本發(fā)明所涉及動物病原分子診斷
技術領域：
，特別涉及一種檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光PCR試劑盒及其用途。
背景技術：
：豬瘟是由豬瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus,CSFV)引起的豬的一種高度接觸性、急性傳染病，主要表現(xiàn)為發(fā)病急，高熱稽留，微循環(huán)血管壁變性及其導致的全身泛發(fā)性小點出血，內(nèi)臟器官中多發(fā)性出血、壞死和梗死，具有接觸傳染性和較高的致死率。近年來，我國豬瘟的流行和發(fā)病特點發(fā)生了很大的變化，低毒力豬瘟野毒株或持續(xù)性感染引起的溫和型豬瘟或非典型豬瘟較為常見，其在臨床解剖上的病理特征也不同于典型豬瘟，給獸醫(yī)臨床診斷帶來很大的困擾。豬瘟為一類傳染病，是國家強制免疫的對象之一，因此在強制免疫情況下，豬群豬瘟抗體水平多數(shù)呈陽性，現(xiàn)有血清學檢測無法對野毒株感染與疫苗株免疫產(chǎn)生的抗體進行區(qū)分。此外，在接種豬瘟疫苗后2周或更長時間內(nèi)，在某些組織能檢測到病毒，而疫苗株與野毒株的基因序列高度保守，常規(guī)的分子診斷方法基本無法區(qū)別兩種毒株，對豬瘟的凈化存在較大干擾。目前用于豬瘟病毒的檢測方法有動物接種試驗，病毒分離技術，標記抗體技術，酶聯(lián)免疫吸附試驗和分子生物檢測技術。(1)動物接種試驗中易感豬接種是檢測豬瘟病毒的經(jīng)典方法，但該方法需要較高的生物安全設施，且同時存在試驗動物標準不統(tǒng)一，動物存在個體差異，及潛在的散毒，該方法使用較少。(2)病毒分離采用細胞培養(yǎng)法分離病毒，是試驗室檢測與鑒定豬瘟的標準方法，采集病變典型的可疑組織、血液或臟器，經(jīng)研磨，裂解、差速離心提取病毒，并使用對豬瘟病毒敏感的細胞系如ST，PK-15等細胞進行培養(yǎng)。(3)血清學檢測方法：商用的試劑盒有豬瘟抗體阻斷ELISA方法的檢測，直接免疫熒光抗體法，該方法因其操作簡單，快速，技術可靠，可檢測批量樣品，成本相對較低，很多國家將它作為執(zhí)行豬瘟消滅疾患的法定試驗。但因豬瘟與同屬的牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病病毒存在共同抗原，在基因結(jié)構上同源性達60％以上。在血清學檢測上存在交叉反應現(xiàn)象。(4)分子生物學檢測技術：歐盟使用了豬瘟巢式PCR作為國際標準，我國也建立了豬瘟病毒RT-nPCR檢測方法，豬瘟病毒熒光定量RT-PCR檢測方法和豬瘟病毒熒光定量鑒別RT-PCR檢測方法。但國內(nèi)自主研發(fā)的商用的試劑盒還較少。同時普通PCR檢測方法存在易出現(xiàn)假陽性，操作時間長，套式擴增，技術操作要求技術高等的缺陷。上述豬瘟診斷方法在敏感性、特異性及時效性等方面都存在各自的不足，且這些方法都不能有效地區(qū)分野毒株感染與疫苗接種。實時熒光PCR技術(real-timefluorescencequantitativePCR)是在常規(guī)PCR技術的基礎上發(fā)展起來的一種較新的核酸檢測技術，具備靈敏度高、快速便捷、抗污染能力強、安全系數(shù)好、結(jié)果可視化等優(yōu)點。通過對探針的巧妙設計，可以檢測區(qū)分單個的核苷酸堿基差異，因此能很好的用于不同類型毒株的差異化檢測。在日常豬瘟病原檢測及疾病凈化過程中，需進行活體采樣，對豬群的應激較大，采樣難度也高。發(fā)明人提出了臍帶血檢測技術，臍帶血具有采集方便、安全省時、不影響生產(chǎn)等優(yōu)點，而豬瘟可通過胎盤垂直傳播。盡管臍帶血含毒量相對于組織而言要低，但在實際應用中也對組織及對應臍帶血進行了相互印證，確保本發(fā)明方法的特異性及敏感性。結(jié)合臍帶血的檢測，既可做到鑒別診斷，又可避免應激，同時可進行豬群早期預警評判。因此，研制一種通過臍帶血檢測鑒別豬瘟病毒野毒株與疫苗株的熒光RT-PCR方法很有必要。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提出一種檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR試劑盒，該試劑盒具有靈敏度高、特異性好、重復性優(yōu)、檢測結(jié)果快速客觀準確等優(yōu)點，且能夠有效鑒別豬瘟病毒野毒株與疫苗株，同時具有操作簡便、無應激，直觀、特異、快速和高精準的效果，能同時反映母、仔豬豬瘟病毒帶毒和排毒狀況，評估母豬豬瘟疫苗的免疫效果，側(cè)面反映母豬的健康狀況水平，有益于對群體豬瘟病毒感染的凈化和免疫情況的早期預警評判，進一步有助于豬場做好該疾病的預警、防控工作?；谏鲜瞿康模景l(fā)明提供的一種檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括擴增引物和特異性熒光探針，所述擴增引物和特異性熒光探針的序列如下所示：上游擴增引物CSFV-F：5’-GCCATGCCCATAGTAGGA-3’，其為SEQIDNO:1序列；下游擴增引物CSFV-R：5’-CTACTGACGACTGYCCTGTA-3’，其為SEQIDNO:2序列，其中Y＝C/T；特異性熒光探針CSFV-LV：VIC-5’-TGGCTAGTCCCTCCGTTTTGC-3’-BHQ1，其為SEQIDNO:3序列，其中VIC為熒光報告基團，BHQ1為非熒光淬滅基團；特異性熒光探針CSFV-Wt：FAM-5’-ACGGCTAGTCCCTCCGTTTG-3’-BHQ1，其為SEQIDNO:4序列，其中FAM為熒光報告基團，BHQ1為非熒光淬滅基團。合理的引物和熒光探針設計是成功應用實時熒光PCR技術的關鍵。引物和探針的特異性對反應有很大影響，如果引物和探針特異性不高，可能在擴增構成中產(chǎn)生非靶標條帶，影響檢測結(jié)果的判定。本發(fā)明對GenBank中公布的CSFV(包括野毒株和弱毒疫苗株)和其它病毒(包括牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病病毒)基因序列進行對比分析，在高度保守的5’-UTR非編碼區(qū)上設計了針對CSFV的通用上下游擴增引物CSFV-F和CSFV-R，并且下游擴增引物CSFV-R中含有兼并堿基Y，使擴增的范圍更廣泛。同時利用CSFV野毒株與豬瘟兔化弱毒疫苗株基因組5’-UTR中2個堿基的差異，設計了不同熒光基團標記的CSFV野毒株(Shimen株)特異性熒光探針CSFV-Wt和豬瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV株)特異性熒光探針CSFV-LV，特異性熒光探針CSFV-Wt與Shimen株RNA特異性結(jié)合，擴增反應顯藍色熒光(FAM通道)，與HCLV株RNA無結(jié)合，擴增反應無綠色熒光顯示(VIC通道)；特異性熒光探針CSFV-LV與Shimen株RNA無結(jié)合，擴增反應無藍色熒光顯示(FAM通道)，與HCLV株RNA特異性結(jié)合，擴增反應顯綠色熒光顯示(VIC通道)。表明兩條探針特異性良好，能鑒別豬瘟病毒野毒株與疫苗株。本發(fā)明引物和探針設計在豬瘟病毒基因組5’-UTR非編碼區(qū)上，該組引物和探針的特異性強，一方面能夠解決豬瘟病毒與同屬的牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病病毒存在基因交叉的問題，另一方面能同時區(qū)分豬瘟病毒野毒株與疫苗株，檢測更加特異性。采用從仔豬臍帶血中檢測CSFV基因組5’-UTR來評價母豬豬瘟病毒帶毒和排毒狀況，仔豬在母體內(nèi)感染狀況和反饋母豬的健康狀況，是一種更加科學、直接和有效的診斷豬瘟疾病、評估豬瘟疫苗保護力水平和疾病預警方面的方法之一，在規(guī)?；i場的豬瘟病的凈化過程中起到更加可靠的技術支撐。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴增引物CSFV-F、所述下游擴增引物CSFV-R、所述特異性熒光探針CSFV-LV和所述特異性熒光探針CSFV-Wt的摩爾比為2:2:1:1。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴增引物CSFV-F、所述下游擴增引物CSFV-R、所述特異性熒光探針CSFV-LV和所述特異性熒光探針CSFV-Wt在所述試劑盒中的終濃度均為0.2～0.8μM。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性對照、陽性對照、2×熒光RT-PCR反應液；所述2×熒光RT-PCR反應液中含有UNG酶系統(tǒng)。在PCR反應體系中加入2×熒光RT-PCR反應液，其包括UNG酶系統(tǒng)，在擴增環(huán)節(jié)可以有效解決擴增污染現(xiàn)象，抗污染能力強等。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述陰性對照為無DNA酶的ddH2O；所述陽性對照為克隆有豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段和兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段的克隆質(zhì)粒pEASY-5UTR2，克隆質(zhì)粒pEASY-5UTR2的終濃度為1.0×105copies/μl～1.0×107copies/μl。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段和所述豬瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段的核苷酸序列分別如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTRGCCATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGGAGGGACTAGCCGTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAG(SEQIDNO:5)；兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段序列為：GCCATGCCCATAGTAGGACTAGCAAAACGGAGGGACTAGCCATAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAG(SEQIDNO:6)。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述克隆質(zhì)粒pEASY-5UTR2采用以下方法制備得到：利用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物分別擴增豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段和兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段，通過TA克隆將豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段和兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段克隆至pEASY-T1載體，篩選陽性克隆，測序正確的克隆質(zhì)粒命名為pEASY-5UTR2。進一步的，本發(fā)明還提供了所述的檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR試劑盒的使用方法，包括以下步驟：(1)使用所述的雙重實時熒光RT-PCR試劑盒進行擴增時，反應體系以20μL計為：10μMSEQIDNO:1所示的上游擴增引物：0.4～0.8μL；10μMSEQIDNO:2所示的下游擴增引物：0.4～0.8μL；10μMSEQIDNO:3所示的特異性熒光探針CSFV-LV：0.2～0.4μL；10μMSEQIDNO:3所示的特異性熒光探針CSFV-Wt：0.2～0.4μL；2×熒光RT-PCR反應液：10μL；RNA模板：2μL；ddH2O：補足至20μL；(2)熒光PCR反應條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄20min；95℃預變性1min；95℃變性10Sec，60℃退火45Sec并收集熒光，共40個循環(huán)；最后25℃冷卻10sec，結(jié)束反應；(3)結(jié)果分析：質(zhì)量控制：陰性對照FAM通道檢測無Ct值，VIC通道檢測無Ct值；陽性對照FAM通道檢測Ct值≤30，VIC通道檢測Ct值≤30；上述條件同時滿足，檢測結(jié)果有效；結(jié)果判定：FAM通道檢測Ct值≤40，VIC通道檢測無Ct值，則判定樣品為豬瘟病毒野毒株感染陽性；FAM通道檢測無Ct值，VIC通道檢測≤40，則判定樣品為豬瘟病毒疫苗株陽性；FAM通道檢測Ct值≤40，VIC通道檢測≤40，則判定樣品同時含有豬瘟病毒野毒株和疫苗株；FAM通道檢測無Ct值，VIC通道檢測無Ct值，則判定樣品為豬瘟病毒感染陰性。在本發(fā)明中，為了使檢測野毒株和疫苗株特異性探針與模板發(fā)生錯配的效率最低，對退火溫度、引物濃度和兩條探針的濃度進行了優(yōu)化，尤其是兩條探針的濃度，探針濃度過低會引起特異性的熒光信號變?nèi)?，而濃度過高則會引起兩條探針與模板發(fā)生非特異性結(jié)合，產(chǎn)生非特異性熒光信號從而干擾特異性熒光信號。本發(fā)明經(jīng)過一系列優(yōu)化試驗，最終確定本發(fā)明的熒光PCR反應體系和反應條件，采用本發(fā)明的雙重實時熒光RT-PCR方法檢測豬瘟病毒野毒株與疫苗株的擴增效率均達到90％以上，并且發(fā)生錯配的效率最低。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述RNA模板采用以下方法制備得到：(1)取100-200μL豬臍帶血置1.5mLEP管中，加入1mL裂解液充分混勻，室溫靜置5min；所述裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS0.1-0.2％；③吐溫201-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP401-2％；(2)加入0.6mL異丙醇和10μL磁珠，振蕩15s，靜置2min；(3)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(4)加入0.5mL異丙醇，將EP管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min；(5)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(6)加入1mL質(zhì)量百分比為70％的乙醇溶液，輕輕洗滌沉淀；將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(7)晾干，加入適量的DEPCH2O溶解，56℃促溶10-15min；(8)快速電泳檢測RNA完整性。本發(fā)明在核酸提取環(huán)節(jié)中，使用鹽酸胍、SDS、吐溫20，NP40，異丙醇和質(zhì)量百分比為70％的乙醇溶液等洗滌，可以有效降低去除溶血的干擾，獲得高質(zhì)量的核酸。更進一步的，本發(fā)明還提供了所述的試劑盒在制備檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR試劑中的用途。本發(fā)明在豬瘟病毒基因組5’-UTR非編碼區(qū)上設計通用引物和兩條不同熒光基團標記的特異性探針，通過對退火溫度、引物濃度以及兩條特異性探針濃度等進行優(yōu)化，建立了檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR方法。靈敏度試驗結(jié)果表明，該方法的檢測范圍為108-101copies/μL，可以檢測到最低10copies的病毒含量的樣品。特異性試驗結(jié)果表明，該方法對牛病毒性腹瀉病毒、豬圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征變異株和經(jīng)典株、Shimen、HCLV感染的細胞培養(yǎng)物及正常細胞均無非特異性反應，說明該方法特異性和可靠性強。準確性試驗結(jié)果表明，對于陽性對照與陰性對照的檢測，該方法與RT-PCR方法檢測結(jié)果100％符合；對于臨床樣品的檢測，該方法檢測陽性5/36，RT-PCR方法檢測陽性3/36，且后者檢測的3份樣品使用該方法檢測均為陽性，說明該方法比RT-PCR方法更敏感，準確性高。重復性試驗結(jié)果表明，該方法對不同核酸濃度的陽性對照檢測變異系數(shù)(CV)均小于1％，具有較好的重復性。本發(fā)明應用雙重實時熒光RT-PCR檢測鑒別豬瘟病毒野毒株和疫苗株的工作原理：由于豬屬于上皮絨毛胎盤，母豬和胎兒獨立血液循環(huán)系統(tǒng)之間存在血胎盤屏障的緣故，正常的“臍帶血”是不含病原體和抗體物質(zhì)的，即不存在任何病原的相關基因片段，因此，可通過檢測“臍帶血”中是否存在豬瘟病毒核酸來判斷帶毒不發(fā)病母豬的情況，預警仔豬感染豬瘟病毒的風險，進而評價母豬的免疫水平及帶毒情況等，同時設計分別針對野毒株與疫苗株的探針進一步準確區(qū)分是否為野毒株感染。具體步驟為：(1)樣品采集；(2)樣品處理；(3)RNA提??；(4)雙重實時熒光RT-PCR：利用本發(fā)明設計的特異性引物和探針進行；(5)判定結(jié)果。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的試劑盒具有以下有益效果：(1)本發(fā)明的檢測方法克服了常規(guī)檢測技術耗時長、敏感度低、安全系數(shù)低、抗污染能力差和不能準確定量等問題，檢測快速高效，不會造成樣品交叉污染。(2)本發(fā)明的檢測方法準確度高，靈敏度高，特異性強，重復性優(yōu)，可以實現(xiàn)大通量樣品的檢測。(3)本發(fā)明的檢測方法不僅適用于檢測臍帶血檢測，還適用于待檢豬的脾臟、淋巴結(jié)、血清及血漿等樣品，可用于任何實驗室和基層各級防控單位、獸醫(yī)站及大中小型養(yǎng)殖場等。(4)在日常豬瘟檢測及疾病凈化過程中，需進行活體采樣，對豬群的應激較大，難度也高，而臍帶血避免了這些問題，臍帶血雖然含毒量相對于組織而言要低，在實際應用中也對組織及對應臍帶血進行了相互印證，確保本發(fā)明檢測方法的特異性及敏感性。(5)本發(fā)明充分運用PCR技術的高效擴增性、核酸雜交技術的良好特異性和熒光檢測技術的快速敏感性，對同一個樣品進行一次檢測操作即可完成豬瘟病毒野毒株和疫苗株的鑒別檢測，可以確定樣品是豬瘟病毒野毒株感染，或者是豬瘟病毒疫苗株感染，或者是兩者共同感染；而且能夠解決豬瘟病毒與同屬的牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病病毒存在基因交叉的問題。附圖說明圖1為本發(fā)明陽性對照10倍稀釋的梯度擴增標準曲線圖(FAM通道)；圖2為本發(fā)明陽性對照10倍稀釋的梯度擴增標準曲線圖(VIC通道)；圖3為本發(fā)明熒光RT-PCR檢測不同濃度的豬瘟病毒野毒株結(jié)果圖；圖4為本發(fā)明熒光RT-PCR檢測不同濃度的豬瘟病毒疫苗株結(jié)果圖；圖5為本發(fā)明豬瘟病毒野毒株敏感性檢測結(jié)果圖；圖6為本發(fā)明豬瘟病毒疫苗株敏感性檢測結(jié)果圖；圖7為本發(fā)明試劑盒特異性檢測結(jié)果圖(FAM通道)；圖8為本發(fā)明試劑盒特異性檢測結(jié)果圖(VIC通道)；圖9為本發(fā)明試劑盒重復性檢測結(jié)果圖。具體實施方式實施例1檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR試劑盒的組成(1)2×熒光RT-PCR反應液(含酶)：原料購自南京諾唯贊(VAZYME)公司；該反應液中含有UNG酶系統(tǒng)，在擴增環(huán)節(jié)可以有效解決擴增污染現(xiàn)象，抗污染能力強等；(2)RT-PCR引物組CSFV-F和CSFV-R：由上海生工生物工程公司合成，用DEPC水配制成濃度為10μM。上游擴增引物CSFV-F：5’-GCCATGCCCATAGTAGGA-3’，其為SEQIDNO:1序列；下游擴增引物CSFV-R：5’-CTACTGACGACTGYCCTGTA-3’，其為SEQIDNO:2序列，其中Y＝C/T；(3)特異性熒光探針CSFV-LV與CSFV-Wt：由華大基因公司合成，用DEPC水配制成濃度為10μM。特異性熒光探針CSFV-LV：VIC-5’-TGGCTAGTCCCTCCGTTTTGC-3’-BHQ1，其為SEQIDNO:3序列，其中VIC為熒光報告基團，BHQ1為非熒光淬滅基團；特異性熒光探針CSFV-Wt：FAM-5’-ACGGCTAGTCCCTCCGTTTG-3’-BHQ1，其為SEQIDNO:4序列，其中FAM為熒光報告基團，BHQ1為非熒光淬滅基團；本發(fā)明對GenBank中公布的CSFV(包括野毒株和弱毒疫苗株)和其它病毒(包括牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病病毒)基因序列進行對比分析，在高度保守的5’-UTR非編碼區(qū)上設計了針對CSFV的通用上下游擴增引物CSFV-F和CSFV-R，并且下游擴增引物CSFV-R中含有兼并堿基Y，使擴增的范圍更廣泛。同時利用CSFV野毒株與豬瘟兔化弱毒疫苗株基因組5’-UTR中2個堿基的差異，設計了不同熒光基團標記的CSFV野毒株(Shimen株)特異性熒光探針CSFV-Wt和豬瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV株)特異性熒光探針CSFV-LV，特異性熒光探針CSFV-Wt與Shimen株RNA特異性結(jié)合，擴增反應顯藍色熒光(FAM通道)，與HCLV株RNA無結(jié)合，擴增反應無綠色熒光顯示(VIC通道)；特異性熒光探針CSFV-LV與Shimen株RNA無結(jié)合，擴增反應無藍色熒光顯示(FAM通道)，與HCLV株RNA特異性結(jié)合，擴增反應顯綠色熒光顯示(VIC通道)。表明兩條探針特異性良好，能區(qū)分豬瘟病毒野毒株與疫苗株。(4)陽性對照為克隆有豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段和兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段的重組質(zhì)粒pEASY-5UTR2，由本實驗室構建，質(zhì)粒在紫外分光光度計OD260nm測定質(zhì)量濃度，按公式6.02×1023×(Xng/μL×10-9)/DNAlength×660換算為拷貝數(shù)，配制濃度為1.0×105copies/μL～1.0×107copies/μL；其中，克隆質(zhì)粒pEASY-5UTR2的構建方法如下：①按照商業(yè)試劑盒操作說明書提取豬瘟病毒野毒株(Shimen)RNA和兔化弱毒疫苗株(HCLV)RNA；以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2作為特異性引物擴增豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段序列和豬瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段序列，反應條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄20min；95℃預變性1min；95℃變性10Sec，60℃退火45Sec，72℃延伸30s，共40個循環(huán)；72℃再延伸10min，4℃保溫5min。PCR產(chǎn)物于2％的瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定；②PCR產(chǎn)物的純化、克隆及序列分析：PCR產(chǎn)物用AXYGEN公司的AxyPrepDNAGelExcractionKit膠回收試劑盒回收，通過TA克隆將豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段序列和豬瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段序列克隆至pEASY-T1載體，然后轉(zhuǎn)化Trans1-T1PhageResistant化學感受態(tài)細胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12h-18h。經(jīng)藍白斑篩選后，用OMEGA公司的PlasmidMiniKit1質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，然后用引物進行擴增和測序，測序后比對成功的克隆質(zhì)粒命名pEASY-5UTR2。其中：豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段序列為：GCCATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGGAGGGACTAGCCGTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAG(SEQIDNO:5)；兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段序列為：GCCATGCCCATAGTAGGACTAGCAAAACGGAGGGACTAGCCATAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAG(SEQIDNO:6)。(5)陰性對照為無DNAase的ddH2O；(6)使用說明書。實施例2檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR試劑盒的使用方法本發(fā)明試劑盒使用方法具體包括以下步驟：(1)樣品采集；(2)樣品處理；(3)RNA提??；(4)雙重實時熒光RT-PCR：利用本發(fā)明設計的特異性引物和探針進行雙重實時熒光RT-PCR檢測；(5)判定結(jié)果。(1)樣品采集1.取干凈的青霉素瓶和瓶塞，清洗干凈，煮沸滅菌30分鐘，烘干后收集備用；2.當仔豬出生時，將每頭母豬分娩的所有仔豬的“臍帶血”都擠到一個干凈的青霉素瓶中，每頭仔豬3-5滴即可，將其“臍帶血”擠到青霉素瓶，密封；注意事項：①必須要采集同窩母豬產(chǎn)的所有的仔豬，避免同窩母豬所產(chǎn)仔豬的個體差異造成漏檢；②可以雙人操作，也可以單獨操作，若仔豬臍帶血不便擠出，可以將臍帶剪成幾段再操作即可；③若母豬分娩出現(xiàn)木乃伊，死胎時，同窩仔豬臍帶血重點檢測；④弱仔的臍帶血可以另外單獨再收集一份，重點檢測；3.臍帶血收集完后蓋好瓶塞，用標簽紙或者醫(yī)用白膠布在青霉素瓶做好標記，注明采集時間、母豬耳號、胎次等信息；4.將收集的臍帶血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷凍保存，送至實驗室檢測，并附上采集臍帶血樣品的數(shù)量、母豬耳號、需要檢測項目的清單。(2)樣品中模板RNA提取1.取50-100mg豬臍帶血置1.5ml勻漿器中，加入1ml裂解液充分勻漿，室溫靜置5min；裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS，其在裂解液中的質(zhì)量分數(shù)為0.1-0.2％；③吐溫20，其在裂解液中的質(zhì)量分數(shù)為1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的質(zhì)量分數(shù)為1-2％；2.加入0.6ml異丙醇和10μL磁珠(購自賽默飛公司)，振蕩15s，靜置2min；3.將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；4.加入0.5ml異丙醇，將EP管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min；5.將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；6.加入1ml質(zhì)量百分比為70％的乙醇溶液，輕輕洗滌沉淀；將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；7.晾干，加入適量的DEPCH2O溶解(56℃促溶10～15min)；8.快速電泳檢測RNA完整性。本發(fā)明在RNA提取環(huán)節(jié)中，使用鹽酸胍、SDS、吐溫20，NP40，異丙醇和質(zhì)量百分比為70％的乙醇溶液等洗滌，可以有效降低去除溶血的干擾，獲得高質(zhì)量的核酸。依據(jù)上述方法提取6份隨機臍帶血樣品總RNA，經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測，濃度均能達到0.132μg/μl以上，A260/A280比值均在1.9-2.0之間，表明RNA純度高、完整性好，具體數(shù)據(jù)見表1。表1RNA質(zhì)量檢測結(jié)果樣品編號體積(μl)濃度(μg/μl)總量(μg)A260/A280質(zhì)量評價001500.24812.41.93合格002500.23912.01.95合格003500.1628.11.90合格004500.25212.61.94合格005500.1326.61.91合格006500.1638.21.95合格(3)實時熒光RT-PCR為了使檢測野毒株和疫苗株特異性探針與模板發(fā)生錯配的效率最低，對雙重實時熒光PCR反應體系和反應條件進行優(yōu)化。經(jīng)過優(yōu)化，實時熒光PCR反應體系和反應條件如下所示：實時熒光RT-PCR反應體系：SEQIDNO:1所示的上游擴增引物CSFV-F(10μM)：0.4～0.8μL；SEQIDNO:2所示的下游擴增引物CSFV-R(10μM)：0.4～0.8μL；SEQIDNO:3所示的特異性熒光探針CSFV-LV：(10μM)：0.2～0.4μL；SEQIDNO:4所示的特異性熒光探針CSFV-Wt(10μM)：0.2～0.4μL；2×熒光RT-PCR反應液(含酶)：10μL；RNA模板：2μL；ddH2O：補足至20μL。熒光PCR的反應條件為：RT-PCR反應條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄20min；95℃預變性1min；循環(huán)步驟95℃變性10Sec，60℃退火45Sec并收集熒光，共40個循環(huán)；最后25℃冷卻10sec，結(jié)束反應；同時設有陰性對照和陽性對照，陰性對照和陽性對照的加入量均為2μL(4)判定結(jié)果質(zhì)量控制：陰性對照FAM通道檢測無Ct值，VIC通道檢測無Ct值；陽性對照FAM通道檢測Ct值≤30，VIC通道檢測Ct值≤30；上述條件同時滿足，檢測結(jié)果有效；結(jié)果判定：FAM通道檢測Ct值≤40，VIC通道檢測無Ct值，則判定樣品為豬瘟病毒野毒株感染陽性；FAM通道檢測無Ct值，VIC通道檢測≤40，則判定樣品為豬瘟病毒疫苗株陽性；FAM通道檢測Ct值≤40，VIC通道檢測≤40，則判定樣品同時含有豬瘟病毒野毒株和疫苗株；FAM通道檢測無Ct值，VIC通道檢測無Ct值，則判定樣品為豬瘟病毒感染陰性。實施例3檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR試劑盒的驗證1.擴增效率驗證對陽性對照克隆質(zhì)粒pEASY-5UTR2進行10倍梯度稀釋，使其拷貝數(shù)為：108-101copies/μl，每個梯度重復三次進行實時熒光RT-PCR，根據(jù)擴增結(jié)果制作標準曲線。圖1為本發(fā)明陽性對照10倍稀釋的梯度擴增標準曲線(FAM通道)，其中該標準曲線的參數(shù)如下：斜率：-3.56，截距：39.78，相關系數(shù)：0.998，擴增效率：0.91。圖2為發(fā)明陽性對照10倍稀釋的梯度擴增標準曲線(VIC通道)，其中該標準曲線的參數(shù)如下：斜率：-3.45，截距：40.40，相關系數(shù)：0.996，擴增效率：0.95。綜上，說明該試劑盒檢測豬瘟病毒野毒株與疫苗株的擴增效率均達到90％以上。2.雙重熒光RT-PCR特異性驗證分別取濃度為107、106、105copies/μL豬瘟病毒野毒株(Shimen株)RNA或豬瘟病毒疫苗株(HCLV株)RNA作為模板，分別加入同時含有特異性熒光探針CSFV-LV與CSFV-Wt的RT-PCR反應體系中，進行實時熒光RT-PCR擴增，驗證兩條探針與對應模板的特異性匹配度。結(jié)果如下，特異性熒光探針CSFV-Wt與Shimen株RNA特異性結(jié)合，擴增反應顯藍色熒光(FAM通道)，與HCLV株RNA無結(jié)合，擴增反應無綠色熒光顯示(VIC通道)，如圖3所示；特異性熒光探針CSFV-LV與Shimen株RNA無結(jié)合，擴增反應無藍色熒光顯示(FAM通道)，與HCLV株RNA特異性結(jié)合，擴增反應顯綠色熒光顯示(VIC通道)，如圖4所示。表明兩條探針特異性良好，能鑒別豬瘟病毒野毒株與疫苗株。3.靈敏度試驗以10倍梯度稀釋的陽性對照克隆質(zhì)粒pEASY-5UTR2作為模板，進行本發(fā)明試劑盒的靈敏度檢測，檢測范圍為108-101copies/μL。結(jié)果表明，該方法的檢測范圍為108-101copies/μL，在此范圍的病毒含量可以得到可靠的結(jié)果，即該方法的靈敏度可以檢測到最低10copies的病毒含量的樣品。檢測結(jié)果見圖5和圖6。4.特異性研究為了檢測本發(fā)明試劑盒的特異性，利用本發(fā)明的試劑盒檢測牛病毒性腹瀉病毒、豬圓環(huán)病毒，豬偽狂犬病毒，豬傳染性胃腸炎病毒，豬流行性腹瀉病毒，豬繁殖與呼吸綜合征變異株和經(jīng)典株，Shimen、HCLV感染的細胞培養(yǎng)物及正常細胞對照等。檢測結(jié)果表明：本發(fā)明的試劑盒僅對豬瘟病毒野毒株和疫苗株進行擴增，不與其它核酸發(fā)生交叉反應，見圖7和圖8。5.準確性研究同時采用本發(fā)明的試劑盒以及普通RT-PCR對36份臍帶血樣品進行檢測以及5份健康的臍帶血樣品進行了檢測，結(jié)果見表2。表2采用本發(fā)明試劑盒以及普通RT-PCR對臨床樣品進行檢測結(jié)果的比較從表2中可以看出：本試劑盒雙重實時熒光RT-PCR方法檢測陽性樣品與普通RT-PCR方法檢測陽性樣品的結(jié)果100％符合；對于臨床樣品的檢測，本試劑盒雙重實時熒光RT-PCR方法檢測陽性5/36，通RT-PCR方法檢測陽性3/36，且后者檢測的3份樣品使用前者檢測均為陽性，本發(fā)明試劑盒雙重實時熒光RT-PCR檢測比普通RT-PCR檢測更敏感，且臨床癥狀表現(xiàn)是一致的。6.重復性研究選用陽性對照pEASY-5UTR2克隆質(zhì)粒106、105、104copies/μL，對每個濃度的樣本做3個重復，結(jié)果不同核酸濃度的檢測變異系數(shù)(CV)均小于1％，具有較好的重復性。檢測結(jié)果見表3和圖9。表3熒光定量PCR檢測豬瘟病毒野毒株和疫苗株的重復性試驗綜上可見，本發(fā)明設計的一對特異性引物和兩條特異性熒光探針以及構成的試劑盒可以快速檢測鑒別豬臍帶血中的豬瘟病毒野毒株與疫苗株，而且該檢測方法簡單、快速、特異性好、靈敏度高、可重復性好，檢測結(jié)果真實可靠。所屬領域的普通技術人員應當理解：以上任何實施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開的范圍(包括權利要求)被限于這些例子；在本發(fā)明的思路下，以上實施例或者不同實施例中的技術特征之間也可以進行組合，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡明它們沒有在細節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。。序列表<110>湖南新南方養(yǎng)殖服務有限公司<120>一種檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR試劑盒及其用途<130>FI160636-ND<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1gccatgcccatagtagga18<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2ctactgacgactgycctgta20<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3tggctagtccctccgttttgc21<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4acggctagtccctccgtttg20<210>5<211>96<212>DNA<213>Shimen5’-UTR基因序列<400>5gccatgcccatagtaggactagcaaacggagggactagccgtagtggcgagctccctggg60tggtctaagtcctgagtacaggacagtcgtcagtag96<210>6<211>97<212>DNA<213>HCLV5’-UTR基因序列<400>6gccatgcccatagtaggactagcaaaacggagggactagccatagtggcgagctccctgg60gtggtctaagtcctgagtacaggacagtcgtcagtag97當前第1頁1 2 3