是目前已知的細胞色素P450家族中催化B-環(huán)5′羥基化反應(yīng)的唯一酶系。在紅茶發(fā)酵過程中，每個茶黃素分子的形成需要1個二羥基兒茶素和1個三羥基兒茶素，因此含有等濃度的二羥基兒茶素和三羥基兒茶素的鮮葉原料最有利于形成高品質(zhì)紅茶。但專利申請人在2010年和2011年對403份茶樹資源兒茶素組分進行了系統(tǒng)鑒定，發(fā)現(xiàn)與肯尼亞等主產(chǎn)紅茶國家相比，我國不乏高兒茶素資源，但EGCG占兒茶素總量的比例很高，平均為59.3–61.3%（Jinetal.,2014），遠高于肯尼亞（所有品種都在32%以下）（Owuor&Obanda,2007），而二羥基兒茶素ECG和EC含量較低。因此，今后我國茶樹品種的改良，特別是紅茶的品種選育，需要篩選和利用高二羥基兒茶素的茶樹資源，進而培育高品質(zhì)的紅茶品種。迄今為止，國內(nèi)外茶葉兒茶素含量鑒定大都采取生化測定方法。該方法需要一定數(shù)量茶樹葉片，鑒定的植株需要長到3-4年后才能鑒定，耗費時間過長，效率低下。此外，鑒定植株的兒茶素含量受栽培環(huán)境和茶樹樹齡影響很大，需要多年、多點鑒定才能做到精準評價。隨著分子生物學技術(shù)的迅速發(fā)展,分子標記輔助選擇(MAS)被廣泛應(yīng)用于分子育種中，由于其不受環(huán)境和育種世代的影響，可以進行早期選擇和預(yù)測，大大縮短了茶樹育種年限。功能標記是一類基于基因特定序列開發(fā)的標記，與目標基因共分離，大大提高了選擇的準確性。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種篩選高二羥基兒茶素茶樹的類黃酮3′,5′-羥化酶基因功能標記及其應(yīng)用、應(yīng)用方法的技術(shù)方案。所述的一種篩選高二羥基兒茶素茶樹的類黃酮3′,5′-羥化酶基因功能標記，其特征在于該功能標記的上游引物序列如SEQIDNo.1所示，下游引物如SEQIDNo.2所示。所述的一種篩選高二羥基兒茶素茶樹的類黃酮3′,5′-羥化酶基因功能標記在篩選具有高二羥基兒茶素茶樹中的應(yīng)用，其特征在于該功能標記的上游引物序列如SEQIDNo.1所示，下游引物如SEQIDNo.2所示。所述的一種篩選高二羥基兒茶素茶樹的類黃酮3′,5′-羥化酶基因功能標記在篩選具有高二羥基兒茶素茶樹中的應(yīng)用方法，其特征在于包括以下步驟：利用功能標記對各茶樹材料中的F3′5′H基因起始密碼子ATG下游676bp至下游871bp的DNA片段進行PCR擴增、酶切和瓊脂糖凝膠分析，如擴增產(chǎn)物酶切后顯示為196bp的片段則該茶樹確定為低二羥基兒茶素茶樹，如擴增產(chǎn)物酶切后顯示為176bp的片段則該茶樹確定為高二羥基兒茶素茶樹。所述的應(yīng)用方法，其特征在于所述的PCR擴增的體系和反應(yīng)程序為：PCR反應(yīng)體系：32μLddH2O，2μLDNA，5μL10×PCRBuffer，4μL25mMMgCl2，5μL2MmdNTP，1μLKOD-Plus-Neo酶，10μM的上、下游引物各3μL；PCR擴增程序為：94℃2min，然后進行以下循環(huán)，94℃15sec，58℃25sec，68℃5sec，共35個循環(huán)；最后68℃延伸2min；所述的酶切和瓊脂糖凝膠條件為：PCR產(chǎn)物10μL，內(nèi)切酶EcoRI10U，內(nèi)切酶緩沖液2μL，用ddH2O補齊至20μL酶切體系；酶切反應(yīng)時間為1小時，溫度為37℃，擴增產(chǎn)物在3%的瓊脂糖膠電泳分離。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：將本發(fā)明中的功能標記運用于分子標記輔助選擇，能快速篩選出具有高二羥基兒茶素的茶樹植物材料，從而加快優(yōu)質(zhì)紅茶茶樹品種的育成步伐。本發(fā)明對利用分子標記輔助選擇高二羥基兒茶素茶樹品種具有重要的理論意義和經(jīng)濟價值。附圖說明圖1是龍井43和鳳凰大茶樹類黃酮3′,5′-羥化酶基因F3′5′H的比對譜圖；圖1中：LJ43為龍井43，F(xiàn)FDCS為鳳凰大茶樹。圖2是龍井43和鳳凰大茶樹酶切條帶差異的比對譜圖；圖2中：M為Marker；1和2分別為龍井43的DNA用引物對1和2擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶EcoRI酶切前后的條帶，3和4分別為鳳凰大茶樹的DNA用引物對1和2擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶EcoRI酶切前后的條帶。圖3是用功能標記dCAPS-F3′5′H對28份茶樹資源SNP848的基因型檢測結(jié)果；圖3中：M為Marker；1-10依次為福鼎大白茶、藤茶、白石牙茶、銀筍、福安大白茶、寧州厚葉種、江華甜茶、大陽茶、水古茶和木里4號，PCR產(chǎn)物酶切后條帶大小為196bp，SNP848的基因型為AA；11-20依次為樂昌郎田苦茶、乳源柳坑1號、臺山白云茶、英紅1號、五嶺紅、樂昌尖葉白毛、羅定紅芽種、錫茶10號、大葉茶群體和紅河浪堤茶，PCR產(chǎn)物酶切后條帶大小為196bp和176bp，SNP848的基因型為AG；21-28依次為鳳凰大茶樹、師宗5號、鎮(zhèn)沅2號、昌寧4號、景谷老倉群體、麻栗坡8號、云茶普蕊和云縣1號，PCR產(chǎn)物酶切后條帶大小為176bp，SNP848基因型為AG。具體實施方式下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明做進一步詳細的說明。下述實施例中所用的試劑，如無特殊說明，可以從常規(guī)生化試劑商店購買得到。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。實施例1F3′5′H等位基因差異序列的發(fā)現(xiàn)、引物對及功能標記dCAPS-F3′5′H的開發(fā)1.供試材料選擇龍井43和鳳凰大茶樹為研究材料。2.兒茶素含量測定采摘茶樹春季新梢的一芽二葉，采用120℃熱風干燥5min及時固樣，75℃烘至足干低溫保存。待測定時用機械磨碎，過40目篩后低溫保存，備用。稱取0.2g樣品（精確到0.0001g），置于10mL離心管中。加入70℃預(yù)熱的70%甲醇溶液5mL，混勻后70℃水浴。水浴10min，中間揺勻2-3次。3,500r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液。重復(fù)步驟2-4，合并兩次收集的上清液，定容至10mL。移取2ml提取液置于容量瓶中，用穩(wěn)定液（5%的10mg/mLEDTA溶液、5%的10mg/mL抗壞血酸溶液、10%的乙腈）定容至10ml，混勻后用0.45μm的濾膜過濾。采用高壓液相色譜法（HPLC）進行檢測，以外標法對生物堿和兒茶素進行定性和定量分析。液相色譜測定條件：C12色譜柱4.6mm×250mm(4μm，廣州菲羅門)；流動相A為0.5％甲酸，流動相B為乙腈，流速1mL/min，柱溫30℃，檢測波長280nm，進樣量10μL，梯度洗脫：流動相B在16min內(nèi)由6.5％線性梯度變化到16％，第16min到20min由16％線性梯度變化到25％，保持5min，回到初始狀態(tài)，再平衡5min。測定結(jié)果表明，鳳凰大茶樹的三羥基兒茶素含量與龍井43相當，但二羥基兒茶素含量卻是龍井43的2.4倍。表12份茶樹材料春茶兒茶素含量的差異（mg/g）材料名稱EGCECEGCGECG三羥基兒茶素（EGC+EGCG）二羥基兒茶素（EC+ECG）兒茶素總量龍井438.25.469.232.577.437.9115.3鳳凰大茶樹16.322.765.968.382.291.0173.23.基因組DNA的提取取1g新鮮嫩梢，加液氮研磨至粉末狀。將0.2g粉末置入1.5mL離心管，加700μLCTAB提取液，充分混勻后65℃下水浴1h，每20min揺勻一次。加入等體積氯仿/異戊醇（24：1），混勻后靜置2min。室溫下14,000g離心10min，取上清。加入等體積預(yù)冷的異丙醇，-20℃靜置1h。14,000g離心10min，棄上清。加入300μL高鹽溶液，65℃溫育30min至沉淀溶解。室溫下10,000g離心10min，取上清。加入1/10體積預(yù)冷的NaAc（pH5.2），2/3體積預(yù)冷的異丙醇，充分混合，-20℃放置30min。14,000g離心5min，棄上清。70%乙醇洗滌沉淀1次，無水乙醇洗滌一次。放在超凈工作臺上吹干30min，溶于200μL滅菌水中，-20℃保存。4.PCR測序及測序分析設(shè)計特異引物，擴增各茶樹材料中的F3′5′H起始密碼子ATG上游54bp至下游891bp的DNA片段，引物由軟件Primer5.0設(shè)計，序列如下：上游引物（如SEQIDNo.3所示）：5′－ACCAAAACACTCAACCAGGT－3′，下游引物（如SEQIDNo.4所示）：5′－TGCCTTGATGTTGGTCGTGT－3′；PCR反應(yīng)體系：32μLddH2O，2μLDNA，5μL10×PCRBuffer，4μL25mMMgCl2，5μL2MmdNTP，1μLKOD-Plus-Neo酶，10μM的正、反向引物各3μL。PCR擴增程序為：94℃2min，然后進行以下循環(huán)，94℃15sec，5325sec，68℃30sec，共35個循環(huán)；最后68℃延伸7min。PCR擴增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，在紫外燈下觀察并切膠回收，連入載體、轉(zhuǎn)化，菌液PCR篩選陽性克隆測序。分析發(fā)現(xiàn)兩份材料間第一外顯子中有3個單核苷酸突變（SNP），其中僅SNP848為非同義突變（圖1）。5.功能標記dCAPS-F3′5′H的開發(fā)設(shè)計特異引物，擴增各茶樹材料中的F3′5′H基因起始密碼子ATG下游676bp至下游871bp的DNA片段，引物由利用dCAPSFinder2.0（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）設(shè)計。在下游引物3′端引入1bp的錯配，序列如下：上游引物（如SEQIDNo.1所示）：5′－GATTTCATACCATCGATTGCGT－3′，下游引物（如SEQIDNo.2所示）：5′－TGAGCTTCTCTTCACCAGGAATT－3′；利用所述的引物序列分別進行PCR擴增、酶切和瓊脂糖凝膠分析。PCR反應(yīng)體系：32μLddH2O，2μLDNA，5μL10×PCRBuffer，4μL25mMMgCl2，5μL2MmdNTP，1μLKOD-Plus-Neo酶，10μM的正、反向引物各3μL。PCR擴增程序為：94℃2min，然后進行以下循環(huán)，94℃15sec，58℃25sec，68℃5sec，共35個循環(huán)；最后68℃延伸2min。酶切體系、時間、溫度和瓊脂糖凝膠電泳為：PCR產(chǎn)物10μL，內(nèi)切酶EcoRI10U，內(nèi)切酶緩沖液2μL，用ddH2O補齊至20μL；酶切反應(yīng)時間為1小時，溫度為37℃，擴增產(chǎn)物在3%的瓊脂糖膠電泳分離。分析發(fā)現(xiàn)，龍井43的PCR產(chǎn)物酶切后仍條帶大小仍為196bp，表明SNP848的基因型為AA，而鳳凰大茶樹酶切后產(chǎn)生了1條176bp的條帶，表明SNP848的基因型為GG（圖2）。利用該分子標記可以鑒定茶樹資源F3′5′H基因SNP848的基因型，并可把含高二羥基兒茶素的茶樹材料篩選出來。實施例2功能標記dCAPS-F3′5′H對茶樹資源的基因型分析1.供試材料本實驗所研究的材料列于表2中，包括28份茶樹資源。表2本實驗所研究的28份茶樹資源及其二羥基兒茶素含量2.功能標記對不同茶樹資源F3′5′H基因SNP848的基因型檢測利用分子標記dCAPS-F3′5′H對28份材料的標記基因型分析。DNA提取、PCR擴增體系、程序、酶切和瓊脂糖凝膠條件同實施例1。結(jié)果如圖3所示，其中在材料1—10的基因型為AA，材料11—20的基因型為AG，材料21—28的基因型為GG。3.28份茶樹材料兒茶素含量鑒定兒茶素鑒定方法高效液相色譜法同實施例1所述。28份材料中，基因型為AA的10份材料二羥基兒茶素含量為32.6±4.6mg/g，基因型為AG的10份材料二羥基兒茶素含量為42.0±8.9mg/g，基因型為GG的8份材料二羥基兒茶素含量為84.1±22.2mg/g。統(tǒng)計分析表明，GG基因型的材料二羥基兒茶素含量極顯著高于其它2種基因型的材料，dCAPS-F3′5′H可以作為鑒定和篩選高二羥基兒茶素茶樹材料的功能標記。本文中所描述的具體實施例僅僅是對本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。SEQUENCELISTING<110>中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所<120>篩選高二羥基兒茶素茶樹的類黃酮3′,5′-羥化酶基因功能標記及其應(yīng)用、應(yīng)用方法<130>11<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>1gatttcataccatcgattgcgt22<210>2<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>2tgagcttctcttcaccaggaatt23<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>3accaaaacactcaaccaggt20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>4tgccttgatgttggtcgtgt20當前第1頁1 2 3